林銘釤, 林建國(guó), 林明瑩, 張笑霄, 張晴, 朱婷婷, 姚魁武,4

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;3.西安理工大學(xué),陜西西安 710048;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院,北京 100040

便秘(constipation)是一種常見的消化系統(tǒng)癥狀,表現(xiàn)為排便困難、排便次數(shù)減少、糞便干硬癥狀中的至少一種。研究表明,便秘會(huì)增加冠心病和缺血性卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),相較于非便秘人群,有基礎(chǔ)性疾病便秘人群的死亡風(fēng)險(xiǎn)更高[1-2]。

中醫(yī)認(rèn)為,邪滯腸胃,糟粕內(nèi)停,大腸傳導(dǎo)失司為便秘的主要病理機(jī)制,其中氣機(jī)郁滯、陰虧血少是其主要證候,患者多有情志不調(diào),肝氣郁結(jié),導(dǎo)致腑氣郁滯;或素體陰虛,陰血虧少不足以榮養(yǎng)。臨床相關(guān)研究顯示,以逍遙散為基礎(chǔ)方治療便秘能夠增強(qiáng)結(jié)腸動(dòng)力,提高傳輸功能和胃腸排空率,從而改善臨床癥狀[3-4]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究丹梔逍遙散治療便秘的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 丹梔逍遙散中活性成分和靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP(http:tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)分別查找柴胡(CH)、白芍(BS)、甘草(GC)、當(dāng)歸(DG)、茯苓(FL)、白術(shù)(BZ)、牡丹皮(DP)、梔子(ZZ)的化學(xué)組成成分。TCMSP篩選條件為口服利用度≥30%,且藥性≥0.18;BATMAN-TCM篩選條件為靶點(diǎn)預(yù)測(cè)得分值≥50,初步篩選丹梔逍遙散的有效活性成分,并根據(jù)文獻(xiàn)中中藥的主要有效成分進(jìn)行補(bǔ)充完善[5-7]。用化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)中規(guī)范蛋白靶點(diǎn)且匹配標(biāo)準(zhǔn)基因名稱,查重后刪除重復(fù)值和無(wú)靶點(diǎn)的化學(xué)成分。

1.2 便秘相關(guān)靶點(diǎn)檢索和篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/home/)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd)的疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)中,以“constipation”為關(guān)鍵詞檢索便秘的相關(guān)靶點(diǎn),匯總后去重得到疾病靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

在微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn)對(duì)藥物與疾病靶點(diǎn)取交集,繪制文氏圖,并在Cytoscape3.8.0構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò),利用內(nèi)置Network Analyzer和cytoHubba功能分析網(wǎng)絡(luò),推測(cè)丹梔逍遙散的有效活性成分。用丹梔逍遙散與便秘的交集靶點(diǎn),在STRING(http://stringdb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)上構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出數(shù)據(jù),篩選核心蛋白。

1.4 富集分析

將丹梔逍遙散和便秘篩選去重后的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)(http://metascape.org/),對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,在微生信平臺(tái)繪制氣泡圖;在BioGPS平臺(tái)(http://biogps.org/)檢索關(guān)鍵靶點(diǎn)并對(duì)其組織、器官特異性表達(dá)程度進(jìn)行分析。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank,PDB)(http://www.pdbus.org)檢索篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)合適的PDB ID并下載其pdb結(jié)構(gòu),在TCMSP平臺(tái)上下載篩選出有效活性成分化合物的mol2結(jié)構(gòu)。使用SwissDock平臺(tái)(http://www.swissdock.ch/)進(jìn)行在線分子對(duì)接,根據(jù)其結(jié)合能評(píng)價(jià)靶點(diǎn)和有效成分的結(jié)合強(qiáng)度。對(duì)接能量<0 kcal/mol為小分子配體與大分子蛋白能夠自發(fā)結(jié)合,并且對(duì)接能量越低,結(jié)合效果越好;當(dāng)對(duì)接結(jié)合能量<-5 kcal/mol,為具有較好的結(jié)合效果;對(duì)接結(jié)合能量<-7 kcal/mol為具有較強(qiáng)的結(jié)合效果[8]。

2 結(jié) 果

2.1 丹梔逍遙散的有效成分和靶點(diǎn)

篩選整合后得到丹梔逍遙散的有效活性成分250個(gè)(其中柴胡20個(gè)、當(dāng)歸49個(gè)、白芍13個(gè)、茯苓16個(gè)、白術(shù)8個(gè)、甘草118個(gè)、牡丹皮11個(gè)、梔子15個(gè)),剔除重復(fù)后共獲得225個(gè)有效活性成分,746個(gè)藥物靶點(diǎn),其中度值前五的有效活性成分見表1。

表1 丹梔逍遙散的有效活性成分

2.2 便秘相關(guān)靶點(diǎn)檢索

檢索GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD疾病數(shù)據(jù)庫(kù),得到便秘靶點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為5 365(篩選后1 430個(gè))、647、424、9個(gè),篩選并去重后得到便秘靶點(diǎn)1 620個(gè)。丹桅逍遙散與便秘的交集靶點(diǎn)為153個(gè)(圖1)。

圖1 丹桅逍遙散-便秘交集靶點(diǎn)文氏圖

2.3 丹梔逍遙散治療便秘的PPI網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶點(diǎn)

丹梔逍遙散和便秘靶點(diǎn)交集共153個(gè),STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。根據(jù)度值篩選前4位的關(guān)鍵靶點(diǎn),分別為VEGFA、CASP3、TNF、JUN。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 丹梔逍遙散-化合物-靶點(diǎn)-便秘網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

