楊智惠,李嘉欣,王金宏,宋 輝,宗 政,胡 揚,李文蘭

(哈爾濱商業(yè)大學 藥學院,哈爾濱 150076)

藍靛果(LoniceracaeruleaL.)又稱黑瞎子果、山茄子等,是一種落葉灌木植物,屬于忍冬科忍冬屬[1-2].其味苦性涼,可清熱瀉火、散癰消腫,可治療乳癰、腸癰、丹毒等熱毒瘡瘍癥,同時也可用于濕熱痢疾、大便赤白等癥,具有較高的營養(yǎng)以及醫(yī)療保健價值[3].藍靛果中富含多酚、礦物質(zhì)元素、有機酸、維生素等多種與人類健康密切相關(guān)的物質(zhì)[3],其主要成分包括多酚類(花青素、原花青素、花色苷、酚酸類、類黃酮類)、多糖類、有機酸等[4].多酚類成分是一類具有多個羥基苯環(huán)的化合物,常見于植物中,具有廣泛的生物活性和藥理作用.其主要作用機制包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、保肝護肝和免疫調(diào)節(jié)等作用[5-7].在抗氧化方面,多酚類成分中羥基結(jié)構(gòu)能夠捕捉自由基,使其羥基產(chǎn)生病理變化,達到清除自由基的目的[8].在抗炎方面,多酚類成分通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生和發(fā)揮抗氧化作用來減輕炎癥反應和組織損傷[9].在抗腫瘤方面,多酚類成分能夠通過增強染色體修復能力和機體免疫力來抑制癌細胞的增生,提高人體抗癌能力[10-11].在抗衰老方面,多酚類成分能夠提高細胞自我修復能力,延緩細胞衰老和機體老化進程[12].在保肝護肝方面,藍靛果對肝炎癥和肝細胞過氧化具有正向調(diào)節(jié)作用,另外對脂多糖誘導的大鼠肝源性細胞(BRL-3A)有保護作用[13],對CCl4導致的肝損傷也有一定的保護作用[14].因此,多酚類成分被廣泛應用于中藥、保健食品和化妝品等領(lǐng)域.

本文采用超聲法提取藍靛果中的多酚成分,以四氯化碳(CCl4)和順鉑誘導的急性肝損傷、急性腎損傷小鼠為研究對象,探究藍靛果多酚提取物的保肝保腎作用,為藍靛果多酚提取物保肝保腎作用提供理論依據(jù),對藍靛果相關(guān)健康產(chǎn)品的研發(fā)和臨床應用具有重要意義.

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-5800紫外-可見分光光度儀(上海元析儀器有限公司);680型全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司);電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);FDU-1200冷凍干燥機(上海愛郎儀器有限公司);Neofuge 13R高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司).

1.2 藥材、試劑與動物

藍靛果(大興安嶺超越野生漿果開發(fā)有限責任公司);95%乙醇(分析純,津東天正化學試劑廠,批號:20190807);福林-酚(上海國藥試劑集團,批號:20180423);沒食子酸(上海源葉生物科技有限公司,批號:C17D10C105977);四氯化碳(上海麥克林試劑有限公司,批號:C11812393);水飛薊素膠囊(德國馬博士大藥廠,批號:H20190115);順鉑(齊魯制藥有限公司,批號:1C0166B03);醋酸地塞米松片(遂成藥業(yè)股份有限公司,批號:20190901);A045-2-2 TP試劑盒,批號20210719;A028-2-1 ALB試劑盒,批號20210719;C009-2-1 ALT試劑盒,批號20210721;C010-2-1 AST試劑盒,批號20210721;C019-1-1 TBIL試劑盒,批號20210723;C019-2-1 DBIL試劑盒,批號20210723;A006-2-1GSH試劑盒,批號20210724;A005-1-2 GSH-Px試劑盒,批號20210724;A003-1-2 MDA試劑盒,批號20210725;A001-3-2 SOD試劑盒,批號20210725;A013-2-1 BUN試劑盒,批號20210823;A011-2-1 CRE試劑盒,批號20210823;C002-1-1 Na+試劑盒,批號20210815;C004-2-1 Ca2+試劑盒,批號20210814;C005-1-1 Mg2+試劑盒,批號20210824;C003-2-1 Cl-試劑盒,批號20210823;C001-2-1K+試劑盒,批號20210813;C012-2-1UA試劑盒,批號20210822,以上試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所.

