劉夢奇，閆珍珍，胡 娜，陳 雄，李 欣

（湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種重要的產香食品酵母，在醬油釀造中發(fā)揮著重要作用[1-3]，也是食品腐敗微生物之一[4]。長期以來，魯氏接合酵母具備兩種截然相反的特點，對高濃度鹽的高耐受性和對高溫的高敏感性。該酵母的耐鹽機理備受研究者的關注，明確了高鹽下酵母細胞的生理變化特點，篩選和鑒定出一系列耐鹽相關基因和蛋白[5-7]。然而，魯氏接合酵母耐溫、耐鹽特性差異研究較少，影響了雙重抗性優(yōu)良菌株的構建。

微生物對逆境的響應機理研究對理解微生物與環(huán)境的互作[8]和構建高水平或新性狀菌株[9]非常重要。作為食品釀造中常見的微生物，酵母細胞逆境響應機制研究采用兩種策略。第1種策略聚焦模式酵母細胞，主要是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[10-12]，以期獲得普遍性的酵母耐受機制；第2種策略圍繞具有特異性狀的酵母物種，如馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）[13-14]、魯氏接合酵母[15-16]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等[17-18]，探索特定種屬酵母的獨特的耐受機制。在各種逆境中，除了高濃度的不同外源物外（如乙酸、乳酸、高糖等）[19-23]，作為環(huán)境基本參數之一的溫度是研究工作者持續(xù)關注的壓力因子。針對這些環(huán)境壓力，研究者們從基因、轉錄、蛋白和生理等不同層面和視角分析了酵母細胞對逆境的響應[24-27]。作為酵母對外界環(huán)境響應的重要一環(huán)，逆境調控基因，如HSF1（熱休克轉錄因子1）、MSN2/MSN4（SNF1突變蛋白2和4的多重拷貝抑制子）、HOG1（有絲分裂原激活蛋白激酶）和SOD1（超氧化物歧化酶1）的變化決定了細胞的生理狀態(tài)和參與特定環(huán)境響應的基因集。雖然HSF1p是典型的熱激蛋白，但當釀酒酵母遭遇甲萘醌刺激后，該蛋白充當了細胞拯救基因的激活劑，通過維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和蛋白穩(wěn)定避免細胞的氧化損傷[28]。作為靜止期糖酵解基因的主要調節(jié)因子，MSN4的缺失顯著減少了釀酒酵母對熱激的響應或降低NaCl誘導的NTH1活性，并且下調高滲透脅迫條件下細胞乙二醛酶I（glyoxalase 1，GLO1）的表達水平[29-31]。HOG1對細胞在逆境下的存活至關重要。HOG1基因的失效會增強海洋酵母漢斯德巴氏酵母（Debaryomyces hansenii）對高濃度NaCl的敏感性[32]。過表達HOG1提高了釀酒酵母SPSC01對逆境的耐受能力以及生物乙醇的產量[33]。對SOD1基因而言，該基因的缺失可顯著改變釀酒酵母細胞應答真菌細胞壁抑制劑CFW（Calcofluor Write）脅迫的全基因組轉錄表達譜[34]，同時降低釀酒酵母細胞在高溫和高滲透壓逆境下的耐受性[35]。然而，這些逆境調控基因在魯氏接合酵母適應不利環(huán)境時的作用尚未可知。此外，耐溫機制研究中所普遍采用的短時間高溫刺激[36-39]并不能真實反映釀造過程中魯氏接合酵母所遭遇的長時間高溫壓力。同時，在絕大部分研究中使用的酵母細胞通用培養(yǎng)基為酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD），其營養(yǎng)豐富但物質組成不清的特性給尋找逆境耐受關鍵基因帶來干擾。

基于以上考慮，本研究針對釀造產香魯氏接合酵母，確定了全合成最少營養(yǎng)組分的培養(yǎng)基，基于此探索酵母細胞在長時期（120 h）的高鹽（18% NaCl）和高溫（40 ℃）脅迫下對營養(yǎng)需求特點，并進一步研究從適應期到對數生長初期的有機酸代謝、氨基酸代謝、胞內相容抗逆物質和重要逆境響應調控基因表達等方面的兩種逆境響應差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏接合酵母2013310（中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC M 2013310）是功能酵母和釀造微生物實驗室從中國傳統(tǒng)食品釀造中分離出的1 株酵母菌株。

