倪 丹，蔣新元 ，唐玉蓮，何思宜，楊迎舟

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)理學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

酪氨酸酶又稱(chēng)多酚氧化酶，是一種廣泛分布于微生物、動(dòng)物和植物中的含銅氧化酶[1]。作為催化黑色素生成的關(guān)鍵限速酶，酪氨酸酶的異常表達(dá)會(huì)造成黑色素過(guò)度堆積[2]，從而導(dǎo)致皮膚色素沉著障礙如雀斑、老年斑、黃褐斑甚至惡性黑色素瘤[3]。此外，酪氨酸酶還參與水果和蔬菜的酶褐變，通常導(dǎo)致這些產(chǎn)品的色澤和感官特性改變，從而顯著降低產(chǎn)品的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。因此，酪氨酸酶抑制劑在食品工業(yè)中可用作食品防腐劑，在醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域可用作皮膚美白劑[5]。雖然在文獻(xiàn)中已報(bào)道了許多天然和合成的酪氨酸酶抑制劑，如熊果苷、對(duì)苯二酚、抗壞血酸和曲酸等[6]，但由于其受抑制效率低、耐藥性強(qiáng)和安全性低等限制，目前廣泛應(yīng)用的僅有熊果苷和抗壞血酸。

近年來(lái)，多酚類(lèi)化合物因其廣泛的生物活性備受關(guān)注。鞣花酸（ellagic acid，EA）作為一種天然多酚，具有抗癌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9]和美白[10]等多重生理活性，目前廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域。楊笑笑等[11]發(fā)現(xiàn)EA對(duì)酪氨酸酶具有強(qiáng)抑制作用，可以同時(shí)抑制酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶的活性。Yang等[12]利用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了EA對(duì)酪氨酸酶的抑制活性。Solimine等[13]從玫瑰油蒸餾后的廢水中分離出EA，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用是陽(yáng)性對(duì)照曲酸的10 倍左右，且屬于混合抑制類(lèi)型。明確抑制劑的抑制機(jī)制能夠深入了解酶的結(jié)構(gòu)和功能，驗(yàn)證抑制劑的選擇性和效力，Garcia-Jimenez等[14]發(fā)現(xiàn)脫氧熊果苷、β-熊果苷能明顯地競(jìng)爭(zhēng)性抑制蘑菇酪氨酸酶活性，并且通過(guò)氫鍵和疏水作用力與酶中心的銅離子結(jié)合。趙美娟[15]發(fā)現(xiàn)L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)酪氨酸酶顯示出可逆反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，并且與酶活性中心形成氫鍵、范德華力相互作用。曲酸可以與酪氨酸酶活性位點(diǎn)內(nèi)的銅離子螯合使酶失活，同時(shí)可以抑制蘋(píng)果切片中的酶促褐變[16]。然而，目前鮮有對(duì)EA抑制酪氨酸酶及其機(jī)制的系統(tǒng)研究。

在不同的酪氨酸酶來(lái)源中，雙孢蘑菇酪氨酸酶與人類(lèi)酪氨酸酶具有較高的相似性和同源性，是酪氨酸酶的主要廉價(jià)來(lái)源[17]。然而有報(bào)道稱(chēng)，蘑菇酪氨酸酶和人酪氨酸酶在選擇性和功效上存在顯著差異[18]，以不同來(lái)源酪氨酸酶為靶點(diǎn)研究酪氨酸酶抑制劑具有不同的效果和應(yīng)用價(jià)值。因此，尋找高效的酪氨酸酶抑制劑并且明確其抑制機(jī)制具有重要意義。因此，本研究以蘑菇酪氨酸酶為靶點(diǎn)，通過(guò)動(dòng)力學(xué)分析、熒光光譜法探究EA對(duì)酪氨酸酶的抑制與互作機(jī)理，同時(shí)結(jié)合分子對(duì)接模擬進(jìn)行驗(yàn)證補(bǔ)充，采用實(shí)驗(yàn)結(jié)合理論的方法，從分子水平綜合分析EA對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制機(jī)理，以期為EA在食品工業(yè)中作為保鮮劑的各種應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EA（純度≥98%）西安皓源生物技術(shù)有限公司；雙孢蘑菇酪氨酸酶（1 240 U/mg）、L-酪氨酸（分析純）合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1510酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾儀器有限公司；PHS-25 pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科技儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EA儲(chǔ)備液的配制

