周翠蘭, 陳婕, 許云思, 付乙人, 彭翠英

南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖學(xué)與生殖醫(yī)學(xué)研究所, 2.生態(tài)健康與人類重要疾病防控湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,3.生物毒理與生態(tài)修復(fù)衡陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 4.有色金屬礦區(qū)耕地重金屬污染生態(tài)阻抗技術(shù)研究所衡陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南衡陽(yáng) 421001

KRAS基因突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),據(jù)COSMIC體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù),絕大多數(shù)的KRAS基因突變?yōu)辄c(diǎn)突變,較常見的為第12位、第13位密碼子突變,其野生型序列為TGGTGG,其中第12位突變具有較高的發(fā)病頻率,最常見的突變類型為TGATGG與TGGTGA[1-2]。藍(lán)白斑篩選原理為,外源性DNA片段與含lacZ的載體連接,插入到其多克隆位點(diǎn),破壞lacZ的閱讀框架,導(dǎo)入宿主為缺陷菌株,致β-半乳糖苷酶基因斷裂而不能產(chǎn)生分解培養(yǎng)基中的X-gal的β-半乳糖苷酶,所以克隆顏色呈白色[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),含終止密碼子的外源性DNA片段(長(zhǎng)度為3的倍數(shù))插入到含lacZ的載體中,克隆顏色呈白色;不含終止密碼子的外源性核苷酸片段(長(zhǎng)度為3的倍數(shù))插入到含lacZ的載體中,呈藍(lán)色克隆[4]。

本課題組利用藍(lán)白斑篩選技術(shù)已完成了KRAS基因第12位密碼子突變檢測(cè),可檢測(cè)出千分之一的稀有突變[5],但不能滿足腫瘤早期臨床診斷的需要。為降低突變檢測(cè)的下限,本研究采用限制性內(nèi)切酶酶切后去磷酸化聯(lián)合藍(lán)白斑篩選對(duì)KRAS基因第12位密碼子突變進(jìn)行檢測(cè),為臨床腫瘤早期篩查提供理論與技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

PCR儀(A200型)購(gòu)自中國(guó)杭州朗基公司,E Coli.DH5α菌株、100 bp DNA Ladder、PMD-19T購(gòu)自中國(guó)北京天根公司。dNTP、BstNI、EcoRI、KpnI、T4連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連TaKaLa公司。MixTaq與DNA Polymerase購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。IPTG、X-gal、Amp、Tris-base試劑購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)沙宏宇生物公司。人工模板KRAS基因第12位密碼子突變型(mutant type,MUT)與野生型(wild type,WT)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,插入長(zhǎng)度為102 bp(3的倍數(shù))的核苷酸片段,第12位密碼子MUT 12質(zhì)粒其TGG突變成TGA。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)COSMIC體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)顯示的KRAS基因第12位密碼子熱點(diǎn)突變,NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)顯示的KRAS基因序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,設(shè)計(jì)引物主要考慮成功引入酶切位點(diǎn),將引入突變的堿基置于引物的3′末端。設(shè)計(jì)一對(duì)引物:FS(正向引物)、AS(反向引物)。FS中3′的C堿基為引入BstNI酶切序列的C堿基。FS與AS擴(kuò)增得到的產(chǎn)物雙酶切后用于亞克隆,雙酶切后獲得的插入片段長(zhǎng)度為102 bp,插入片段的長(zhǎng)度為3的倍數(shù)。AS的序列為5′-CTACGGAATTCTTGGACCATATTCGTCCACA-3′,FS的序列為5′-ATACGAGGGTACCTGACTGCATACAAACTTGTGGTAGTTGGAC-3′,引物序列由蘇州金唯智公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)