SPF級KM小鼠(長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司), 20～22 g, 自由飲水,適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗.

2 實驗方法

2.1 藍靛果多酚提取物的制備

將藍靛果鮮果粉碎后冷凍干燥,稱取藍靛果凍干品,50%乙醇進行提取,采用1∶15的料液比,以40 ℃的溫度進行提取,每次提取持續(xù)90 min,重復浸提2次,抽濾,合并提取液,即為多酚粗提液[15].采用大孔樹脂 (AB-8型大孔樹脂)靜態(tài)吸附方法[16],選擇pH值為7的95%乙醇,吸附時間為2 h,解吸平衡時間為40 min,得其精提物(得率為50.5%).

2.2 小鼠肝損傷實驗

2.2.1 分組、造模及樣品采集

將小鼠適應喂養(yǎng)7 d后,分為空白組(腹腔注射1 mL/kg橄欖油)、模型組(腹腔注射5% CCl4)、陽性對照組(灌胃0.1 mg/g bw水飛薊素)、藍靛果多酚提取物低中高劑量組(0.025、0.05、0.1 mg/g bw),每組10只.

在使用CCl4造模前,預先動物灌胃給藥藍靛果多酚提取物、水飛薊素干預14 d,末次給藥后,除空白對照組之外,其余小鼠均腹腔注射5%油溶CCl4,經(jīng)過24 h的造模后,從小鼠眼球中取血,將血液收集于1.5 mL離心管內(nèi).樣本在室溫下靜置20 min后,置于4 ℃的冰箱中30 min,在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min,取上清液保存于-80 ℃的冰箱中.將小鼠頸椎脫臼處死,在適宜條件下保存血液、肝、脾組織并取樣.

2.2.2 生物學指標檢測

對CCl4誘導的肝損傷小鼠進行生物學指標檢測:1)肝組織病理形態(tài)學檢查:取出肝組織,經(jīng)過脫水等操作后在顯微鏡下觀察記錄組織形態(tài)并拍照;2)臟器指數(shù)的測定:計算各組小鼠的臟器指數(shù);3)小鼠血清生化指標的測定:取小鼠血清樣品,選擇相應ELISA試劑盒測定各組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)水平;4)小鼠氧化應激指標的測定:取小鼠肝勻漿樣品,選擇相應ELISA試劑盒測定各組小鼠的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平.

2.3 小鼠腎損傷實驗

2.3.1 分組、造模及樣品采集

將小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后.分為空白組(腹腔注射0.001 mL/g生理鹽水)、模型組(腹腔注射0.02 mg/g順鉑),陽性對照組(灌胃0.004 mg/g bw地塞米松)、藍靛果多酚提取物低中高劑量組(0.025 mg/g bw、0.05 mg/g bw、0.1 mg/g bw),每組10只.

在使用順鉑造模前,預先動物灌胃給藥藍靛果多酚提取物、地塞米松干預14 d,末次給藥后,除空白對照組之外,其余小鼠均腹腔注射順鉑0.02 mg/g,造模48 h后,分別取血液、肝、脾組織,操作同2.2.1.

2.3.2 生物學指標檢測

對順鉑誘導的腎損傷小鼠進行生物學指標檢測:1)肝組織病理形態(tài)學檢查.取出肝組織,經(jīng)過脫水等操作后在顯微鏡下觀察記錄組織形態(tài)并拍照;2)臟器指數(shù)的測定.計算各組小鼠的臟器指數(shù);3)小鼠血清生化指標的測定.取小鼠血清樣品,選擇相應ELISA試劑盒測定各組的血清尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、鎂離子(Mg2+)、鉀離子(K+)、鈣離子(Ca2+)、氯離子(Cl-)、鈉離子(Na+)、尿酸(UA)水平;4)小鼠氧化應激指標的測定.取小鼠肝勻漿樣品,選擇相應ELISA試劑盒測定各組小鼠的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平.

2.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.

3 實驗結(jié)果

3.1 藍靛果多酚提取物對肝損傷小鼠的影響

3.1.1 藍靛果多酚提取物對肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學的影響

顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟HE染色切片,結(jié)果表明藍靛果多酚提取物能夠改善CCl4導致的肝結(jié)構(gòu)損傷.見圖1、表1.