稱(chēng)取一定量EA，溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），定容配制1.00 mg/mL的儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存，避光，根據(jù)需要用DMSO或超純水稀釋?zhuān)w外抑制酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)、抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的EA工作液用DMSO稀釋?zhuān)黄渌庾V實(shí)驗(yàn)的EA工作液用超純水稀釋。

1.3.2 酪氨酸酶抑制作用測(cè)定

參照??hreto?lu等[19]的方法，稍作修改。分別用pH 6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制200 U/mL酪氨酸酶溶液、2 mmol/LL-酪氨酸溶液。反應(yīng)在96 孔細(xì)胞板上進(jìn)行，每組8 孔，對(duì)照溶液和試樣溶液分別設(shè)3 孔、對(duì)照空白溶液和試樣空白溶液分別設(shè)1 孔。加樣步驟見(jiàn)表1，細(xì)胞板上依次加入酪氨酸酶、pH 6.8 PBS、DMSO和樣品溶液，37 ℃恒溫10 min；然后將底物溶液加入各孔，隨即放入酶標(biāo)儀內(nèi)，反應(yīng)5 min，測(cè)定在475 nm波長(zhǎng)處的吸光度，抑制率計(jì)算如式（1）所示。熊果苷作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)3 組平行。

表1 反應(yīng)液組成與體積Table 1 Compositions and volumes of reaction solutions

式中：A1為對(duì)照溶液的吸光度；A2為對(duì)照空白溶液的吸光度；A3為試樣溶液的吸光度；A4為試樣空白溶液的吸光度。

1.3.3 酪氨酸酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

按照上述步驟，固定底物L(fēng)-酪氨酸質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，改變EA質(zhì)量濃度為0、0.02、0.05、0.10 mg/mL，分別與50、100、150、200 U/mL酪氨酸酶進(jìn)行反應(yīng)，以酪氨酸酶濃度（U/mL）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速率V（ΔOD475nm/min）為縱坐標(biāo)作圖，分析EA對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是否可逆。同樣固定酪氨酸酶濃度為200 U/mL，改變EA質(zhì)量濃度為0、0.02、0.05、0.10 mg/mL，分別與0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mLL-酪氨酸進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，以底物L(fēng)-酪氨酸質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S])為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速率倒數(shù)（1/[V]）為縱坐標(biāo)作圖，以確定EA對(duì)酪氨酸酶抑制類(lèi)型[20]。EA抑制酪氨酸酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過(guò)Lineweaver-Burk方程（式（2））計(jì)算：

式中：V為在不同質(zhì)量濃度底物L(fēng)-酪氨酸下的初始反應(yīng)速率/（ΔOD475nm/min）；Vmax為最大反應(yīng)速率/（ΔOD475nm/min）；Km為米氏常數(shù)/（mg/mL）；[S]為底物L(fēng)-酪氨酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 熒光光譜猝滅分析

參照Li Xiangrong等[21]的方法進(jìn)行，略有修改。用pH 7.4 PBS配制50 U/mL酪氨酸酶溶液。在10 mL PE管中分別添加50 U/mL酪氨酸酶溶液2.00 mL、不同濃度EA稀釋液2.00 mL和pH 7.4 PBS 1.00 mL，搖勻，將混合液分別在25、31、37 ℃下保溫1 h，待測(cè)。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5.0 nm，掃描速率為1 200 nm/min，記錄待測(cè)液在300～450 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

EA溶液有很弱的熒光發(fā)射信號(hào)，基本不會(huì)對(duì)酪氨酸酶熒光信號(hào)造成干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)可忽略“內(nèi)部濾波效應(yīng)”的干擾。熒光猝滅率（η）用式（3）計(jì)算：

式中：F0和F分別為添加不同濃度EA稀釋液前后酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度。

1.3.5 同步熒光光譜分析

溶液配制方法同1.3.4節(jié)，將混合液在37 ℃下保溫1 h，設(shè)置實(shí)驗(yàn)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的差值Δλ為15 nm，測(cè)定反應(yīng)體系在270～350 nm的同步熒光光譜；同時(shí)，設(shè)置Δλ為60 nm，測(cè)定反應(yīng)體系在260～320 nm的同步熒光光譜，EA終濃度與熒光猝滅實(shí)驗(yàn)終濃度一致。用式（4）計(jì)算同步熒光猝滅率：