測(cè)定第12位密碼子MUT與WT質(zhì)粒光密度(optical density,OD)值。依據(jù)OD值將MUT/WT 12按0∶1、1∶3 000、1∶10 000、1∶30 000的比例混合以模擬人體循環(huán)血液中游離DNA作為實(shí)驗(yàn)組模板,將MUT/WT 12質(zhì)粒按0∶1、1∶300、1∶1 000、1∶3 000的比例混合作為對(duì)照組模板,WT質(zhì)粒終質(zhì)量濃度為0.02 μg/L[6]。以混合的人工模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為50 μL,5 μL 10×Tag buffer,0.4 mmol/L dNTP,引物FS、AS各20 mmol/L,Tag酶0.25 U,模板40 ng。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 22 s,退火58 ℃ 22 s,延伸72 ℃ 22 s,38個(gè)循環(huán);終延伸72 ℃ 8 min。

1.4 限制性內(nèi)切酶酶切

PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收引入酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物,反應(yīng)體系150 μL,PCR產(chǎn)物2 μg,12 μL 10×Cut Smart Buffer,5 μL BstNI,85 ℃反應(yīng)2 h。PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。野生型片段含酶切位點(diǎn),被酶切成兩個(gè)小片段,去磷酸化使5′端去磷酸根,與線性化載體的連接被阻斷。突變型片段不含酶切位點(diǎn),不能被酶切,去磷酸化處理不影響突變型片段與線性化載體的連接。因此,酶切后PCR產(chǎn)物去磷酸化。

1.5 酶切產(chǎn)物去磷酸化

純化回收PCR酶切產(chǎn)物,反應(yīng)體系60 μL,6 μL 10×堿性磷酸酶緩沖液,3 μL堿性磷酸酶,37 ℃ 1 h,80 ℃ 20 min以滅活堿性磷酸酶。PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收去磷酸化產(chǎn)物。EcoRI與KpnI雙酶切PMD-19T載體與PCR產(chǎn)物,純化回收線性化載體與PCR酶切產(chǎn)物。紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值。

1.6 藍(lán)白斑篩選檢測(cè)稀有突變及藍(lán)白斑菌落計(jì)數(shù)

測(cè)定PCR酶切產(chǎn)物的OD值,PCR酶切產(chǎn)物與載體連接。將連接后的產(chǎn)物導(dǎo)入E Coli.DH5α菌株。培養(yǎng)物涂抹于含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上,瓊脂平板置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱,37 ℃培養(yǎng)16 h。將培養(yǎng)皿平分為4個(gè)部分,肉眼計(jì)數(shù)1個(gè)部分的白色克隆與藍(lán)色克隆,將所得計(jì)數(shù)的克隆數(shù)乘以4既為培養(yǎng)皿上的白色克隆或藍(lán)色克隆的個(gè)數(shù)。

1.7 菌液PCR酶切鑒定插入片段

在突變與野生為1∶30 000瓊脂培養(yǎng)皿上挑取5個(gè)白色克隆,進(jìn)行菌液PCR酶切鑒定。引物AS與FS進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增以引入酶切位點(diǎn),BstNI酶切,酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,將酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆一代測(cè)序,驗(yàn)證其插入片段的序列。

1.8 肺癌患者游離DNA驗(yàn)證

于南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院采集26例肺癌患者外周血8 mL,血液置于EDTA抗凝管中。參照凱杰游離DNA提取試劑盒提取血中游離DNA[7]。利用限制性內(nèi)切酶酶切聯(lián)合去磷酸化與藍(lán)白斑技術(shù)對(duì)26例肺癌患者游離DNA進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒引入酶切位點(diǎn)

BstNI酶切PCR產(chǎn)物,其電泳圖見圖1。野生型片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含CCWGG(W為A、C、T、G中任何一個(gè)堿基),為BstNI的酶切位點(diǎn);突變型片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含CCWGG,不含酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物送金唯智公司測(cè)序,其序列圖見圖2。

圖1 質(zhì)粒引入酶切位點(diǎn)酶切電泳圖M為100 bp的Marker;1為PCR產(chǎn)物未酶切;2～5為MUT/WT 12分別為0∶1、1∶3 000、1∶10 000、1∶30 000酶切產(chǎn)物。