共獲得351個(gè)節(jié)點(diǎn)(包含153個(gè)靶點(diǎn)和189個(gè)有效活性成分)與1 574條關(guān)系(圖3)。根據(jù)cytoHubba篩選前4位的關(guān)鍵成分為槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇。

圖3 丹梔逍遙散-化合物-靶點(diǎn)-便秘網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集及KEGG通路結(jié)果

GO富集分析包含生物過(guò)程、分子過(guò)程以及細(xì)胞過(guò)程。其生物過(guò)程主要為對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)等;分子過(guò)程主要為氧化還原酶活性、信號(hào)受體激活劑活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等;細(xì)胞過(guò)程主要涉及膜筏、線粒體包膜、細(xì)胞體等(圖4)。KEGG主要通路涉及癌癥的通路、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化、NF-κB信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、炎性腸病等(圖4)。

圖4 GO富集和KEGG通路氣泡圖

2.6 組織、器官富集分析

對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)組織特異性表達(dá)主要分布在淋巴細(xì)胞、平滑肌、肺、結(jié)腸、結(jié)直腸腺癌、小腸(表2)。

表2 組織、器官富集

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

分別將槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇與VEGFA、CASP3、TNF、JUN進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示,β-谷甾醇和TNF以及豆甾醇和CASP3具有較強(qiáng)的結(jié)合效果(圖5、圖6)。

圖5 分子對(duì)接結(jié)合能

圖6 分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

便秘的病因較為復(fù)雜,最常見于藥物治療所引起的癥狀,也可由多種疾病引起,包括代謝性疾病、肌病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等,其病理生理學(xué)機(jī)制尚未完全明確。研究表明[3,9],便秘與多種胃腸道神經(jīng)肌肉病變、神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂,以及腸道炎癥、腸道微生物菌群改變相關(guān)。便秘與肛門直腸疾病密切相關(guān),是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要影響因素[10]。

丹梔逍遙散的主要化學(xué)成分多為黃酮類、甾醇類,包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等。槲皮素是廣泛存在于多種植物中的黃酮醇類化合物,具有抗氧化、抗炎的作用。Kim等[11]發(fā)現(xiàn),槲皮素可刺激便秘大鼠排便,這可能與恢復(fù)其mAChRs表達(dá)下調(diào)及其下游信號(hào),降低Gα、PI3K磷酸化水平,調(diào)節(jié)胃腸平滑肌,增加腸蠕動(dòng)功能相關(guān);誘導(dǎo)橫結(jié)腸分泌黏蛋白,且誘導(dǎo)功能的強(qiáng)弱與膜水通道表達(dá)相關(guān);病理組織分析發(fā)現(xiàn)其可恢復(fù)橫結(jié)腸的異常結(jié)構(gòu)改變。Liu等[12]發(fā)現(xiàn),槲皮素能抑制便秘模型大鼠的腸桿菌及腸球菌生長(zhǎng),減少乙酸合成為丁酸,保護(hù)腸上皮細(xì)胞的屏障功能。研究表明,槲皮素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬能力,通過(guò)調(diào)節(jié)P53、AMPK信號(hào)通路,滅活HIF-1信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)保護(hù)性自噬能力,另可通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑讓細(xì)胞失活,失去自噬能力[13]。曲一帆[14]發(fā)現(xiàn),山奈酚可以降低腸道中脂多糖含量,改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀,保護(hù)腸黏膜,調(diào)節(jié)菌群平衡,減輕病理?yè)p傷。同時(shí),山奈酚可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制VEGF表達(dá),調(diào)節(jié)HIF-1α,誘導(dǎo)CASP3依賴性細(xì)胞凋亡[15]。Chen等[16]認(rèn)為,山奈酚可以增加腸道緊密蛋白表達(dá)保護(hù)腸道物理屏障,增加丁酸鹽受體,增強(qiáng)腸上皮屏障功能。β-谷甾醇、豆甾醇均可減少結(jié)腸炎小鼠的高炎癥表達(dá)[17]。Ding等[18]發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可以減緩結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量下降,縮短結(jié)腸長(zhǎng)度,降低髓過(guò)氧化物酶活性,減少結(jié)腸TNF-α,改善組織學(xué)炎癥變化,此外腸上皮抗菌肽的表達(dá)顯著增加,對(duì)致病菌有多重作用。嚴(yán)海冬等[19]發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇抑制炎癥因子,豆甾醇抑制結(jié)腸縮短,降低炎癥因子表達(dá),緩解結(jié)腸炎的癥狀,且豆甾醇的抗炎性高于β-谷甾醇。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)有VEGFA、CASP3、TNF、JUN。CASP3作為關(guān)鍵角色參與細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。VEGFA是血管新生和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn),在中國(guó)漢族人群中,壞死性結(jié)腸炎患者的血液中VEGFA水平較普通人低[20]。Frysz-Naglak等[21]發(fā)現(xiàn),腸道上皮細(xì)胞如果VEGF產(chǎn)生過(guò)多,可能會(huì)損傷腸道的屏障,使腸道菌群侵犯腸壁。JUN與癌癥的發(fā)生密切相關(guān),當(dāng)積累到一定程度時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞增殖,但在結(jié)腸癌中可被E3泛素連接酶泛素化,繼而降解,發(fā)揮抑癌作用[22]。TNF-α是重要的促炎因子,改變腸黏膜通透性,破壞腸道[23]。

綜上所述,丹梔逍遙散治療便秘主要涉及槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等189個(gè)有效活性成分,可能通過(guò)VEGFA、CASP3、TNF、JUN等關(guān)鍵靶點(diǎn),調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、炎性腸病、NF-kappa B信號(hào)通路等相關(guān)通路,從而參與抗炎、保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群,改善便秘癥狀。