劉慶, 宋彩露, 劉凌蕊, 許嬡淇, 莫運(yùn)仙

中山大學(xué)腫瘤防治中心,廣東廣州510060

三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體表達(dá)均為陰性的乳腺癌,其主要特點(diǎn)為發(fā)病年齡早、侵襲性強(qiáng)、治療效果差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、生存預(yù)后差[1-2],常見轉(zhuǎn)移部位包括骨、肺、肝和腦,其中腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率最高[3]。由于缺乏有效治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo),目前三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移仍缺乏有效治療手段。環(huán)狀RNA(circRNA)為共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)的單鏈非編碼RNA,circRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常,是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[4-5]。有研究顯示,circ0000799在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)且與預(yù)后密切相關(guān)[6]。因此,本研究探究circ0000799經(jīng)miR-1287-5p/GPX4軸對(duì)鐵死亡促進(jìn)三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的影響,為三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)及GAPDH抗體(CST,美國),DMEM、RPMI 1640及DMEM/F12培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清(Gibco,美國),慢病毒質(zhì)粒(sh-circ0000799)及其對(duì)照(sh-circCTR)、miR-1287-5p模擬物(miR-1287-5p)及其對(duì)照(miR-CTR)、(1S,3R)-RSL3(翌圣,中國),RNase R酶、細(xì)胞核/胞質(zhì)細(xì)胞組分提取試劑盒(碧云天,中國),TaqMan反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒(Takara,日本),0.8 nm Transwell小室及基質(zhì)膠(BD,美國),谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)定量分析試劑盒(ab138881,美國)。

1.2 臨床標(biāo)本

收集本院2018年5月15日—2023年5月15日三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者10例,年齡(39.5±8.9)歲。取術(shù)中新鮮樣本,按病理號(hào)分別保存患者原發(fā)灶、腦轉(zhuǎn)移灶和癌旁組織,提取組織RNA -80 ℃?zhèn)溆?。本研究?jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者或家屬知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建

人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、非三陰乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3、HCC-38)、親代三陰乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468)、子代腦轉(zhuǎn)移三陰乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231-BM、BT-549-BM)[7-8]來源于ATCC組織。MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)于含1%馬血清、20 ng表皮生長因子、0.5 μg氫化可的松、10 mg/L胰島素及1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中;其他細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中。根據(jù)轉(zhuǎn)染敲低RNA(short hairpin RNA,shRNA)不同,細(xì)胞分為sh-circCTR組和sh-circ0000799組。分別轉(zhuǎn)染sh-circCTR和sh-circ0000799至MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM細(xì)胞中,qRT-PCR驗(yàn)證circ0000799敲低效率。

1.4 qRT-PCR

提取細(xì)胞及組織總RNA,以RNA為模板,根據(jù)Takara提供的反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒說明書,分析circ0000799表達(dá)量(使用IQTM5 Multicolor實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng),美國BioRad)。circ0000799及其對(duì)照引物分別用于qRT-PCR,反應(yīng)體系為20 μL,以U6為內(nèi)參,引物序列hsa_circ_0000799(circ-BPTF):F5′-CCCCATTTTACCAGTGTGCAG-3′,R5′-GCTGGACCCACACTTGATGA-3′;U6:F5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCT公式計(jì)算circ0000799表達(dá)量,每組含3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-circCTR和sh-circ0000799慢病毒質(zhì)粒的MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM細(xì)胞分別制成2×105個(gè)/mL單細(xì)胞懸液。在Transwell上腔層中鋪加基質(zhì)膠,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置6 h成膜后取出。每個(gè)小室上腔層加入150 μL單細(xì)胞懸液,下腔層加入350 μL含20%FBS培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后取出小室,結(jié)晶紫染色,去除、清洗并晾干小室后,鏡下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞。