圖2 人工模板引入酶切位點(diǎn)測(cè)序圖A為野生型片段引入酶切位點(diǎn);B為突變型片段引入酶切位點(diǎn)。

2.2 兩組不同比例混合模板克隆結(jié)果

兩組培養(yǎng)皿上均可見白色克隆與藍(lán)色克隆。實(shí)驗(yàn)組酶切產(chǎn)物去磷酸化,被酶切成兩個(gè)小片段的野生型片段與線性化載體的連接受到阻礙,突變片段為一完整片段,去磷酸化不影響突變片段與線性化載體的連接,與對(duì)照組相比較,白色/藍(lán)色克隆大幅提升(圖3)。

圖3 不同比例混合模板的克隆形成圖A從左到右依次為MUT/WT 12質(zhì)粒比例分別為0∶1、1∶300、1∶1 000、1∶3 000克隆形成圖;B從左至右依次為MUT/WT 12質(zhì)粒比例分別為0∶1、1∶3 000、1∶10 000、1∶30 000克隆形成圖。

2.3 藍(lán)白斑菌落計(jì)數(shù)

對(duì)照組1∶3 000培養(yǎng)皿上白色克隆17個(gè),藍(lán)色克隆2 329個(gè),白色/藍(lán)色克隆為1/137;而實(shí)驗(yàn)組1∶30 000的培養(yǎng)皿上白色克隆23個(gè),藍(lán)色克隆394個(gè),白色/藍(lán)色克隆為1/17;1∶30 000實(shí)驗(yàn)組白色/藍(lán)色克隆比例明顯高于1∶3 000 對(duì)照組(表1)。

表1 藍(lán)白斑菌落計(jì)數(shù)

2.4 菌液PCR酶切鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組1∶30 000培養(yǎng)皿上的5個(gè)陽(yáng)性克隆酶切鑒定出3個(gè)陽(yáng)性克隆(圖4A)。一代測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證插入片段的序列,其序列見圖4B。野生型擴(kuò)增片段為BstNI的酶切位點(diǎn),被BstNI消化為80 bp與50 bp的兩個(gè)DNA片段,這兩個(gè)片段不能被瓊脂糖電泳檢測(cè)(可以用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè))。

圖4 菌液PCR酶切電泳圖A為菌液PCR酶切電泳圖(箭頭所指為陽(yáng)性克隆);B為陽(yáng)性克隆插入片段序列圖。a為80 bp片段;b為50 bp片段。

2.5 肺癌患者游離DNA驗(yàn)證結(jié)果

26例肺癌患者游離DNA檢測(cè)出2例游離DNA為KRAS基因第12位密碼子突變,其克隆形成圖如圖5A,測(cè)序驗(yàn)證其插入序列如圖5B。

圖5 肺癌患者游離DNA驗(yàn)證結(jié)果A為酶切聯(lián)合去磷酸化與藍(lán)白斑篩選對(duì)游離DNA檢測(cè)的克隆形成圖;B為酶切鑒定為陽(yáng)性克隆插入片段的序列圖。

3 討 論

利用游離DNA進(jìn)行腫瘤早期診斷與腫瘤切除術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)時(shí),富集低豐度突變DNA片段至關(guān)重要。微滴數(shù)字PCR檢測(cè)熱點(diǎn)突變能夠在一萬(wàn)野生拷貝中檢測(cè)出單一拷貝[8-9],但成本高,操作系統(tǒng)繁瑣,現(xiàn)無法在基層醫(yī)院推廣為普通的體檢項(xiàng)目。二代測(cè)序不能對(duì)腫瘤進(jìn)行早期或超早期診斷,且測(cè)序費(fèi)用高,不易被普通百姓接受[10-13]。Zhang等[14-15]發(fā)明的高保真聚合酶介導(dǎo)的引物3′末端硫化修飾技術(shù)雖檢測(cè)下限可達(dá)到千分之一甚至更低,但具有假陽(yáng)性并存的缺點(diǎn)。