1.3.6 三維熒光光譜分析

酪氨酸酶溶液（2.00 mL、50 U/mL）、EA溶液（2.00 mL、10.00 mg/L）和pH 7.4 PBS 1 mL充分混合，在37 ℃下保溫1 h，空白溶液代表純酪氨酸酶溶液。在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)范圍分別為200～340 nm和250～420 nm、增量5 nm的條件下測(cè)定三維熒光光譜。

1.3.7 分子對(duì)接模擬

從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取雙孢蘑菇酪氨酸酶（PDB編號(hào)：2Y9X；分辨率：2.78 ?）的X射線結(jié)構(gòu)[22]，EA、L-酪氨酸結(jié)構(gòu)來(lái)自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（EA編號(hào)：5 281855；L-酪氨酸編號(hào)：6057）。根據(jù)酪氨酸酶特殊的四聚體結(jié)構(gòu)，保留A鏈進(jìn)行對(duì)接模擬[23]。用AutoDockTools（Ver 1.5.7）軟件將酪氨酸酶進(jìn)行除水、加氫、加Kollman電荷、并去除原有配體小分子OTR；同時(shí)將EA進(jìn)行加氫操作。以A鏈作為對(duì)接鏈，設(shè)置網(wǎng)格框（x＝84、y＝88和z＝126，格點(diǎn)數(shù)為1.000），以覆蓋所有位點(diǎn)。以最低能量確定最優(yōu)對(duì)接構(gòu)型，用Pymol軟件[24-25]呈現(xiàn)分子對(duì)接三維圖，并用Ligplot＋軟件[26]分析相互作用力。按相同方法進(jìn)行底物L(fēng)-酪氨酸與酪氨酸酶、EA與底物-酪氨酸酶復(fù)合物的對(duì)接。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均3 次平行，利用SPSS 22軟件進(jìn)行顯著性分析和IC50計(jì)算，P＜0.05，差異顯著。采用Microsoft Excel 2016、Origin 2022軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 EA對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

EA對(duì)酪氨酸酶的抑制可以通過(guò)IC50體現(xiàn)，以EA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線[27]。由圖1可知，在相同溶劑下，EA和熊果苷在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)酪氨酸酶有明顯的抑制效果，且抑制率和質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)計(jì)算，EA的IC50為0.05 mg/mL，明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照熊果苷（IC50＝13.13 mg/mL），說(shuō)明EA能夠明顯抑制酪氨酸酶活性。

圖1 EA（A）和熊果苷（B）對(duì)酪氨酸酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of EA (A) and arbutin (B) on tyrosinase

2.2 EA對(duì)酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)

2.2.1 EA對(duì)酪氨酸酶抑制可逆性分析

為了分析EA對(duì)酪氨酸酶抑制作用的可逆性，分別構(gòu)建了不同質(zhì)量濃度EA的反應(yīng)初速率（V）與酪氨酸酶濃度的曲線圖。由圖2可知，4 條擬合曲線均交于原點(diǎn)，隨著EA質(zhì)量濃度的升高，曲線斜率越來(lái)越小，說(shuō)明EA能夠降低酪氨酸酶催化底物生成多巴色素的速率，但不能使酪氨酸酶完全失活，因此推測(cè)EA對(duì)酪氨酸酶是可逆抑制[28]。

圖2 不同質(zhì)量濃度EA抑制酪氨酸酶活性可逆性判斷圖Fig.2 Determination of the reversibility of tyrosinase activity inhibition by EA at different concentrations

