龐哲宇，趙晶晶，萬天麗，李佳俊，楊凌森，周思宇，蘇婷婷

聚苯乙烯降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

龐哲宇，趙晶晶，萬天麗，李佳俊，楊凌森，周思宇，蘇婷婷

（遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001）

石油基廢棄塑料造成的環(huán)境污染已成為人類難以解決的問題，而現(xiàn)有的處理方式既耗能又容易造成二次污染。研究發(fā)現(xiàn)，大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)存在降解塑料的細(xì)菌，可有效加快塑料的降解，分離純化其腸道內(nèi)菌株具有極高的研究價(jià)值。因此，使用生活中常見的聚苯乙烯（PS)包裝盒作為唯一食物來源喂食大蠟螟幼蟲，富集大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)的PS降解菌；經(jīng)解剖、培養(yǎng)、分離，最終獲得4株菌株（PD?1、PD?2、PD?3和PD?4）。將各菌株接種至以PS薄膜為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（MSM培養(yǎng)基）并測(cè)定了其降解率。結(jié)果表明，PD?1對(duì)PS薄膜降解率最高，為1.8%。對(duì)PD?1進(jìn)行菌株形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，鑒定PD?1為腸桿菌科克雷伯氏菌屬（）。同時(shí)，采用紫外或硝酸對(duì)PS薄膜進(jìn)行了預(yù)處理，以期提高菌株降解率。結(jié)果表明，PD?1降解硝酸預(yù)處理的PS薄膜的降解率為2.5%，而對(duì)紫外預(yù)處理的PS薄膜的降解率為0.8%，PS薄膜經(jīng)硝酸預(yù)處理后更易被PD?1降解。

大蠟螟； 聚苯乙烯降解菌； 鑒定； 降解率

塑料作為造福人類的石油化工合成物，在現(xiàn)代卻成為人類難以克服的污染物[1]。隨著塑料生產(chǎn)在全球范圍內(nèi)的大幅擴(kuò)張，所產(chǎn)生的塑料垃圾量也在持續(xù)增加，由于塑料具有高相對(duì)分子質(zhì)量、高疏水性及高化學(xué)鍵能等特點(diǎn)，廢棄塑料制品進(jìn)入自然環(huán)境中極難被降解[2]。進(jìn)入環(huán)境中的廢棄塑料，經(jīng)磨損、物理撞擊、光降解等作用，最終破碎產(chǎn)生大量微塑料，對(duì)生物體造成嚴(yán)重危害，甚至威脅人類健康[3?4]。

目前，雖然可采用一些可降解高分子材料代替?zhèn)鹘y(tǒng)塑料制品，但是這類材料成本較高，且難以大規(guī)模生產(chǎn)，進(jìn)而阻礙其發(fā)展[5?6]。人類對(duì)傳統(tǒng)塑料的依賴程度仍然較高，因此尋求環(huán)保的塑料降解方式迫在眉睫。利用昆蟲代謝長鏈碳?xì)浠衔锏臐摿σ呀?jīng)得到了廣泛證實(shí)，發(fā)現(xiàn)多種昆蟲，包括黃粉蟲、大麥蟲、大蠟螟幼蟲等腸道微生物都具有降解塑料的能力，雖然其體內(nèi)微生物的長鏈烴降解酶和降解機(jī)制尚不清晰，但為開展傳統(tǒng)塑料生物降解研究提供了新思路[7?9]。

大蠟螟是鱗翅目、螟蛾科、蠟螟亞科昆蟲，其幼蟲會(huì)取食蜜蜂巢脾、蛀壞蜂具，危害養(yǎng)蜂業(yè)。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大蠟螟幼蟲腸道內(nèi)含有分解聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）的菌群[10]，且產(chǎn)地不同的昆蟲其腸道內(nèi)菌群具有不同的降解能力[11]；采用紫外與硝酸預(yù)處理PS薄膜，可促使其表面的官能團(tuán)發(fā)生變化，從而改變薄膜的化學(xué)性質(zhì)，使細(xì)菌更易降解PS薄膜[11]。因此，本文通過常見的PS包裝盒喂養(yǎng)大蠟螟幼蟲，誘導(dǎo)其腸道降解菌富集生長，然后提取其腸道內(nèi)的可降解PS菌群，對(duì)其進(jìn)行分離純化鑒定，并通過材料預(yù)處理的方式提高其降解率，以期分離純化出PS高效降解菌株，尋找適合菌株降解PS的預(yù)處理?xiàng)l件，達(dá)到低成本、高效率、無污染地降解塑料制品的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大蠟螟幼蟲采購于天津惠裕德生物科技有限公司，幼蟲生長狀況良好，體長18～30 mm；PS泡沫為常見PS包裝盒。