1.6 RNase R酶消化實(shí)驗(yàn)

提取MDA-MB-231細(xì)胞總RNA,分為RNase R組(加RNase R消化)和對(duì)照組(不加RNase R消化)。于PCR儀中分別經(jīng)37 ℃、70 ℃反應(yīng)30 min及10 min使酶滅活,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),分別使用根據(jù)環(huán)狀RNA circ0000799接口處設(shè)計(jì)的引物、其線性親本基因BPTF設(shè)計(jì)的引物,進(jìn)行qRT-PCR檢測,比較環(huán)狀circ0000799及其線性親本基因BPTF分別經(jīng)30 min RNase R處理后的mRNA表達(dá)水平,明確circ0000799在MDA-MA-231細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

1.7 circ0000799亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)

按照細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞組分提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作,提取MDA-MA-231細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核RNA,qRT-PCR分別檢測circ0000799、細(xì)胞質(zhì)對(duì)照β-actin、細(xì)胞核對(duì)照18S在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)量,根據(jù)兩者比例作圖。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將2×104個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h。使用Lipo 3000分別共轉(zhuǎn)染野生型circ0000799、突變型circ0000799,或野生型GPX4、突變型GPX4,或miR-1287-5p、miR-CTR,按試劑盒說明書進(jìn)行操作[9],分別驗(yàn)證circ0000799與miR-1287-5p,以及miR-1287-5p與GPX4之間的結(jié)合關(guān)系。

1.9 GSH和GSSG定量分析

細(xì)胞分為sh-circ0000799組和sh-circCTR組。據(jù)說明書操作,將脫蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別加入孔中,并在測定緩沖液中加入Thiol Green用于GSH檢測,或加入GSSG探針用于總谷胱甘肽(GSH+GSSG)檢測。將混合物室溫孵育30 min后,使用酶標(biāo)儀分析樣品。計(jì)算總GSH/GSSG比值。

1.10 蛋白質(zhì)印跡分析

細(xì)胞分為sh-circ0000799組和sh-circCTR組。RIPA裂解法從MDA-MB-231細(xì)胞提取分離總蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分離蛋白,300 mA轉(zhuǎn)PVDF膜2 h。4 ℃ 1∶1 000 GPX4和GAPDH一抗分別孵育過夜,室溫下采用特異性二抗孵育2 h,顯影成像,使用Image J進(jìn)行定量分析。

1.11 小鼠體內(nèi)腦轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建

15只4周齡BALB/c裸鼠隨機(jī)分為3組,每組5只,分別為sh-circCTR組、sh-circ0000799組、sh-circ0000799+RSL3組。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株經(jīng)左心室注射到裸鼠體內(nèi)以構(gòu)建腦轉(zhuǎn)移模型,其中sh-circ0000799+RSL3組在注射sh-circ0000799穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后的第7周開始進(jìn)行鐵死亡誘導(dǎo)劑100 mg/kg RSL3皮下注射治療,每周2次,持續(xù)2周。第8周后結(jié)束實(shí)驗(yàn),處死小鼠,取腦組織進(jìn)行HE染色,鏡下統(tǒng)計(jì)腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目并記錄。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 circ0000799在乳腺癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)

與MCF-10A和癌旁組織比較,circ0000799在三陰乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中上調(diào),且在子代三陰乳腺癌細(xì)胞系及腦轉(zhuǎn)移灶中上調(diào)最為顯著(P<0.05;圖1)。

圖1 circ0000799在乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中的表達(dá)a為P<0.05,與MCF-10A比較;b為P<0.05,與非三陰乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、T47D、BT-474、SKBR-3、HCC-38)比較;c為P<0.05,與親代三陰乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468)比較;d為P<0.05,與癌旁組織比較;e為P<0.05,與原發(fā)灶組織比較。

2.2 circ0000799對(duì)細(xì)胞生長的影響

sh-circ0000799敲除效率在MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM中得到驗(yàn)證(P<0.05;圖2A)。與sh-circCTR組比較,sh-circ0000799組MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM細(xì)胞生長能力顯著降低(P<0.05;圖2B)。即外源性沉默circ0000799可降低親代MDA-MB-231和子代腦轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231-BM細(xì)胞生長能力。

圖2 circ0000799對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長的影響A為MDA-MB-231和MDA-MB-231-BM中circ0000799敲低效率;B為細(xì)胞生長曲線。a為P<0.05,與sh-circCTR組比較。