2.2.2 EA對(duì)酪氨酸酶抑制類(lèi)型分析

由圖3和表2可知，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線方程作圖，得到了一組相交于第2象限的直線，隨著EA質(zhì)量濃度的增大，Vmax不斷減少，Km不斷增大，所以推測(cè)EA對(duì)酪氨酸酶的抑制類(lèi)型屬于混合型抑制[29]，此結(jié)果與Solimine等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。對(duì)直線的斜率和垂直截距對(duì)EA質(zhì)量濃度進(jìn)行二次作圖，KI和KIS分別為0.2 mg/mL和0.32 mg/mL，結(jié)合常數(shù)KI＜KIS，說(shuō)明EA與游離酶的結(jié)合比與酶-底物復(fù)合物的結(jié)合更容易且更緊密[30]。EA一方面通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用與酪氨酸酶結(jié)合，另一方面通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用與底物-酪氨酸酶復(fù)合物結(jié)合，說(shuō)明EA對(duì)酪氨酸酶抑制類(lèi)型是一種競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合型抑制。圖3B、C二次圖均是線性擬合，表明EA與酪氨酸酶有1 個(gè)或1 類(lèi)抑制位點(diǎn)[31]。

圖3 不同質(zhì)量濃度EA對(duì)酪氨酸酶抑制的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線（A）和斜率（B）、垂直截距（C）對(duì)EA質(zhì)量濃度的二次圖Fig.3 Lineweaver-Burk double reciprocal curves of tyrosinase inhibition by EA at different concentrations (A),slope (B) and vertical intercept (C) versus EA concentration plots

表2 EA對(duì)酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)和參數(shù)Table 2 Inhibitory kinetics and parameters of EA on tyrosinase

2.3 EA對(duì)酪氨酸酶的熒光光譜猝滅分析

2.3.1 EA對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅效應(yīng)

由圖4可知，酪氨酸酶溶液的最大熒光峰發(fā)射波長(zhǎng)為347 nm，EA對(duì)酪氨酸酶的熒光具有特異性猝滅作用。在酪氨酸酶濃度一定的情況下，熒光強(qiáng)度隨EA濃度增加呈現(xiàn)規(guī)律性降低，并且峰形不變，最大吸收峰沒(méi)有明顯的紅移或藍(lán)移。生理?xiàng)l件下（pH 7.4），當(dāng)EA濃度為13.33 μmol/L時(shí)，其在25、31、37 ℃對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅率分別為62.18%、58.66%、58.13%，表明EA與酪氨酸酶熒光發(fā)色團(tuán)結(jié)合，有效猝滅酶的內(nèi)源熒光。

圖4 25（A）、31 ℃（B）和37 ℃（C）下EA對(duì)酪氨酸酶的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectrum of EA on tyrosinase at 25 (A),31 (B) and 37 ℃ (C)

2.3.2 EA對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)制

為了確定猝滅機(jī)制，采用Stern-Volmer方程（式（5））計(jì)算熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)：

式中：Kq為速率常數(shù)/（L/（mol·s））；[Q]為EA濃度/（mol/L）；Ksv為猝滅常數(shù)/（L/mol）；τ0為EA不存在時(shí)酪氨酸酶的平均壽命（τ0＝10－8s）。

由圖5A可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Stern-Volmer圖呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；隨著溫度升高，Ksv降低；同時(shí)，Kq遠(yuǎn)大于2.0×l010L/（mol·s）（最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)）[32]，說(shuō)明猝滅是由EA-酪氨酸酶復(fù)合物形成引起的靜態(tài)猝滅[33]。

圖5 不同溫度下EA猝滅酪氨酸酶的Stern-Volmer圖（A）和雙對(duì)數(shù)圖（B）Fig.5 Stern-Volmer plots (A) and double logarithmic plots (B) oftyrosinase quenching by EA at different temperatures

2.3.3 EA與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

EA與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可根據(jù)雙對(duì)數(shù)方程[34]（式（6））計(jì)算：

式中：Ka為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

通過(guò)lg[Q]與lg（（F0－F）/F）求得3 個(gè)溫度下的Ka和n值，如圖5B和表3所示，25、31、37 ℃時(shí)結(jié)合常數(shù)Ka分別為3.00×104、3.32×104、3.64×104L/mol，表明EA與酪氨酸酶之間有較強(qiáng)的結(jié)合能力。在所研究溫度范圍內(nèi)，Ka隨溫度的升高而增大，表明復(fù)合物隨著溫度升高，穩(wěn)定性越好。3 個(gè)溫度下結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值都約為1，表明EA在酪氨酸酶只有1 個(gè)或者1 類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)，此結(jié)果與酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 不同溫度EA與酪氨酸酶結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)n以及熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Binding constant (Ka),number of binding sites (n) and thermodynamic parameters of interaction between EA and tyrosinase at different temperatures

