斯仁達(dá)來(lái)，何 靜，明 亮，伊 麗，吉日木圖,2,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古中哈駱駝研究院，內(nèi)蒙古 阿拉善 737300）

雙峰駝適應(yīng)干旱和半干旱地區(qū)的嚴(yán)寒、酷暑以及高輻射等惡劣環(huán)境，其養(yǎng)殖和產(chǎn)品加工一直是我國(guó)戈壁沙漠地區(qū)牧民的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源[1-3]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)肉制品消費(fèi)量的增加，高營(yíng)養(yǎng)、優(yōu)品質(zhì)的肉制品得到廣泛重視[4-5]。駝肉是一種高蛋白質(zhì)、低脂肪、低膽固醇，富含多種多不飽和脂肪酸及氨基酸的瘦肉型肉類(lèi)，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的喜愛(ài)[6]。然而，目前對(duì)駝肉品質(zhì)的研究還不夠系統(tǒng)和深入，最佳屠宰年齡的選擇和優(yōu)質(zhì)部位肉的價(jià)值鮮有研究，駝肉的特色營(yíng)養(yǎng)功能尚未被充分挖掘，導(dǎo)致其經(jīng)濟(jì)效益較低，制約了荒漠地區(qū)特色畜牧業(yè)的發(fā)展。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種研究肉類(lèi)科學(xué)的有效方法，利用組學(xué)技術(shù)識(shí)別生物標(biāo)志物以評(píng)價(jià)肉品質(zhì)量，解釋不同肉質(zhì)性狀潛在的生物學(xué)途徑和分子機(jī)制[7-8]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括高通量測(cè)序、蛋白質(zhì)的分離鑒定和生物學(xué)信息的分析。在差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，通常運(yùn)用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分離和鑒定差異蛋白質(zhì)[9]。凝膠電泳在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)[10]，其中差異凝膠電泳技術(shù)比傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的重復(fù)性好，能夠顯著提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。質(zhì)譜技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)鑒定方法，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心部分[12-14]。研究者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白質(zhì)T、肌動(dòng)蛋白質(zhì)、熱休克蛋白質(zhì)（heat shock protein，HSP）β-1、肌酸激酶、肌鈣蛋白質(zhì)C、肌球蛋白質(zhì)重鏈等具有多種抗應(yīng)激功能，這些蛋白質(zhì)與肉品質(zhì)有高度相關(guān)性，可作為肌肉嫩度的生物標(biāo)記物[15-16]。Mao Yanwei等[17]利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究了牛肉的脂肪含量，結(jié)果表明HSPB1與肌肉脂肪沉積高度相關(guān)，可作為肌肉脂肪沉積的標(biāo)志蛋白質(zhì)。Zhang Muhan等[18]研究了不同滴水損失水平的兩組肉樣，成功篩選出與肌肉保水性能有較大關(guān)系的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、代謝酶、抗氧化酶和應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)等21 個(gè)差異蛋白質(zhì)。Joseph等[19]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析牛背最長(zhǎng)肌和腰大肌的顏色穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)肌漿蛋白質(zhì)中差異蛋白質(zhì)含量與肉的顏色相關(guān)，其中抗氧化蛋白質(zhì)和伴侶蛋白質(zhì)含量差異最顯著，可作為2 種肌肉顏色的標(biāo)志蛋白質(zhì)。閆忠心[20]利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）聯(lián)用技術(shù)研究了牦牛宰后不同部位蛋白質(zhì)組的變化，共鑒定出88 個(gè)差異蛋白質(zhì)，結(jié)果表明熱激蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)可以作為牦牛肉不同部位嫩度的標(biāo)志蛋白質(zhì)。因此，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種新興的技術(shù)，能夠探尋蛋白質(zhì)組表達(dá)差異的原因，評(píng)價(jià)宰前宰后各因素對(duì)肉品品質(zhì)的影響，對(duì)提高肉品品質(zhì)具有重要意義。

為了解不同年齡阿拉善雙峰駝肉差異蛋白質(zhì)與品質(zhì)特性的相關(guān)性，進(jìn)而闡明不同年齡駝肉的異質(zhì)性機(jī)制，本研究選取不同年齡組駝肉，采用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析差異蛋白質(zhì)，并進(jìn)行相關(guān)通路富集分析，探討不同年齡組駝肉品質(zhì)差異的機(jī)制，旨在為進(jìn)一步改善駝肉品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駱駝背最長(zhǎng)肌 阿拉善左旗利發(fā)農(nóng)牧業(yè)有限公司。