全合成生長通用培養(yǎng)基（葡萄糖20.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、脯氨酸8.0 g/L、無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）培養(yǎng)基1.7 g/L）被用于酵母生長對照。YEPD固體培養(yǎng)基（酵母粉10.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L和瓊脂15.0 g/L）被用于種子液的制備，115 ℃、20 min滅菌。

全合成魯氏接合酵母生長培養(yǎng)基（葡萄糖20.0 g/L、脯氨酸4.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L、泛酸鈣1.0 mg/L和葉酸1.0 mg/L）被用于正常生理環(huán)境下魯氏接合酵母細胞的培養(yǎng)。高鹽逆境全合成培養(yǎng)基為添加有18% NaCl的全合成魯氏接合酵母生長培養(yǎng)基。高溫逆境全合成培養(yǎng)基是含有30%葡萄糖的全合成魯氏接合酵母生長培養(yǎng)基，110 ℃、20 min滅菌。

以上試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Labconco FreeZone 12 L凍干機 北京中科科爾儀器有限公司；ZXMP-A1230恒溫恒濕箱 上海智城分析儀器制造有限公司；高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JY02S紫外分析儀 北京君意東方電泳設備有限公司；7890B型氣相色譜 美國安捷倫公司；NanoDrop One C微量分光光度計 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子細胞的制備和培養(yǎng)條件

在30 ℃靜置培養(yǎng)2 d的魯氏接合酵母種子瓶中加入適量無菌水，輕微振蕩混勻，制成種子細胞懸液。所有培養(yǎng)條件下的初始OD600nm均為0.5±0.1。除高溫逆境培養(yǎng)溫度為40 ℃外，其他酵母細胞培養(yǎng)溫度均為30 ℃。所有培養(yǎng)條件下酵母細胞振蕩培養(yǎng)轉速和培養(yǎng)周期均為200 r/min和120 h。

1.3.2 樣品的處理與檢測

通過測定600 nm波長處的吸光度評判魯氏接合酵母的生長情況[40]。取培養(yǎng)液4 ℃、12 000 r/min離心5 min，上清液和細胞沉淀分開收集，放入液氮淬滅1 min，－80 ℃保存?zhèn)溆?。酵母細胞壁破碎采用物理破壁方法，具體步驟如下：淬滅后的酵母細胞泥中加入2 mL 40%乙醇溶液和玻璃珠（濕菌體與玻璃珠質量比為1∶5），渦旋振蕩20 min，－4 ℃、8 000 r/min離心5 min。所有上清液轉移至2 mL離心管，－4 ℃、12 000 r/min離心5 min，留上清液。分別取400、500 μL和400 μL上清液至氣相瓶，凍干后用于胞內糖類、氨基酸和有機酸的檢測。硅烷化衍生方案、氨基酸的檢測和有機酸的檢測及其相應氣相色譜條件均參考Wei Yangjian等[41]的方法。硅烷化衍生標準品包括甘油、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、酮戊二酸、木糖、木糖醇、鼠李糖、檸檬酸/異檸檬酸、果糖、半乳糖、草乙酸、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、油酸酰胺、阿魏酸、芥酸酰胺、蔗糖、乳糖、海藻糖、棉子糖。氨基酸標準品包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺/絲氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。胞內外代謝物標準品包括正丁醇、乙偶姻、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸。

1.3.3 逆境下的魯氏接合酵母營養(yǎng)需求分析

考慮到作為蛋白質輔基的維生素的重要生理功能，選擇了7 種維生素（硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素和抗壞血酸）添加到培養(yǎng)基中。逆境下的細胞可能遭遇能量物質供給不足，考察7 種能量相關物質（AMP、ADP、ATP、GMP、IMP、GMP和UMP）對魯氏接合酵母細胞生長能力的影響。作為主要代謝途徑之一的丙酮酸溢流代謝和三羧酸循環(huán)代謝在逆境下的酵母細胞中代謝活性可能下降，導致有機酸供給不足，因此，8 種有機酸也是研究對象之一，包括丙酮酸、丙酸、丁酸、草酰乙酸、反丁烯二酸、檸檬酸、蘋果酸和α-酮戊二酸。同時，基于逆境下酵母細胞可能出現(xiàn)氨基酸供應不足的問題，選擇14 種氨基酸（組氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸和谷氨酸）添加到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中維生素、有機酸和能量相關物質的終質量濃度均為1.0 mg/L。氨基酸終質量濃度為4.0 g/L。