2.3.4 EA與酪氨酸酶結(jié)合的相互作用力

熱力學(xué)參數(shù)可以根據(jù)公式（7）、（8）計(jì)算[35]：

式中：ΔG為結(jié)合自由能變化/（kJ/mol）；Ka為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；ΔH為結(jié)合焓變/（kJ/mol）；T為反應(yīng)溫度/K；ΔS為結(jié)合熵變/（J/（mol·K））；R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））。

由表3可知，ΔG＜0，說(shuō)明生成EA與酪氨酸酶的結(jié)合是自發(fā)的；ΔH＞0且ΔS＞0，說(shuō)明反應(yīng)吸熱，結(jié)合相互作用力主要表現(xiàn)為疏水作用力，但是考慮到酪氨酸酶結(jié)構(gòu)很復(fù)雜及EA具有多酚羥基，推測(cè)EA與酪氨酸酶結(jié)合過(guò)程中，可能還存在氫鍵等幾種作用力的協(xié)同結(jié)果[36]。

2.4 EA對(duì)酪氨酸酶的同步熒光光譜分析

通過(guò)固定激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)之間的間距（Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm），同時(shí)對(duì)激發(fā)和發(fā)射單色器進(jìn)行掃描所得到的光譜，分別反映蛋白質(zhì)中親水性氨基酸Tyr殘基和疏水性氨基酸Trp殘基的熒光特性[37]。如圖6A所示，隨著EA的加入，酪氨酸酶在Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm處熒光強(qiáng)度有規(guī)律地減弱，說(shuō)明EA與酪氨酸酶中的兩殘基存在結(jié)合作用，導(dǎo)致兩殘基含量降低，與熒光猝滅結(jié)果對(duì)應(yīng)。加入EA后，Tyr殘基的最大熒光發(fā)射峰沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)，而Trp殘基的最大熒光發(fā)射峰由288.0 nm紅移至290.0 nm，推測(cè)EA改變了Trp殘基附近的微環(huán)境，使其暴露在親水環(huán)境中，微環(huán)境極性增強(qiáng)，不利于酪氨酸酶催化反應(yīng)優(yōu)勢(shì)構(gòu)象的形成，從而使酪氨酸酶活性受到抑制[38]。如圖6B所示，在同樣的EA濃度下，Trp的猝滅率普遍高于Typ，說(shuō)明Trp殘基對(duì)熒光猝滅過(guò)程中的貢獻(xiàn)更大，EA的結(jié)合位點(diǎn)更靠近酪氨酸酶的Trp殘基[39]。

圖6 不同濃度EA存在下酪氨酸酶的同步熒光光譜（A）和EA-酪氨酸酶反應(yīng)體系同步熒光猝滅率對(duì)比（B）Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of tyrosinase in the presence of different concentrations of EA (A) and comparison of synchronous fluorescence quenching rates of EA-tyrosinase reaction system at various differences between excitation and emission wavelengths (B)

2.5 EA對(duì)酪氨酸酶的三維熒光光譜分析

由圖7可知，加入EA后，酪氨酸酶熒光峰的強(qiáng)度由140.1下降至63.4，激發(fā)波長(zhǎng)由280.0 nm紅移至285.0 nm，這說(shuō)明EA的加入改變了酪氨酸酶構(gòu)象，復(fù)合物的形成使得熒光基團(tuán)的微環(huán)境極性增大，疏水能力減弱[40]，這與同步熒光光譜分析結(jié)果一致。