二硫蘇糖醇、脫氧膽酸鈉、碳酸氫銨、三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）、蛋白質(zhì)酶抑制劑、三氟乙酸、甲酸美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙腈 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；TMT試劑盒、BCA定量試劑盒 美國(guó)Thermo公司；胰蛋白酶 美國(guó)Promega公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙酮 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

uflc-20 A 高效液相色譜儀 日本島津公司；QE-xactive HFX質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司；XBridge BEH C18XP色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國(guó)Waters公司；FS-1200N細(xì)胞超聲破碎儀 蘇州海納科技有限公司；TPS1000恒溫混勻儀 杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；Spectra max 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；13111-V-220渦旋儀 北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

以自然放牧條件下發(fā)育正常、健康的阿拉善雙峰駱駝為研究對(duì)象，選取3～4、6～7 歲和9～10 歲年齡段雄性駱駝（每組3 峰，共9 峰）的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。樣品采集后均置于凍存管中，標(biāo)記編號(hào)并立即放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)至－80 ℃保存。I、II、III分別代表3～4、6～7 歲和9～10 歲年齡組。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 蛋白質(zhì)的提取

3 個(gè)年齡組（I、II和III組）每組3 個(gè)重復(fù)。每個(gè)樣品中提取2 mL蛋白質(zhì)溶液，使用SDT裂解法（加入RIPA工作液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% SDS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NP-40裂解液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%脫氧膽酸鈉、15 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6），在4 ℃、12 000×g離心處理15 min）提取蛋白質(zhì)。

1.3.2.2 肽段酶解

采用FASP酶解法對(duì)提取的蛋白質(zhì)酶解，胰蛋白酶干粉溶于50 mmol/L碳酸氫銨中，按照蛋白∶酶＝50∶1的質(zhì)量比加入胰蛋白酶；用封口膜密封超濾管，置于37 ℃烘箱中孵育16～18 h。之后使用C18固相萃取小柱對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，再進(jìn)一步將樣品凍干后加入體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液進(jìn)行復(fù)溶，隨后BCA法進(jìn)行定量分析。

1.3.2.3 TMT標(biāo)記

按照TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記。

1.3.2.4 反向分級(jí)

將TMT標(biāo)記的每組肽段復(fù)溶后，使用反相超高效液相色譜在堿性條件下進(jìn)行分級(jí)。具體參數(shù)如下：色譜柱：150 mm×2.1 mm（XBridge BEH C18XP）；流動(dòng)相A：10 mmol/L乙酸銨，pH 10；流動(dòng)相B：10 mmol/L乙酸銨，10%水，90%乙腈，pH 10；梯度洗脫程序：0～2 min，95% A、5% B；2～42 min，95%～70% A、5%～30% B；42～52 min，70%～60% A、30%～40% B；52～56 min，60%～10% A、40%～90% B；56～58 min，10% A、90% B；58～60 min，98% A、2% B。1 min收集1 個(gè)組分，持續(xù)循環(huán)收集，合并成12 個(gè)組分，真空干燥后－80 ℃凍存。

1.3.3 LC-MS/MS分析條件

每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)LC-MS/MS液相系統(tǒng)EASY nLC1200進(jìn)行分離后聯(lián)用配備納升離子源的質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。色譜柱采用反相色譜柱（Reprosil Pur 120 C18AQ）（100 μm×15 cm，1.9 μm）。流動(dòng)相采用乙腈-水-甲酸聯(lián)合體系。其中流動(dòng)相A為0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈為2%），B相為0.1%甲酸-80%乙腈溶液（水為20%）。上樣時(shí)，先用流動(dòng)相A平衡色譜柱，再經(jīng)色譜柱梯度分離，流速為300 nL/min，梯度洗脫程序：0～2 min，98%～95% A、2%～5% B；2～70 min，95%～78% A、5%～22% B；70～86 min，78%～55% A、22%～45% B；86～88 min，55%～5% A、45%～95% B；88～90 min，5% A、95% B。