1.3.4 總RNA提取及反轉錄cDNA

無菌條件下收集200 mg濕菌體，放入無RNA酶的2 mL EP管內，快速放入液氮中速凍5～10 min，隨后貯存在－80 ℃超低溫冰箱中備用?？俁NA提取試劑盒用于提取總RNA。對RNA的濃度和純度進行微量分光光度計檢測。采用R23-01逆轉錄試劑盒獲得cDNA，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）條件為50 ℃反應15 min，85 ℃變性5 s。

1.3.5 real-time PCR測定

采用Q711試劑盒進行real-time PCR，相關參數按照說明書。計算：ΔCt（循環(huán)閾值）＝Ct（目標基因）－Ct（管家基因ENO1），－ΔΔCt＝Ct（對照樣品）－ΔCt（循環(huán)閾值）；最終以2－ΔΔCT計算其倍數變化。內參基因為ENO1。

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

所有實驗重復3 次。使用Excel軟件進行統(tǒng)計分析（計算平均值，確定標準差），并使用Origin Pro 2019b及GraphPad Prism 9軟件繪制變化圖。使用SPSS Statistics 23.0軟件確定方差分析的顯著差異。通過標準品的保留時間，對檢測的有機酸、氨基酸、糖類物質進行定性分析；采用內標法對氣相色譜數據進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 建立全合成最低營養(yǎng)生長培養(yǎng)基

為了規(guī)避逆境非必要營養(yǎng)物質對代謝分析和基因表達分析的干擾，同時也為尋找逆境必須營養(yǎng)物提供干凈的背景，以YNB為對照培養(yǎng)基和出發(fā)培養(yǎng)基，選取酵母最適葡萄糖為唯一碳源，以脯氨酸為唯一氮源，采用單因素遞減策略對微量元素進行評估，建立魯氏接合酵母最低營養(yǎng)需求的全合成培養(yǎng)基。魯氏接合酵母在全合成培養(yǎng)基中及其不同逆境下的生長曲線如圖1A所示。

圖1 高溫（40 ℃）和高鹽脅迫（18% NaCl）下魯氏接合酵母2013310在全合成培養(yǎng)基中的生長變化（A）和顯微鏡觀察（B）Fig.1 Growth changes of Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS (A) and microscopic observation (B) of Z.rouxii 2013310 cultured in complete synthetic medium

魯氏接合酵母2013310在YNB培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h的最大OD600nm達到31.01±0.72，而在全合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h最大OD600nm只有14.22±1.23。同時，該酵母在全合成培養(yǎng)基的高溫和高鹽逆境下培養(yǎng)120 h的最大OD600nm只有2.44±0.13和3.87±0.12。此外，與YNB培養(yǎng)基相似，酵母細胞在全合成培養(yǎng)基中的生長曲線也顯示出清晰的適應期（0～12 h）、增殖期（12～84 h）和穩(wěn)定期（84～120 h）。由此可見，全合成培養(yǎng)基能滿足魯氏接合酵母在正常生理環(huán)境下的生長增殖需求。魯氏接合酵母在高鹽逆境下需要大約36 h適應環(huán)境，而在高溫環(huán)境下的適應期只有大約2 h。同時，在48 h時，高鹽逆境下的魯氏接合酵母進入了對數生長前期，而高溫下的酵母細胞在4 h已經處于對數生長前期?？梢?，該酵母對高溫環(huán)境的適應能力比高鹽逆境好。鑒于魯氏接合酵母在兩種逆境下的不同生長曲線，高溫逆境前12 h和高鹽逆境前48 h（適應期和對數生長初期）被用來研究魯氏接合酵母對兩種逆境的響應差異。

通過掃描電鏡觀察魯氏接合酵母2013310在全合成培養(yǎng)基及不同逆境下的形態(tài)學差異（圖1B）。在全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)下，魯氏接合酵母菌體主要呈圓形的單細胞狀態(tài)（與正常狀態(tài)下酵母形態(tài)一致），部分表面有褶皺，有明顯的出芽現(xiàn)象。發(fā)酵24 h后菌體全部呈圓形或橢圓形，表面圓潤飽滿，光滑無褶皺。在高鹽條件下，酵母在48 h對數前期細胞縮小，表面出現(xiàn)嚴重的褶皺變化，大部分呈單細胞存在。在高溫條件下的酵母在發(fā)酵8 h后，細胞大小較全合成培養(yǎng)基0 h較為接近，但存在部分細胞表面出現(xiàn)褶皺，且分布似乎有絮凝的趨勢，這可能與高溫對酵母細胞壁蛋白質結構影響有關[42]。高鹽脅迫比高溫脅迫對全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下酵母細胞形態(tài)影響更為顯著；而相對于高溫逆境，該酵母在高鹽條件展現(xiàn)出更高的生長活性。