表1 各組小鼠肝臟HE染色切片分析Table 1 Analysis of liver HE staining sections in each group of mice

圖1 各組小鼠HE染色結(jié)果(×400)Figure 1 HE staining results of mice in each group (×400)

3.1.2 藍靛果多酚提取物對肝損傷小鼠臟器指數(shù)的影響

通過對小鼠臟器指數(shù)參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,藍靛果多酚提取物對CCl4所致小鼠肝損傷具有一定的保護作用.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組肝臟指數(shù)略降低,脾臟指數(shù)略升高,均無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組肝臟指數(shù)略降低,無顯著性差異(P>0.05),脾指數(shù)明顯升高,有顯著性差異(P<0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組肝臟指數(shù)明顯降低,有顯著性差異(P<0.05),脾臟指數(shù)明顯升高, 有極顯著性差異(P<0.01), 見圖2.

圖2 藍靛果多酚提取物對小鼠肝臟、脾指數(shù)的影響Figure 2 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on liver, spleen index in mice

3.1.3 藍靛果多酚提取物對肝損傷小鼠血清肝生化指標的影響

通過對小鼠血清生化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明藍靛果多酚提取物可改善CCl4所致肝損傷小鼠肝細胞合成能力.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組TP、ALB略升高,無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組TP略升高,無顯著性差異(P>0.05),ALB明顯升高,有顯著性差異(P<0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組TP、ALB明顯升高,有極顯著性差異(P<0.01),見圖3.

圖3 藍靛果多酚提取物對小鼠血清TP、ALB的影響Figure 3 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum TP,ALB in mice

通過對小鼠血清生化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明藍靛果多酚提取物可改善CCl4所致肝損傷小鼠肝臟代謝排毒功能.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組TBIL、DBIL略降低,無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組DBIL略降低,無顯著性差異(P>0.05),TBIL明顯降低,有顯著性差異(P<0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組TBIL、DBIL明顯降低,有顯著性差異(P<0.05),見圖4.

圖4 藍靛果多酚提取物對小鼠血清TBIL、DBIL的影響Figure 4 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum TBIL, DBIL in mice

通過對小鼠血清生化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明藍靛果多酚提取物可以緩解CCl4所致肝損傷小鼠肝細胞的損傷.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組ALT 、AST略降低,無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組ALT、AST明顯降低,有顯著性差異(P<0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組AST、ALT明顯降低,有極顯著性差異(P<0.01),見圖5.

圖5 藍靛果多酚提取物對小鼠血清ALT、AST的影響Figure 5 Effect of indigo polyphenol extract on serum ALT, AST in mice

3.1.4 藍靛果多酚提取物對肝損傷小鼠肝抗氧化指標的影響

通過對小鼠肝臟抗氧化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明藍靛果多酚提取物可以緩解細胞氧化損傷、提高機體清除自由基的能力.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組MDA略降低,GSH、SOD、GSH-Px略升高,均無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組MDA明顯降低,GSH、SOD、GSH-Px明顯升高,均有顯著性差異(P<0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組MDA明顯降低,GSH、SOD、GSH-Px明顯升高,均有極顯著性差異(P<0.01),見圖6.

圖6 藍靛果多酚提取物對小鼠肝組織GSH、SOD、GSH-Px、MDA的影響Figure 6 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on liver tissue GSH, SOD, GSH-Px, MDA in mice

3.2 藍靛果多酚提取物對腎損傷小鼠的影響

3.2.1 藍靛果多酚提取物對腎損傷小鼠腎組織病理形態(tài)學的影響

顯微鏡下觀察各組小鼠腎臟HE染色切片,結(jié)果表明藍靛果多酚提取物可降低腎損傷程度,改善腎細胞變性、腫脹等病理現(xiàn)象,見圖7、表2.

表2 各組小鼠腎臟HE染色切片分析Table 2 Analysis of renal HE staining sections in each group of mice

圖7 各組小鼠HE染色結(jié)果(×400)Figure 7 HE staining results of mice in each group (×400)

3.2.2 藍靛果多酚提取物對腎損傷小鼠臟器指數(shù)的影響

通過對小鼠臟器指數(shù)的統(tǒng)計分析,結(jié)果表明在一定程度上,藍靛果多酚提取物可保護順鉑導致的小鼠急性腎損傷.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組腎臟指數(shù)略降低,脾臟指數(shù)略升高,均無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組腎臟指數(shù)略降低,無顯著性差異(P>0.05),脾臟指數(shù)明顯升高,有顯著性差異(P<0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組肝臟指數(shù)明顯降低,脾臟指數(shù)明顯升高,均有極顯著性差異(P<0.01),見圖8.