1.2 試劑和儀器

試劑：KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NH4Cl、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、二氯甲烷、NaCl、蛋白胨、酵母提取物、乙醇（體積分?jǐn)?shù)為75%）、硝酸（體積分?jǐn)?shù)為65%），分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器：DFZ?6020烘箱、TSQ?280恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WFH?203B紫外分析儀，上海高致精密儀器有限公司；AR124CN精確電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；HY?2渦旋震蕩儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LDZX?50KB高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ZKC搖床，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HDL超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DSA100接觸角測(cè)試儀，德國Kruss公司；SU010掃描電子顯微鏡（SEM），日立高新技術(shù)公司。

1.3 培養(yǎng)基的制備

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（MSM培養(yǎng)基）：取KH2PO41.362 g、Na2HPO4·12H2O 3.582 g、NH4Cl 0.330 g、MgSO40.150 g、CaCl21.500 mg、FeSO40.600 mg、MnSO40.330 mg、ZnSO40.600 mg，用無菌水定容至300 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.3。

Luria?Bertani培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：取蛋白胨10.000 g、酵母提取物5.000 g、NaCl 5.000 g，用無菌水定容至1 000 mL。

固體培養(yǎng)基均在上述液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為20.0 g/L的瓊脂制得。

1.4 PS薄膜的制備

將滅菌PS包裝盒粉碎，稱取20 g PS泡沫，在通風(fēng)櫥中用二氯甲烷將其溶解1 h；振蕩混勻后移至平板并覆蓋錫紙，用皮筋固定錫紙；取滅菌大頭針在錫紙表面扎孔，室溫下靜置于通風(fēng)櫥24 h，直至薄膜固化成型；取出薄膜，并裁剪為1 cm×3 cm的長條；放入烘箱烘干后稱重，并用紫外燈滅菌45 min備用。

1.5 大蠟螟幼蟲的飼養(yǎng)

在室溫條件下，對(duì)大蠟螟幼蟲提前進(jìn)行饑餓處理1 d，消耗其體內(nèi)有機(jī)質(zhì)，然后選取生理狀態(tài)良好的幼蟲投喂PS泡沫，培養(yǎng)12 d。在培養(yǎng)過程中，反復(fù)觀察幼蟲的進(jìn)食狀況并挑出蛹化與死亡個(gè)體，避免幼蟲之間發(fā)生啃食現(xiàn)象影響實(shí)驗(yàn)。

1.6 大蠟螟幼蟲腸道微生物的分離、純化及降解率測(cè)定

在超凈工作臺(tái)，將大蠟螟幼蟲浸泡在乙醇溶液中1～2 min滅菌，用無菌棉球把幼蟲表面酒精擦拭干凈，然后用解剖工具將其腸道取出，放入1.5 mL離心管中，加入少量無菌水。利用渦旋震蕩儀震蕩離心管內(nèi)物質(zhì)，使腸道內(nèi)容物充分溶解，靜置15 min后，取3.0 mL菌液接種于MSM培養(yǎng)基，并加入5片PS薄膜作為唯一碳源，然后在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下恒溫培養(yǎng)60 d。待MSM培養(yǎng)基長出菌落，分別挑取新鮮的菌群接種于LB固體培養(yǎng)基，經(jīng)多次劃線培養(yǎng)，分離純化出單菌落。