2.2 魯氏接合酵母逆境條件下的營養(yǎng)需求差異

酵母細胞對營養(yǎng)物質的獲取只有兩條途徑，自身合成或轉運外源營養(yǎng)物。微生物基因表達和代謝在逆境下會發(fā)生劇烈變化，對營養(yǎng)物的需求應該會發(fā)生相應的調整?？紤]到高溫逆境和高鹽逆境可能會關閉某些營養(yǎng)物的自身合成途徑，使得酵母細胞對營養(yǎng)物獲取的方式發(fā)生變化，因此，分析全合成培養(yǎng)基中8 種有機酸、7 種維生素、7 種核苷類物質和14 種氨基酸對酵母細胞生長的影響，將有助于闡明魯氏接合酵母在面對高溫逆境和高鹽逆境時的營養(yǎng)需求差異。

高鹽逆境下的魯氏接合酵母2013310的生長不需要額外有機酸，但丙酮酸和草酰乙酸卻能促進高溫逆境下酵母細胞的增殖，較對照分別提高了34.5%和24.2%（圖2A）。無論是高鹽還是高溫逆境，魯氏接合酵母2013310對丙酸和正丁酸敏感。這兩種有機酸幾乎完全抑制了高鹽逆境下酵母細胞的生長。高溫逆境下，添加丙酸、正丁酸的魯氏接合酵母2013310 OD600nm較對照（OD600nm＝2.81）分別降低了85.1%、74.0%。高鹽逆境下，不同類型維生素對魯氏接合酵母高鹽脅迫下生長無顯著效果（圖2B1）；高溫逆境下，維生素的添加，在整體上促進了菌體生長，其中添加硫胺素菌體OD600nm較對照（OD600nm＝2.51）提高了1.47 倍（圖2B2）。不同類型核苷酸在兩種條件下對魯氏接合酵母2013310生長均無顯著影響（圖2C）。

圖2 魯氏接合酵母2013310在高鹽和高溫脅迫下的營養(yǎng)需求Fig.2 Nutritional requirements of Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS

氨基酸的添加對高鹽和高溫脅迫下的魯氏接合酵母2013310生長有明顯影響（圖2D）。高鹽逆境下，蛋氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸均能緩解菌體所受高鹽脅迫，OD600nm較對照分別提高2.72、3.40、2.73 倍和2.42 倍；高溫逆境下，能緩解細胞所受脅迫的氨基酸有賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、亮氨酸和精氨酸，其OD600nm較對照分別提高52.0%、31.1%、49.2%、34.5%、66.2%、19.4%和57.1%。絲氨酸和半胱氨酸均并不利于魯氏接合酵母2013310耐受高鹽和高溫脅迫。

總體而言，遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細胞更需要外源氨基酸，而補充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細胞的高溫壓力。這些結果也表明，魯氏接合酵母的維生素和氨基酸自我合成代謝被高溫壓力所抑制。同時，谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸是魯氏接合酵母細胞在兩種環(huán)境壓力下均需要的氨基酸。纈氨酸和蛋氨酸是魯氏接合酵母細胞在高鹽壓力下生長所需的獨特氨基酸，而賴氨酸、天冬酰胺和精氨酸是高溫壓力下魯氏接合酵母細胞所需的獨特氨基酸。由于氨基酸是蛋白質的重要組成單位[43]，蛋白質又參與酶的形成、物質的轉運及穩(wěn)定細胞結構等[44]，這表明有必要從蛋白層面進一步研究魯氏接合酵母對高鹽和高溫壓力響應的機理。