質(zhì)譜分析使用數(shù)據(jù)依賴性采集模式，參數(shù)如下：質(zhì)譜掃描范圍為m/z350～1 600；分辨率：120 k；自動(dòng)增益控制：3×106；最大離子注入時(shí)間：30 ms；四極桿隔離窗口：m/z0.7；標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能為32%；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍固定起點(diǎn)：m/z110；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間：45 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

先對(duì)原始數(shù)據(jù)的缺失值進(jìn)行篩選，TMT保留在所有樣本中均檢測(cè)到的蛋白質(zhì)；其次，對(duì)所屬蛋白質(zhì)的唯一肽段數(shù)進(jìn)行篩選，保留唯一肽段數(shù)≥1。蛋白質(zhì)表達(dá)量在差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.5且P＜0.05時(shí)，表現(xiàn)為上調(diào)，當(dāng)FC＜0.67且P＜0.05時(shí)，表現(xiàn)為下調(diào)[21]。

1.4.2 生物信息學(xué)分析

將鑒定到的不同年齡駝肉蛋白質(zhì)序列與基因本體（Gene Ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)、直系同源集（Cluster of Orthologous Groups，COG）數(shù)據(jù)庫(kù)和亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行比對(duì)，獲得差異蛋白質(zhì)在各數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋信息；再利用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)（www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對(duì)不同年齡組駝肉的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路分析。最后，用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/）分析差異蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)應(yīng)關(guān)系，并運(yùn)用CytoScape軟件（Version 3.2.1）繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡組駝肉蛋白質(zhì)的鑒定和定量

共鑒定到3 421 個(gè)蛋白質(zhì)和23 989 條多肽。唯一肽段數(shù)分布見(jiàn)圖1a，隨著唯一肽段數(shù)目的增多，累計(jì)占比呈現(xiàn)緩慢增多的趨勢(shì)，說(shuō)明鑒定到越來(lái)越多的可靠蛋白，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的要求。分子質(zhì)量在20～120 kDa之間的蛋白占大多數(shù)，其中位于20～40 kDa之間的蛋白最多（圖1b）。多肽長(zhǎng)度分布主要在7～23 個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，隨著長(zhǎng)度增加肽段數(shù)量逐漸減少，表明肽段長(zhǎng)度比較合理，酶切結(jié)果比較理想（圖1c）。蛋白質(zhì)鑒定到的肽段覆蓋率分布如圖1d所示，已鑒定的蛋白質(zhì)序列覆蓋率相對(duì)較低，其中45%蛋白質(zhì)的肽段覆蓋率低于10%。

圖1 不同年齡組駝肉蛋白質(zhì)的鑒定和定量Fig.1 Identification and quantification of proteins in camel meat from different age groups

2.2 不同年齡組駝肉主成分分析（principal component analysis，PCA）

使用SIMCA軟件對(duì)定量的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)和中心化處理，建立PCA模型（圖2）。結(jié)果表明，各組蛋白質(zhì)譜在PC1和PC2方向上存在差異，總貢獻(xiàn)率達(dá)到67.1%。3 個(gè)不同年齡段I、II和III組樣本間有明顯的分離趨勢(shì)，表明3 個(gè)年齡組間蛋白質(zhì)譜有明顯變化，且均有顯著差異。

圖2 不同年齡組駝肉蛋白質(zhì)的PCA得分散點(diǎn)圖Fig.2 PCA score plot of proteins in camel meat from different age groups

2.3 不同年齡組駝肉蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析

由圖3可知，在I vs II組、II vs III組以及I vs III組中，差異蛋白質(zhì)數(shù)分別為245、16 個(gè)和139 個(gè)，其中上調(diào)蛋白質(zhì)分別為194、1 個(gè)和110 個(gè)，下調(diào)蛋白質(zhì)分別為51、15 個(gè)和29 個(gè)。

圖3 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)火山圖Fig.3 Volcano maps of differentially expressed proteins in camel meat from different age groups