取上述分離純化出的單菌落，再次接種于以PS為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，震蕩培養(yǎng)60 d，計(jì)算其降解率，同時(shí)設(shè)置一組對(duì)照組（以PS為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基），用相同體積的滅菌水代替菌液（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）。

1.7 菌株的鑒定

菌株形態(tài)學(xué)鑒定：取分離純化后的降解菌株并置于LB固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)特征。

生理生化反應(yīng)特征鑒定：根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的鑒定方法，接種降解菌株于培養(yǎng)基培養(yǎng)，鑒定菌株生理生化特征，確定菌株分類。

分子生物學(xué)鑒定：通過試劑盒提取降解菌株基因，采用16S rRNA常用上游引物27F（5′?CAGAGTTTGATCCTGGCT?3′）和下游引物1492R（5′?AGGAGGTGATCCAGCCGCA?3′）進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果送至上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫同源序列（BLAST）進(jìn)行比對(duì)，選取相似度較高菌株進(jìn)一步做同源分析。用MAGE 7.0對(duì)純化菌株與數(shù)據(jù)庫下載菌株基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹基因相似度比較，結(jié)合降解菌株形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化特征鑒定結(jié)果，確定降解菌株的種屬關(guān)系。

1.8 降解性能驗(yàn)證及降解條件優(yōu)化

選取降解率較高的降解菌，接種1.0 mL菌液于以PS為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下培養(yǎng)30 d，同時(shí)設(shè)置一組對(duì)照組。培養(yǎng)30 d后取出PS薄膜，通過SEM觀察降解菌形態(tài)、生物膜及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理后的薄膜表面狀態(tài)；通過接觸角測(cè)試儀，對(duì)PS薄膜進(jìn)行水接觸角測(cè)定；取1.0 mL菌液均勻涂布于MSM固體培養(yǎng)基表面，然后蓋PS薄膜于培養(yǎng)基上，觀察降解菌生長情況；使用與SEM連接的模塊X光微區(qū)分析（EDS）評(píng)估實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中PS膜表面碳和氧元素含量的差異。

采用硝酸浸泡處理PS薄膜7 d后，用無菌水清洗薄膜并烘干。紫外預(yù)處理PS薄膜60 d，清洗并烘干后使用。分別將0.3 g硝酸預(yù)處理薄膜和紫外預(yù)處理薄膜置于100 mL單菌株和混合菌株的MSM培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下培養(yǎng)30 d，計(jì)算其降解率，篩選降解的優(yōu)化條件。其中，單菌株為篩選出的降解率較高的菌株，混合菌株為篩選出的所有菌株按等濃度比例混合的菌株，對(duì)照組以相同體積的滅菌水代替菌液，其他條件與實(shí)驗(yàn)組一致（實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）。

降解率計(jì)算公式見式（1）。

式中：r為降解率，%；為PS的初始質(zhì)量，g；為PS降解后的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的PS薄膜降解率

經(jīng)平板初篩后最終篩選出4株菌株，分別命名為PD?1、PD?2、PD?3和PD?4。對(duì)4株降解菌的PS薄膜降解率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，PD?1降解率最高，達(dá)到1.8%，其余3株降解菌的PS薄膜降解率均較低，因此選取PD?1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 4株菌株的PS薄膜降解率

2.2 大蠟螟幼蟲腸道降解菌的鑒定

2.2.1 生理生化反應(yīng)特征鑒定

對(duì)PD?1進(jìn)行多項(xiàng)生理生化反應(yīng)特征鑒定，結(jié)果見表1。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步判斷PD?1為腸桿菌科，依托進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)鑒定PD?1菌種，確定其種屬。

表1 生理生化反應(yīng)特征鑒定結(jié)果

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

2.2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

圖2為PD?1的菌落形態(tài)與電鏡照片。

（a）菌落形態(tài) （b）電鏡照片

圖2 PD?1的菌落形態(tài)與電鏡照片

Fig.2 Colony morphology and electron microscopy of strain PD?1

從圖2（a）可以看出，菌株生長得到白色菌落，表面無光澤，質(zhì)軟，有黏性，菌落邊緣光滑完整不透明。從圖2（b）可以看出，電鏡下菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，無芽孢，符合腸桿菌科細(xì)菌形態(tài)特征，與生理生化鑒定結(jié)果相一致。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