2.3 circ0000799對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

與sh-circCTR組比較,sh-circ0000799組MDA-MB-231、MDA-MB-231-BM細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05;圖3),即外源性沉默circ0000799可降低親代MDA-MB-231和子代腦轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231-BM細(xì)胞侵襲能力。

圖3 circ0000799對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色,100×)a為P<0.05,與sh-circCTR組比較。

2.4 circ0000799對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的影響

sh-circCTR組、sh-circ0000799組、sh-circ0000799+RSL3組腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量依次降低[(2.4±0.49)個(gè)比(1.2±0.4)個(gè)比(0.2±0.4)個(gè),P<0.05;圖4]。

圖4 circ0000799對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的影響(HE染色)

2.5 circ0000799結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性鑒定及定位

與對(duì)照組比較,RNase R酶處理后環(huán)狀RNA circ0000799表達(dá)無顯著變化(P>0.05),而其線性BPTF表達(dá)降低(P<0.05;圖5)。胞質(zhì)circ0000799表達(dá)高于胞核(P<0.05;圖5),即circ0000799亞細(xì)胞定位主要為細(xì)胞質(zhì)。

圖5 circ0000799結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性鑒定及定位A為circ0000799和BPTF的表達(dá);B為circ0000799的亞細(xì)胞定位。a為P<0.05,與對(duì)照組比較;b為P<0.05,與同組細(xì)胞核比較。

2.6 circ0000799可能通過miR-1287-5p/GPX4調(diào)控鐵死亡促進(jìn)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移

生物信息學(xué)軟件circInteractome和TargetScan預(yù)測,且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,circ0000799可與miR-1287-5p相互作用,miR-1287-5p可與GPX4相互作用(圖6A)。與sh-circCTR組比較,sh-circ0000799組miR-1287-5表達(dá)增加;與miR-CTR組比較,miR-1287-5p組GPX4 mRNA表達(dá)降低(P<0.05;圖6B)。敲除circ0000799后,細(xì)胞內(nèi)總GSH/GSSG比(圖6C)和GPX4表達(dá)降低(P<0.05;圖6D)。

圖6 circ0000799可能通過miR-1287-5p/GPX4調(diào)控鐵死亡促進(jìn)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移A為生物信息學(xué)軟件和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn);B為qRT-PCR;C為總GSH/GSSG定量分析柱狀圖;D為Western blotting(1為sh-circCTR組;2為sh-circ0000799組)。a為P<0.05,與miR-CTR組比較;b為P<0.05,與sh-circCTR組比較。

3 討 論

circRNA在多種組織和細(xì)胞中均有廣泛分布,具有一定的特異性[10]。具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的circRNA在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著不可替代的作用[11]。隨著高通量技術(shù)不斷完善,不斷有新的circRNA被發(fā)現(xiàn)并探究其與腫瘤進(jìn)展之間的相關(guān)性[12]。circRNA已被證實(shí)為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。環(huán)狀RNA circ0000799(hsa_circRNA_0000799,chr17:65941524-65972074)為一種來源于BPTF基因外顯子的新型circRNA(circBPTF)。研究顯示,circ0000799在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)且與患者腫瘤分級(jí)呈正相關(guān),與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),且該過程可能是通過海綿吸附miR-31-5p靶向上調(diào)RAB27A表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的,是膀胱癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[6]。本研究通過檢測circ0000799在乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),circ0000799在所有乳腺癌細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào),且相對(duì)于親代三陰乳腺癌細(xì)胞系,子代腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中上調(diào)最為顯著;而在10例乳腺癌原發(fā)灶、腦轉(zhuǎn)移灶及癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果也一致,即在三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)上調(diào)最為顯著。該結(jié)果與膀胱癌[6]結(jié)果較為一致,同時(shí)也說明circ0000799可能是三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一個(gè)circRNA。隨后通過shRNA敲低circ0000799在親代和子代腦轉(zhuǎn)移性三陰乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)敲低circ0000799可顯著抑制細(xì)胞生長、侵襲及腦轉(zhuǎn)移能力。