圖8 藍靛果多酚提取物對小鼠腎臟、脾指數(shù)的影響Figure8 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on kidney, spleen index in mice

3.2.3 藍靛果多酚提取物對腎損傷小鼠血清腎生化指標的影響

通過對小鼠血清生化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明在一定程度上,藍靛果多酚提取物可保護順鉑導致的小鼠急性腎損傷.模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組BUN、CRE、UA略降低,無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組CRE、BUN明顯降低,有顯著性差異(P<0.05),UA明顯降低,有極顯著性差異(P<0.01);藍靛果多酚提取物高劑量組BUN、CRE、UA明顯降低,有極顯著性差異(P<0.01),見圖9.

圖9 藍靛果多酚提取物對小鼠血清BUN、CRE、UA的影響Figure 9 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum BUN,CRE,UA in mice

通過對小鼠血清生化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明在一定程度上,藍靛果多酚提取物可保護順鉑導致的小鼠急性腎損傷.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組K+、Cl-略降低,Mg2+、Ca2+、Na+略有升高,均無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組K+、Cl-明顯降低,Ca2+明顯升高,均有顯著性差異(P<0.05),Mg2+、Na+明顯升高,有極顯著性差異(P<0.01);藍靛果多酚提取物高劑量組K+、Cl-明顯降低,Mg2+、Ca2+、Na+明顯升高,均有極顯著性差異(P<0.01),見圖10.

圖10 藍靛果多酚提取物對小鼠血清Mg2+ 、K+、Ca2+、 Cl- 、Na+的影響Figure 10 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on serum Mg2+, K+, Ca2+, Na+, Cl- in mice

3.2.4 藍靛果多酚提取物對腎損傷小鼠腎抗氧化指標的影響

通過對小鼠腎臟抗氧化參數(shù)進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,藍靛果多酚提取物可以緩解細胞氧化損傷,對順鉑導致的小鼠急性腎損傷具有一定的保護作用.與模型組相比,藍靛果多酚提取物低劑量組MDA略降低,GSH、SOD、GSH-Px略升高,均無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物中劑量組MDA明顯降低,SOD明顯升高,均有顯著性差異(P<0.05),GSH-Px明顯升高,有極顯著性差異(P<0.01),GSH略升高,無顯著性差異(P>0.05);藍靛果多酚提取物高劑量組MDA明顯降低,GSH、SOD、GSH-Px明顯升高,均有極顯著性差異(P<0.01),見圖11.

圖11 藍靛果多酚提取物對小鼠腎組織GSH、SOD、GSH-Px、MDA的影響Figure 11 Effect of Lonicera caerulea polyphenol extract on GSH, SOD, GSH-Px,MDA in kidney tissue of mice

4 討 論

肝、腎是人體重要代謝組織器官,極易受到外在因素的損傷.急性肝損傷和急性腎損傷是兩種常見的臨床疾病,其發(fā)病率較高,并且治療和護理工作面臨很大的挑戰(zhàn).而藍靛果是一種具有多種藥用和食用價值的中藥材,具有抗氧化、抗炎、保肝保腎等多種藥理作用.近年來,藍靛果的應用備受國內(nèi)外學者關(guān)注,研究方向主要集中在提取方法的優(yōu)化和抗氧化相關(guān)的體外實驗,但是體內(nèi)研究較少,尤其是藍靛果在中藥復方中的應用研究更為缺乏,同時其有效成分的提取和純化技術(shù)難度較大,需要進一步的探索和研究.因此在本研究中,采用單劑量腹腔注射CCl4和順鉑分別構(gòu)建小鼠急性肝損傷、急性腎損傷模型,藍靛果多酚提取物灌胃后,有效緩解急性肝損傷、急性腎損傷小鼠的肝、腎組織病理性順損傷.同時降低肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù),有效緩解細胞的氧化損傷程度,提高機體清除自由基的能力,調(diào)節(jié)肝、腎功能,對急性肝損傷、急性腎損傷具有保護作用,因此藍靛果及其多酚提取物在肝腎疾病的預防、治療方面具有一定的作用,能夠為藍靛果多酚提取物保肝保腎作用的深入研究以及藍靛果健康產(chǎn)品的研發(fā)和臨床應用提供理論依據(jù).