基于生理生化反應(yīng)結(jié)果和菌株形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)合PD?1的16S rRNA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步明確菌株種屬。將PD?1基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，下載相似度高的基因序列，采用N?J法，通過MAGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S rRNA 序列的PD?1與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

從圖3可以看出，PD?1與. clone GDKp13菌株的步長高達(dá)94%，說明其親緣關(guān)系非常接近。結(jié)合上述鑒定結(jié)果可知，分離獲得的菌種PD?1即為腸桿菌科克雷伯氏菌屬()。

2.3 降解性能驗(yàn)證

以PS薄膜為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d后，取出PS薄膜，利用掃描電子顯微鏡觀察菌體特征及薄膜表面，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，經(jīng)過PD?1降解后，在PS薄膜表面出現(xiàn)生物膜（見圖4（a）），將膜上的菌落（見圖4（b））沖洗后，發(fā)現(xiàn)薄膜表面（見圖4（c））與對(duì)照組（見圖4（d））相比明顯變得粗糙，產(chǎn)生很多孔洞。由此可知，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，PD?1對(duì)PS薄膜表面產(chǎn)生了降解作用。

取PD?1降解前后的薄膜，并對(duì)其進(jìn)行水接觸角測(cè)定，結(jié)果見圖5（a）。從圖5（a）可以看出，降解后PS薄膜的水接觸角為85.5°±1.6°，而對(duì)照組的水接觸角為93.2°±0.5°，由此可知，PD?1處理后PS膜的疏水性下降。圖5（b）為蓋膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖5（b）可以看出，在以PS薄膜為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基上，PD?1在薄膜四周有明顯生長，而在其他地方未見明顯變化，說明PD?1可利用PS薄膜生長。

通過與掃描電子顯微鏡連接的模塊EDS，分析了PD?1處理前后PS薄膜表面的C、O組成情況，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的C原子數(shù)目無明顯差異，但在實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到的O原子數(shù)目明顯增多，說明PD?1處理后的PS薄膜表面發(fā)生了氧化反應(yīng)，形成了含氧官能團(tuán)，這一現(xiàn)象可能是由于PD?1分泌的某種胞外酶催化降解所引起[12]。這一結(jié)果也解釋了經(jīng)PD?1處理后的PS薄膜水接觸角減小的原因，可能是由于其表面發(fā)生了氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其表面張力降低，表現(xiàn)為疏水性降低。

（a）菌體固定 （b）菌體形態(tài) （c）降解后薄膜 （d）空白對(duì)照

對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組（a）水接觸角分析結(jié)果 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組（b）蓋膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（a）對(duì)照組（O） （b）實(shí)驗(yàn)組（O） （c）對(duì)照組（C） （d）實(shí)驗(yàn)組（C）

2.4 降解條件的篩選

文獻(xiàn)[13-14]的研究結(jié)果表明，硝酸預(yù)處理影響塑料薄膜中C=O和C-H的數(shù)量，從而改變塑料特性，紫外預(yù)處理塑料薄膜同樣影響塑料薄膜中C=O和C-H的數(shù)量，同時(shí)紫外預(yù)處理對(duì)塑料晶型有一定影響，使塑料薄膜表面產(chǎn)生裂紋，更易被細(xì)菌侵占分解。因此，本文采用紫外光和硝酸預(yù)處理PS薄膜，使其更易被微生物降解，然后分別接種PD?1單菌株和混合菌，以期篩選出最佳的PS薄膜降解條件，結(jié)果見表2。由表2可知，在紫外光預(yù)處理?xiàng)l件下，混合菌組的PS薄膜降解率為1.9%，大于對(duì)照組與PD?1單菌株組，說明混合菌組更易降解經(jīng)紫外光預(yù)處理的PS薄膜，而PD?1單菌株組對(duì)紫外光預(yù)處理后PS薄膜的降解率為0.8%，小于其對(duì)PS薄膜處理前的降解率1.8%，說明PD?1不易降解紫外光預(yù)處理后的PS薄膜；PD?1單菌株組對(duì)硝酸預(yù)處理PS薄膜的降解率為2.5%，高于另外兩組，同時(shí)也高于紫外光預(yù)處理下PD?1單菌株組的降解率（0.8%）。因此，PD?1單菌株組更易降解硝酸預(yù)處理后的PS薄膜，混合菌組更易降解紫外光預(yù)處理后的PS薄膜。