從年齡組間觀察到結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、代謝蛋白質(zhì)、細(xì)胞防御和應(yīng)激蛋白質(zhì)的豐度變化較大。年齡主導(dǎo)變化的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)主要有肌動(dòng)蛋白質(zhì)、角蛋白、肌球蛋白質(zhì)、肌鈣蛋白質(zhì)、鋅指蛋白質(zhì)318等；代謝蛋白質(zhì)主要有甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶等。研究表明，這些蛋白質(zhì)與肌肉的嫩度、蒸煮損失和肌肉有序結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[22]。其中，3-磷酸脫氫酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，與ATP的合成密切相關(guān)[23-24]；本研究中3-磷酸脫氫酶在III組中上調(diào)表達(dá)，這可能是大年齡組糖酵解活性較高的原因。有研究表明，肌肉中肌酸激酶含量與其pH值正相關(guān)[25-26]；本研究中肌酸激酶在III組中高表達(dá)，這可能是大年齡肉品質(zhì)變差的主要原因。核糖體RNA加工蛋白7同源物A對(duì)調(diào)節(jié)大腦發(fā)育、神經(jīng)信號(hào)發(fā)生和細(xì)胞增殖起重要作用，本研究中I組中其表達(dá)量為III組的18.06 倍，表明幼齡駱駝機(jī)體需要更多的營(yíng)養(yǎng)素支持肌肉生長(zhǎng)，尤其是大腦發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞增長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)[27]研究結(jié)果一致。鈣/鈣調(diào)蛋白質(zhì)依賴性絲氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase，CASK）對(duì)細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)降解起重要作用，且在肌肉嫩度變化過(guò)程中也發(fā)揮重要的影響[28]，CASK在I組中表達(dá)豐度較高，這也是I組嫩度優(yōu)于III組的主要原因之一。此外，相關(guān)研究表明，HSP能保持肌肉細(xì)胞的完整性，防止肌原纖維蛋白質(zhì)分解，這直接影響肌肉的嫩度[29]，本研究中HSPB7和HSPB8在I組中高表達(dá)。

2.4 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的COG功能分類(lèi)

為分析各組差異蛋白質(zhì)的潛在功能，進(jìn)行了COG功能分析[30]。I vs II 組中（圖4a），差異蛋白質(zhì)的信息主要定位在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（34 個(gè)），細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸（18 個(gè)），脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝（13 個(gè)）等生物學(xué)功能上。II vs III組中（圖4b），差異蛋白質(zhì)的信息主要定位在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸（5 個(gè)），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（3 個(gè)）和脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝（2 個(gè)）等生物學(xué)功能上。I vs III組中（圖4c），差異蛋白質(zhì)的信息主要定位在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（25 個(gè)）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)（18 個(gè)）和細(xì)胞骨架（14 個(gè)）等生物學(xué)功能上。從差異蛋白質(zhì)COG分析可知，差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)與伴侶蛋白，細(xì)胞骨架，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸?shù)裙δ苌稀?/p>

圖4 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)COG分析結(jié)果Fig.4 COG analysis of differentially expressed proteins in camel meat from different age groups

2.5 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析

CELLO亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，I vs II組中的差異蛋白質(zhì)定位到12 個(gè)條目上（圖5a），主要是細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)102 個(gè)、分泌蛋白質(zhì)47 個(gè)、細(xì)胞核蛋白質(zhì)41 個(gè)等；II vs III組中的差異蛋白質(zhì)定位到6 個(gè)條目上（圖5b），主要是細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)5 個(gè)、線粒體蛋白質(zhì)5 個(gè)、細(xì)胞核蛋白質(zhì)3 個(gè)等；I vs III組中的差異蛋白質(zhì)定位到8 個(gè)條目上（圖5c），主要是細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)63 個(gè)、分泌蛋白質(zhì)23 個(gè)、線粒體蛋白質(zhì)11 個(gè)等。從結(jié)果可以看出，不同年齡間差異蛋白質(zhì)主要的細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì)、線粒體和分泌等場(chǎng)所，這有可能導(dǎo)致了不同年齡肌肉之間的品質(zhì)特性差異[31]。

圖5 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析餅狀圖Fig.5 Subcellular localization analysis of differentially expressed proteins in camel meat from different age groups

2.6 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的K-means分析

為研究不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的相對(duì)含量變化趨勢(shì)，對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行K均值（K-means）聚類(lèi)分析[32]。由圖6可知，3 個(gè)年齡組中的差異蛋白質(zhì)相對(duì)含量變化趨勢(shì)可以被歸納成6 個(gè)Cluster。Cluster 1中，678 個(gè)蛋白質(zhì)在I組中的含量最多，而在III組中的含量最低。Cluster 2中，853 個(gè)蛋白質(zhì)在I組中的含量最多，而在II組中的含量最低。Cluster 3中，602 個(gè)蛋白質(zhì)在I組中的含量最多，而在II組中的含量最低。Cluster 4中，394 個(gè)蛋白質(zhì)在II組中的含量最高，而I組中的含量最低。Cluster 5中，399 個(gè)蛋白質(zhì)在III組中的含量最高，而在I組中的含量最低。Cluster 6中，397 個(gè)蛋白質(zhì)在III組中的含量最高，而在II組中的含量最低。