藍(lán)白斑篩選聯(lián)合一代測(cè)序可檢測(cè)千分之一的稀有突變,更適合于腫瘤切除術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)控[5]。對(duì)于一些體細(xì)胞突變,其野生型片段含酶切位點(diǎn),突變引起酶切位點(diǎn)消失;或其野生型片段可經(jīng)PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn),而突變型片段不能被引入酶切位點(diǎn),可利用限制性內(nèi)切酶酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,去磷酸化,再與線性化載體連接,一代測(cè)序?qū)﹃?yáng)性克隆的插入片段序列進(jìn)行確定。野生型片段被酶切成兩個(gè)小片段,去磷酸化處理,5′末端去磷酸基團(tuán)的產(chǎn)物不能與線性化載體連接。對(duì)涉及終止密碼子的突變,可通過克隆顏色對(duì)稀有突變進(jìn)行初步區(qū)分。實(shí)驗(yàn)組MUT/WT 12為1∶30 000的培養(yǎng)皿上白色/藍(lán)色克隆為1/17,而對(duì)照組MUT/WT 12為1∶3 000的培養(yǎng)皿上其白色/藍(lán)色克隆為1/137,1∶30 000實(shí)驗(yàn)組白色/藍(lán)色克隆比例明顯高于1∶3 000對(duì)照組。野生型片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切,在T4連接酶的作用下,與線性化載體連接。藍(lán)白斑篩選高效率與假陽(yáng)性并存,對(duì)照組的培養(yǎng)皿上白色/藍(lán)色克隆的比例高于實(shí)質(zhì)模板比例,考慮為載體的自連。將實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿上的陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定,再將酶切鑒定為陽(yáng)性克隆的一代測(cè)序以確定插入片段的序列可避免假陽(yáng)性。本研究結(jié)果顯示,限制性內(nèi)切酶酶切后去磷酸化聯(lián)合藍(lán)白斑篩選可檢測(cè)出1∶30 000 KRAS基因稀有突變,證明了限制性內(nèi)切酶酶切后去磷酸化聯(lián)合藍(lán)白斑篩選可提高對(duì)稀有突變的檢測(cè)能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明限制性內(nèi)切酶酶切后去磷酸化聯(lián)合藍(lán)白斑篩選在惡性腫瘤的早期或超早期診斷具有較大的應(yīng)用潛力。

KRAS熱點(diǎn)突變見于多種惡性腫瘤,其中,突變率最高的為胰腺癌,其次為直結(jié)腸癌、膽管癌及肺癌[7]。本課題組利用限制性內(nèi)切酶酶切后去磷酸化聯(lián)合藍(lán)白斑篩選對(duì)KRAS基因第12密碼子突變的人工模板進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)對(duì)26例肺癌患者游離DNA進(jìn)行稀有突變檢測(cè)以驗(yàn)證此技術(shù)的可行性。游離DNA檢測(cè)為無創(chuàng)性檢測(cè),患者接受的意愿高。這一研究對(duì)涉及終止密碼子的其他熱點(diǎn)突變的檢測(cè)具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值,可為臨床惡性腫瘤的診斷提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,對(duì)臨床早期及超早期診斷腫瘤、確定治療方案以及腫瘤的預(yù)后具有較重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。此外,本方法操作簡(jiǎn)單,所需要的分子生物學(xué)試劑成本低廉,所需的儀器PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳等,均為分子生物學(xué)基本儀器,對(duì)操作人員的技術(shù)要求不高,有利于在基層醫(yī)院普及。此項(xiàng)檢測(cè)可納入為常規(guī)的體檢項(xiàng)目,為腫瘤的早期和超早期診斷提供一種低廉、低檢測(cè)下限的檢測(cè)方法,可以作為早期腫瘤篩查的檢測(cè)技術(shù)。