表2 紫外光和硝酸預(yù)處理后PS薄膜的降解率

3 結(jié) 論

1）從大蠟螟幼蟲腸道中分離純化出4株P(guān)S降解菌（PD?1、PD?2、PD?3、PD?4），其中PD?1對(duì)PS薄膜的降解率最大，為1.8%，經(jīng)鑒定明確其屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬（）。

2）通過電鏡和水接觸角分別觀察PD?1對(duì)PS薄膜降解前后表面變化情況，進(jìn)一步明確了PD?1具有一定的PS薄膜降解特性，可使其表面形成生物膜，并發(fā)生氧化反應(yīng)，降低其疏水性。

3）硝酸預(yù)處理后的PS薄膜經(jīng)PD?1降解，PS薄膜的降解率達(dá)到2.5%，但經(jīng)紫外光預(yù)處理后PS薄膜的降解率為0.8%，說明紫外光和硝酸預(yù)處理后PS薄膜會(huì)影響降解菌的降解作用，且經(jīng)硝酸預(yù)處理后的薄膜更易被PD?1降解。

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Screening, Identification and Degradation Characteristic of Polystyrene Degrading Bacteria

PANG Zheyu， ZHAO Jingjing， WAN Tianli， LI Jiajun， YANG Lingsen， ZHOU Siyu， SU Tingting

（School of Petrochemical Engineering， Liaoning Petrochemical University， Fushun Liaoning 113001， China）

Pollution caused by petroleum?based plastic products has become a problem that is difficult for human beings to solve, and the existing treatment methods are both energy?consuming and easy to cause secondary pollution. The study found that the bacteria that degrade plastic in the intestines of(Lepidoptera: Pyralidae) larvae can effectively accelerate the degradation of plastics. This experiment uses polystyrene (PS) packaging boxes, which are common in life, as the only food source to feed the larvae of the large wax borer, enriching the PS?degrading bacteria in the intestines of thelarvae. After dissection, culture, and isolation, four strains were obtained: PD?1, PD?2, PD?3 and PD?4. The degradation capacity of MSM culture medium with PS film as the only carbon source was inoculated with each strain, and the degradation rate of PD?1 on PS film was the highest, which was 1.8%. PD?1 was observed by strain morphology, physiological biochemical determination and phylogenetic tree construction, and it was identified as Enterobacter colebella (). Meanwhile, the method of UV and nitric acid pretreatment of PS film were used to improve the degradation rate of the strain, and the results showed that the weight loss rate of PD?1 degradation of nitric acid?treated PS film was improved, which was 2.5%, while the UV group was 0.8%, indicating that PS film was more easily degraded by PD?1 after nitric acid treatment.

； Polystyrene degrading bacteria； Identification； Degradation rate

TQ319

A

10.12422/j.issn.1672?6952.2024.01.003

2023?07?29

2023?09?19

遼寧省博士科研啟動(dòng)基金計(jì)劃項(xiàng)目（2020?BS?229）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110148032）。

龐哲宇（2000?），男，本科生，生物工程專業(yè)，從事高分子材料生物降解研究；E?mail: 1004637526@qq.com。

趙晶晶（1987?），女，博士，講師，從事高分子材料生物降解研究；E?mail: jingjing6180@126.com。

龐哲宇,趙晶晶,萬天麗,等.聚苯乙烯降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J].遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報(bào),2024,44(1):15-20.

PANG Zheyu,ZHAO Jingjing,WAN Tianli,et al.Screening, Identification and Degradation Characteristic of Polystyrene Degrading Bacteria[J].Journal of Liaoning Petrochemical University,2024,44(1):15-20.

（編輯 宋官龍）