圖6 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的K-means圖Fig.6 K-means plot of differentially expressed proteins in camel meat from different age groups

2.7 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的GO功能分析

GO富集功能分析主要包含分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）三方面功能信息。圖7a和7b分別表示I vs II組和I vs III組差異蛋白質(zhì)富集到的GO功能分類(lèi)（前10 行）；而II vs III組差異蛋白質(zhì)數(shù)量較少，未注釋到GO功能上。GO功能富集分析結(jié)果顯示，在BP分類(lèi)中，差異蛋白質(zhì)主要參與肌肉細(xì)胞發(fā)育、骨骼肌組織發(fā)育、糖酵解過(guò)程、細(xì)胞骨架組織、肌肉纖維發(fā)育等重要等功能。上述與肌肉發(fā)育相關(guān)功能中特別活躍表達(dá)的蛋白質(zhì)有Kelch樣家族蛋白質(zhì)KLHL40和KLHL41，這兩個(gè)蛋白質(zhì)在幼齡肉中高豐度表達(dá)，它們?cè)诿庖邞?yīng)答、骨骼肌維持及大腦發(fā)育等多種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[33]。同時(shí)，磷酸甘油酸激酶、2-磷酸-D-甘油酸氫裂解酶、磷酸甘油酸激酶等代謝蛋白質(zhì)均參與糖酵解過(guò)程、丙酮酸生物合成過(guò)程、嘌呤核苷二磷酸代謝過(guò)程、核糖核苷二磷酸代謝過(guò)程，并在幼齡組中下調(diào)表達(dá)。在CC分類(lèi)中，差異蛋白質(zhì)主要集中在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和蛋白質(zhì)復(fù)合體上。其中線粒體通過(guò)降低高鐵肌紅蛋白質(zhì)含量和氧分壓影響肉色的穩(wěn)定和形成[34]。在MF分類(lèi)中，3 個(gè)年齡組中結(jié)合蛋白質(zhì)和代謝酶活性占優(yōu)勢(shì)，表明這些蛋白質(zhì)對(duì)各年齡駝肉品質(zhì)的變化有顯著影響，尤其是細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白質(zhì)、肌動(dòng)蛋白質(zhì)、磷酸甘油酸激酶活性等功能上顯著性富集。

圖7 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)GO富集分析分類(lèi)圖（前10 行）Fig.7 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins in camel meat from different age groups (Top 10)

綜上所述，不同年齡駝肉差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能有一定差異，這些差異蛋白質(zhì)具有不同的生物學(xué)功能，對(duì)肉品質(zhì)有不同的影響。

2.8 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的KEGG通路分析

KEGG通路顯著性分析以P＜0.05作為顯著性富集的條件。從圖8a和圖9a可知，在I vs II組中KEGG顯著性富集的代謝通路有16 個(gè)，主要有局灶性黏連、嘌呤代謝、磷酸戊糖途徑、半乳糖代謝等。從圖8b和圖9b可知，在II vs III組中KEGG顯著性富集的代謝通路有4 個(gè)，分別為脂肪酸伸長(zhǎng)率，脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，脂肪酸代謝，以上代謝通路的差異對(duì)2 個(gè)年齡肌肉的品質(zhì)差異有很大影響。從圖8c和圖9c可知，在I vs III組中KEGG顯著性富集的代謝通路有8 個(gè)，主要有碳代謝、糖酵解/葡萄糖生成、氨基酸的生物合成、低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路等。研究表明，影響牛肉差異蛋白質(zhì)的信號(hào)通路為HIF-1信號(hào)通路[35-36]，但是HIF-1的表達(dá)被哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路抑制[37]。糖酵解代謝通路可能是形成肉質(zhì)的主要途徑之一，因?yàn)樵撏酚绊懠∪鈖H值的變化，而pH值的變化直接或者間接影響肌肉的色澤、嫩度和保水性等特性。肌肉品質(zhì)和肌原纖維蛋白質(zhì)的表達(dá)均受糖酵解的影響；糖酵解代謝還會(huì)破壞肉色的穩(wěn)定性，影響肌紅蛋白質(zhì)氧化還原的穩(wěn)定性。其中，乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶2在脂肪酸降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解與脂肪酸代謝等通路中顯著富集，并在幼齡肉中下調(diào)表達(dá)。磷酸甘油酸激酶1、烯醇化酶2、磷酸甘油酸激酶2等差異蛋白質(zhì)在碳代謝、糖酵解/葡萄糖生成、氨基酸的生物合成、HIF-1信號(hào)通路等通路上均顯著富集，并在老齡肉中上調(diào)表達(dá)。