2.3 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母胞內外代謝物差異

有機酸具有多重生理功能，也參與了生命體核心代謝途徑，如丙酮酸溢流代謝和三羧酸循環(huán)。在選取的6 種被檢測有機酸物質中，兩種逆境下的魯氏接合酵母2013310細胞的胞內均只有乙酸被檢測到，而且變化過程相似，如圖3所示。乙酸在細胞生長適應前期（高鹽的12 h，高溫的2 h）在細胞內大量積累，最高含量分別達到（78.60±3.23）μg/g（細胞干質量，下同）和（126.30±10.56）μg/g。在隨后的12 h（高鹽）或2 h（高溫），胞內乙酸水平大幅下降，分別降為（19.54±3.56）μg/g（高鹽，24 h）和（38.30±7.02）μg/g（高溫，4 h）。此后，乙酸含量幾乎維持穩(wěn)定。

圖3 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母2013310胞內外代謝物的差異Fig.3 Differences in intracellular and extracellular metabolites in Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS

在高鹽逆境下也只檢測到單一的胞外有機酸乙酸（圖3B1）。乙酸在生長前期（0～12 h）快速積累并在12 h達到峰值（（364.09±15.65）μg/L），24 h后乙酸被快速消耗至（117.09±17.01）μg/L（36 h）。在高溫下，除了乙酸，胞外還存在多種有機酸，包括正丁醇、丙酮、丙酸、丁酸和異丁酸。除乙酸外，5 種有機酸在培養(yǎng)的前2 h就完成了胞外的積累。乙酸在胞外持續(xù)積累，最大質量濃度達到（566.32±13.76）mg/L（10 h）。乙偶姻是一種酮類物質，是魯氏接合酵母在胞外積累的第二大化合物。乙酸代謝可能在魯氏接合酵母長期適應高溫高鹽壓力中起著重要的作用，是有機酸代謝的關鍵環(huán)節(jié)。推測乙酸的存在有利于乙酰輔酶A的合成，因為乙酰輔酶A是一種重要的抗逆中間代謝物[45]。同時，考慮到全合成培養(yǎng)基的特點，胞外有機酸的出現(xiàn)源于胞內有機酸代謝及其分泌。相比于高鹽壓力，糖代謝在高溫壓力下更活躍?？梢?，魯氏接合酵母針對高鹽和高溫逆境采用了不同的有機酸代謝策略。無論是高鹽還是高溫脅迫，魯氏接合酵母均不會在胞內積累有機酸，這應該是避免有機酸的傷害，與前面營養(yǎng)需求研究結果一致。

2.4 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母氨基酸代謝的差異

由于本研究使用的是最低營養(yǎng)需求的全合成培養(yǎng)基，除脯氨酸外其他氨基酸只能來自細胞自身代謝過程。魯氏接合酵母2013310氨基酸代謝對高鹽壓力和高溫壓力的響應差異巨大，如圖4所示。鑒于脯氨酸與其他氨基酸在含量上存在巨大差異，胞外脯氨酸的變化未在胞外氨基酸圖中呈現(xiàn)。高鹽壓力下，只檢測到4 種氨基酸（蘇氨酸、異亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）（圖4A1、B1），遠低于高溫壓力下的7 種氨基酸（脯氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和蛋氨酸）（圖4A2、B2）。異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸參與了魯氏接合酵母對高鹽和高溫的響應。蘇氨酸只參與高鹽壓力響應，脯氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸只參與高溫壓力響應。異亮氨酸和脯氨酸分別是高鹽壓力和高溫壓力下酵母胞內主要響應的氨基酸。高鹽壓力下，異亮氨酸在0～12 h快速積累至（119.34±0.56）μg/g，然后，基本在121.80 μg/g附近波動；高溫條件下，脯氨酸含量在0～6 h快速積累至峰值（（117.30±5.18）μg/g），然后呈下降趨勢。色氨酸和蛋氨酸分別是高鹽壓力和高溫壓力下酵母胞外主要響應的氨基酸。高鹽逆境下，培養(yǎng)24 h色氨酸快速累積至（17.97±0.01）μg/L，36 h下降至（7.04±0.01）μg/L；高溫壓力下，甲硫氨酸含量在0～6 h快速累積并在6 h達到峰值（（197.50±7.48）mg/L），8 h存在小幅下降至（164.10±6.85）mg/L，后維持穩(wěn)定。結合營養(yǎng)需求差異分析（圖2B2），色氨酸是值得關注的魯氏接合酵母耐受逆境的氨基酸。

圖4 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母胞內外氨基酸的差異Fig.4 Differences in intracellular and extracellular amino acids in Z.rouxii 2013310 under HTS and HSS