2.6 EA與酪氨酸酶相互作用的分子對(duì)接模擬分析

根據(jù)分析對(duì)接模擬結(jié)果，EA與酪氨酸酶的最佳構(gòu)象ΔG為－7.2 kcal/mol（－30.1 kJ/mol），這與37 ℃（ΔG＝－27.08 kJ/mol）熒光結(jié)果相近，說(shuō)明分子對(duì)接結(jié)果中EA在酪氨酸酶中結(jié)合位點(diǎn)可靠。如圖8A、B所示，EA分子鑲嵌于酪氨酸酶的活性中心口袋的催化腔中，并且與周?chē)陌被嵝纬上嗷プ饔谩? 個(gè)氨基酸殘基Tyr311、Gln307、Trp358、Lys376、Asp357組成的空腔緊密包裹EA小分子，與EA小分子產(chǎn)生疏水作用，減少了水的介入，有利于形成穩(wěn)定的復(fù)合物。由圖8C可知，氨基酸殘基Glu356、Asp312、Thr308、Lys379分別與EA形成6 個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)分別為2.91、2.91、2.80、3.32、2.67、3.22 nm，短氫鍵的形成極大地促進(jìn)EA與酪氨酸酶形成復(fù)合物，降低了酪氨酸酶的活性以及酶催化底物的能力[18]。如圖8D和表4所示，L-酪氨酸與酪氨酸酶對(duì)接結(jié)果中，位于b處的底物與EA在酪氨酸酶活性中心的位置高度重合；底物和EA競(jìng)爭(zhēng)與酪氨酸酶的Tyr311、Trp358發(fā)生疏水相互作用力，同時(shí)，底物和EA競(jìng)爭(zhēng)與酪氨酸酶的Asp312產(chǎn)生氫鍵，說(shuō)明底物對(duì)酪氨酸酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制特性[41]。如圖8E所示，EA能夠與底物-酪氨酸酶結(jié)合形成三元復(fù)合物，說(shuō)明底物對(duì)酪氨酸酶也具有非競(jìng)爭(zhēng)抑制特性。綜上，分子對(duì)接形象地表明EA對(duì)酪氨酸酶屬于混合型抑制類(lèi)型，既可以和游離酶結(jié)合，又可以與酶-底物復(fù)合物結(jié)合[42]；EA主要通過(guò)疏水作用力和氫鍵與游離酶或酶-底物復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，降低了酪氨酸酶銅離子協(xié)調(diào)酶活性的能力，導(dǎo)致酶活性受到抑制，分子對(duì)接驗(yàn)證并補(bǔ)充了上述光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8 EA與酪氨酸酶最佳結(jié)合姿態(tài)的空間結(jié)構(gòu)圖Fig.8 Spatial structure diagram of the optimal binding posture of EA with tyrosinase

表4 酪氨酸酶與EA及其底物的分子對(duì)接相互作用數(shù)據(jù)Table 4 Data of molecular docking interactions of tyrosinase with EA and/or its substrates

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了EA對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，并利用抑制動(dòng)力學(xué)、熒光光譜分析結(jié)合分子對(duì)接模擬技術(shù)，系統(tǒng)研究了EA抑制蘑菇酪氨酸酶的分子機(jī)制。體外抑制結(jié)果顯示，EA對(duì)酪氨酸酶有明顯抑制效果，且存在劑量依賴(lài)性。抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，EA對(duì)酪氨酸酶的抑制作用表現(xiàn)為可逆的混合型抑制類(lèi)型，EA與游離酶的結(jié)合比與酶-底物復(fù)合物的結(jié)合更緊密。熒光光譜猝滅分析表明，EA對(duì)酪氨酸酶存在靜態(tài)猝滅作用，兩者主要通過(guò)疏水作用力形成EA-酪氨酸酶復(fù)合物，只有1 個(gè)或1 類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)。同步和三維熒光光譜分析表明，EA使酪氨酸酶的微環(huán)境極性增大，疏水能力減弱，酪氨酸酶的疏水性氨基酸Trp殘基更靠近結(jié)合位點(diǎn)。分子對(duì)接模擬分析補(bǔ)充驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，形象地表明EA對(duì)酪氨酸酶屬于混合抑制類(lèi)型，EA主要通過(guò)疏水作用力和氫鍵與游離酶或酶-底物復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，最終導(dǎo)致酶活性受到抑制。本研究聚焦于EA作為食品保鮮劑對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制活性及分子機(jī)制，但缺乏應(yīng)用可行性和安全性評(píng)估，未來(lái)需要對(duì)其進(jìn)行鮮切果蔬抗褐變實(shí)驗(yàn)或南美白對(duì)蝦保鮮實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其在食品保鮮領(lǐng)域中的作用功效；同時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞水平或動(dòng)物水平的安全性評(píng)價(jià)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其應(yīng)用前景。