圖8 差異蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路柱狀圖Fig.8 Bar chart of KEGG metabolic pathway of differentially expressed proteins

圖9 不同年齡組駝肉差異蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路富集分析氣泡圖Fig.9 Bubble diagram of KEGG metabolic pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins in camel meat from different age groups

綜上分析，每個(gè)年齡組KEGG通路富集的差異蛋白質(zhì)不同，3 個(gè)年齡組差異蛋白質(zhì)的顯著性差異通路主要集中在脂肪酸代謝、糖酵解/葡萄糖生成、氨基酸的生物合成、碳代謝、HIF-1信號(hào)通路等。KEGG通路顯著性分析進(jìn)一步證明，這些差異蛋白質(zhì)的代謝途徑可能是導(dǎo)致不同年齡駝肉品質(zhì)不同的重要原因。

2.9 不同年齡組駝肉差異蛋白PPI分析

利用STRING網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/）分析不同年齡駱駝肉組間差異蛋白質(zhì)的相互作用，并建立PPI網(wǎng)絡(luò)。如圖10所示，在I vs II組中，差異蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)包含30 個(gè)節(jié)點(diǎn)和42 條連線，即30 個(gè)蛋白質(zhì)和42 個(gè)相互作用關(guān)系。其中，核糖體蛋白質(zhì)S2（A0A5N4BZF6）與4 種蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系最強(qiáng)，其余蛋白質(zhì)的互相作用關(guān)系較弱，僅有不超過(guò)2～3 種互作蛋白質(zhì)。

圖10 I vs II組差異蛋白質(zhì)相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.10 Interaction network diagram of differentially expressed proteins in groups I versus II

由圖11可知，在II vs III組中，顯示了4 個(gè)蛋白質(zhì)和6 個(gè)相互作用關(guān)系。對(duì)駝肉品質(zhì)調(diào)節(jié)影響的關(guān)鍵蛋白質(zhì)為S9XIQ2和S9XSI2，其中，S9XSI2蛋白質(zhì)為谷氨酰胺合成酶，對(duì)胎兒皮膚成纖維細(xì)胞增殖至關(guān)重要[38]。這種酶屬于谷氨酰胺合成酶家族，能催化谷氨酰胺和γ-氨基丁酸的產(chǎn)生。

圖11 II vs III組差異蛋白質(zhì)相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.11 Interaction network diagram of differentially expressed proteins in groups II versus III

由圖12可知，在I vs III組中，顯示了29 個(gè)蛋白質(zhì)和53 個(gè)相互作用關(guān)系。其中A0A5N4C1R0與7 種蛋白質(zhì)有互作關(guān)系，S9WZF5、S9WG06、S9Y0N1、A0A5N4C6G2、T0NSQ3和A0A5N4C286蛋白質(zhì)均與3 種蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的互作關(guān)系。A0A5N4C1R0蛋白質(zhì)為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶和亞硝化酶活性，從而分別在糖酵解和核功能中發(fā)揮作用[39]。