鐵死亡是一種鐵離子依賴型的脂質(zhì)過氧化物損傷所引起的細(xì)胞程序性死亡的現(xiàn)象,其遺傳學(xué)背景、生化調(diào)節(jié)模式及形態(tài)學(xué)特征均不同于以往的凋亡、自噬、焦亡和壞死等經(jīng)典細(xì)胞死亡模式,是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡模式,以鐵離子、活性氧和脂質(zhì)過氧化物堆積、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制、谷胱甘肽合成減少、還原型輔酶Ⅱ被氧化等為其典型的生化特征[13]。鐵死亡發(fā)生的機(jī)制為細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子與過氧化物發(fā)生芬頓反應(yīng),從而使生物膜上的多不飽和脂肪酸進(jìn)一步過氧化,該過程受多種基因調(diào)控,如調(diào)控鐵代謝相關(guān)的血紅素加氧酶1、抗氧化代謝相關(guān)的胞質(zhì)接頭蛋白、能量代謝相關(guān)的谷氨酰胺酶2,以及脂質(zhì)代謝相關(guān)的GPX4[14]。GPX4可特異性清除脂質(zhì)過氧化物,并有效抑制鐵死亡發(fā)生[15]。研究顯示,抑制GPX4的表達(dá)或活性,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生,從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),由子代腦轉(zhuǎn)移性三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-BM通過左心室注射構(gòu)建的腦轉(zhuǎn)移模型中,在敲低circ0000799后腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)顯著降低,且在與鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3連用后,腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)接近消失。同時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞中總GSH/GSSG隨circ0000799的抑制而顯著降低,同時(shí)鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物GPX4蛋白的表達(dá)也顯著降低,上述結(jié)果均表明三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移與鐵死亡密切相關(guān)。已有研究顯示,鐵死亡可能通過破壞鐵離子穩(wěn)態(tài)而參與乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移。鐵代謝與鐵的吸收、利用、儲(chǔ)存和輸出密切相關(guān),高鐵水平會(huì)產(chǎn)生活性氧,并決定細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性,容易轉(zhuǎn)移的癌癥細(xì)胞通常非常容易發(fā)生鐵死亡[14]。本研究與文獻(xiàn)[14]結(jié)果一致,circ0000799調(diào)控三陰乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移可能是通過鐵死亡實(shí)現(xiàn)的。

本研究通過結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性鑒定及亞細(xì)胞定位,確定了circ0000799的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及其發(fā)揮生物學(xué)活性的主要位置為細(xì)胞質(zhì)。隨后通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測,發(fā)現(xiàn)circ0000799可與miR-1287-5p結(jié)合,而GPX4是miR-1287-5p的下游靶基因。研究顯示,circRNA通過海綿吸附miRNA,競爭性結(jié)合miRNAs以調(diào)節(jié)miRNAs下游基因表達(dá)[18]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因和qRT-PCR實(shí)驗(yàn),證實(shí)了circ0000799與miR-1287-5p、GPX4與miR-1287-5p之間的相互結(jié)合關(guān)系,即circ0000799-miR-1287-5p-GPX4軸在三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,該作用最終通過促進(jìn)GPX4表達(dá)抑制鐵死亡而促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移,且Western blotting實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了抑制circ0000799可顯著抑制GPX4蛋白表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了三者間的調(diào)控關(guān)系。而在膀胱癌中也證實(shí)circ0000799可通過miR-31-5p/RAB27A軸而促進(jìn)膀胱癌的惡性進(jìn)展[6]。該結(jié)果與胞質(zhì)circRNA可作為miRNA海綿調(diào)控下游關(guān)鍵基因的結(jié)果一致[19]。

目前該機(jī)制的嚴(yán)謹(jǐn)性仍待完善,后續(xù)將納入多株親代及子代轉(zhuǎn)移性三陰乳腺癌細(xì)胞系、臨床腦轉(zhuǎn)移樣本,并進(jìn)行RIP、qRT-PCR、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)活體成像等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究初步證實(shí)circ0000799與三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的密切關(guān)聯(lián),該過程可能是通過調(diào)控miR-1287-5p/GPX4軸而實(shí)現(xiàn)的,該結(jié)果可能為提高三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后提供新思路。