2.10 相關(guān)性分析

2.10.1 不同年齡組駝肉品質(zhì)指標(biāo)與顯著差異蛋白的相關(guān)性分析

對(duì)I vs II、II vs III和I vs III組顯著差異蛋白的相對(duì)含量值與課題組之前的研究結(jié)果（剪切力、pH值、亮度L*、紅度a*和黃度b*）進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。如表1所示，篩選獲得與駝肉剪切力極顯著相關(guān)的16 個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中與6 個(gè)差異蛋白質(zhì)正相關(guān)，10 個(gè)差異蛋白質(zhì)負(fù)相關(guān)。pH值與15 個(gè)差異蛋白質(zhì)顯著相關(guān)，其中與9 個(gè)差異蛋白質(zhì)正相關(guān)，6 個(gè)差異蛋白質(zhì)負(fù)相關(guān)。a*與16 個(gè)差異蛋白質(zhì)顯著相關(guān)，其中與6 個(gè)差異蛋白質(zhì)正相關(guān)，10 個(gè)差異蛋白質(zhì)負(fù)相關(guān)。此外，L*僅與差異蛋白質(zhì)S9Y0N1顯著相關(guān)（r＝0.867；P＜0.01），而b*僅與差異蛋白質(zhì)S9Z0D9顯著相關(guān)（r＝0.728，P＜0.05）。結(jié)果表明，肉品質(zhì)指標(biāo)剪切力、pH值和a*主要受結(jié)構(gòu)蛋白的影響，主要與A0A5N4DJL3、A0A5N4E8Z5、A0A5N4CQI7、S9XGN3、T0NQR8、S9WZF5、A0A5N4CP29等差異蛋白有顯著相關(guān)性。肌球蛋白質(zhì)、肌鈣蛋白質(zhì)、肌動(dòng)蛋白質(zhì)、角蛋白質(zhì)等與肌肉嫩度、蒸煮損失等品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)。也有研究表明，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、肌鈣蛋白質(zhì)和肌球蛋白質(zhì)等與肌肉的有序結(jié)構(gòu)相關(guān)[22]。

表1 顯著差異蛋白質(zhì)與不同年齡組駝肉品質(zhì)的相關(guān)性分析Table 1 Pearson’s correlation between significantly differentially expressed proteins and quality traits of camel meat from different age groups

2.10.2 不同年齡組駝肉顯著相關(guān)差異蛋白質(zhì)分析

由表2可知，16 種與駝肉品質(zhì)指標(biāo)顯著相關(guān)性的差異蛋白質(zhì)的相對(duì)定量值在不同年齡組之間存在顯著差異，這些顯著差異蛋白質(zhì)可能是影響I、II與III組肉品質(zhì)特征的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。I組中差異蛋白質(zhì)A0A5N4C1R0、A0A5N4E8Z5、A0A5N4C9P6和S9Z0D9相對(duì)定量值顯著小于II和III組（P＜0.05），與II和III組相比相對(duì)定量值表達(dá)為下調(diào)。此外，I組中差異蛋白A0A5N4EHM9、A0A5N4DJL3、A0A5N4CQI7、S9XF73、S9XGN3、T0NQR8、S9YDB6、S9Y0N1、S9XPU1、A0A5N4CP29相對(duì)定量值顯著高于II和III組（P＜0.05），與II和III組相比相對(duì)定量值表達(dá)為上調(diào)。因此，與II和III組相比，可能是在I組中顯著相關(guān)差異關(guān)鍵蛋白A0A5N4C1R0、A0A5N4E8Z5、A0A5N4CLT3、A0A5N4C9P6、S9Z0D9和S9WZF5的相對(duì)含量下降引起剪切力下降，使其具有較好的嫩度。

表2 顯著相關(guān)差異蛋白質(zhì)的相對(duì)定量值與表達(dá)方式Table 2 Relative quantitative values and expression patterns of differentially expressed proteins significantly correlated with meat quality traits

3 結(jié)論

采用TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)與LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)研究駝肉不同年齡蛋白質(zhì)組的變化。蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)是造成駝肉不同年齡肉品質(zhì)差異的重要因素。3 個(gè)年齡組中共鑒定出311 種差異蛋白質(zhì)；結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、代謝蛋白質(zhì)和熱應(yīng)激蛋白質(zhì)可以作為駝肉不同年齡的標(biāo)志蛋白質(zhì)；其中差異蛋白質(zhì)主要參與了脂肪酸代謝、糖酵解/葡萄糖生成、氨基酸的生物合成和HIF-1信號(hào)通路；PPI分析表明，代謝酶類(lèi)蛋白質(zhì)是影響駝肉的關(guān)鍵連接蛋白質(zhì)。同時(shí)，本研究還篩選出鋅指蛋白、組蛋白、肌動(dòng)蛋白等16 個(gè)與駝肉嫩度有著強(qiáng)相關(guān)性的差異蛋白質(zhì)。研究結(jié)果探討了造成不同年齡駝肉品質(zhì)差異的機(jī)制，可為進(jìn)一步研究駝肉品質(zhì)的改善提供理論參考。