2.5 高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母抗逆代謝物的差異

微生物合成抗逆代謝產物來抵御環(huán)境壓力是一種重要的壓力響應機制。如圖5所示，魯氏接合酵母胞內糖代謝對高鹽和高溫逆境產生了兩種截然不同的響應。高鹽逆境下的魯氏接合酵母細胞內只有鼠李糖和半乳糖（圖5A）。在適應初期的12 h，酵母細胞大量積累鼠李糖，而半乳糖在胞內只有少量增加，但二者在24 h下降。進入細胞生長期時，這兩種糖的胞內濃度顯著上升。與之不同，高溫逆境下魯氏接合酵母胞內存在葡萄糖、海藻糖、木糖醇和甘油（圖5B）。傳統(tǒng)上的抗逆保護劑（海藻糖和甘油）在魯氏接合酵母胞內只有極少量的積累，最大含量分別為（369.00±21.01）μg/g和（268.10±21.18）μg/g（8 h），而木糖醇水平卻顯著上升（（1 788.20±100.56）μg/g，8 h）。這表明對魯氏接合酵母2013310而言，木糖醇，而非海藻糖和甘油，是其高溫壓力下的抗逆保護劑。Wei Yangjian等[41]的研究也證實了處于穩(wěn)定期的魯氏接合酵母在高溫環(huán)境下會大量合成木糖醇。然而，本研究結果表明，高鹽壓力下的魯氏接合酵母細胞內沒有葡萄糖。這可能是兩個因素導致的：其一，高鹽下的魯氏接合酵母對外源葡萄糖的轉運能力不強[46]，導致胞內葡萄糖濃度處于檢測線之下；其二，對高鹽環(huán)境下的魯氏接合酵母而言，葡萄糖可能并不是最適碳源，胞內葡萄糖被快速轉化成其他糖類物質。全合成培養(yǎng)基中添加木糖醇、海藻糖、甘油對魯氏接合酵母在高鹽環(huán)境下的生長均有促進作用，相比空白對照，OD600nm分別提高了115.4%、217.0%、223.9%（數據未顯示）。

圖5 高鹽脅迫（A）和高溫脅迫（B）下魯氏接合酵母2013310糖類代謝物的差異Fig.5 Differences in intracellular carbohydrate metabolites in Z.rouxii under HSS (A) and HTS (B)

2.6 相關基因在高鹽和高溫脅迫下的時間表達差異

全局調控基因在生命體響應外界環(huán)境變化中扮演重要角色。營養(yǎng)需求和代謝層面所展示的魯氏接合酵母2013310對高鹽和高溫逆境的響應差異說明兩種逆境下的相關全局調控基因和抗逆基因表達存在不同。4 種常見的逆境響應調控基因在兩種逆境下的時序表達差異如圖6所示。

圖6 魯氏接合酵母2013310相關基因對高鹽逆境和高溫逆境的響應Fig.6 Responses of genes in Z.rouxii 2013310 to HTS and HSS

在高鹽逆境下，熱激調控蛋白基因HSF1表達量除在24 h下調29.3%外，其他培養(yǎng)時間的表達量沒有顯著改變。逆境調控響應基因MSN4以及滲透脅迫響應基因HOG1表達量均在12 h上調，分別為初始的1.4、1.3 倍。氧化脅迫調控基因SOD1轉錄表達水平在整個培養(yǎng)階段均低于初始對照。可見，MSN4和HOG1是兩個主要參與魯氏接合酵母對高鹽適應生長的調控基因，且主要在適應初期（12 h）發(fā)生響應。Dhar等[47]通過對實驗室進化所構建的耐鹽釀酒酵母中的壓力響應基因表達分析發(fā)現(xiàn)MSN4的表達水平顯著上調。在對漢斯德巴氏酵母的鹽和氧化壓力進行分析時，Laura等[48]發(fā)現(xiàn)用200 mmol/L NaCl處理該酵母10 min已能導致MSN2和HOG1上調。HOG1蛋白參與基因表達的現(xiàn)象在極端耐鹽的黑酵母Hortaea werneckii中也能觀察到[49]，這些結果與魯氏接合酵母相似。雖然高鹽常常被認為會引起氧化脅迫，然而魯氏接合酵母細胞并沒有遭遇氧化脅迫，這可能是研究采用的低營養(yǎng)環(huán)境導致。

在高溫逆境下，熱激調控蛋白基因HSF1表達量隨培養(yǎng)時間延長持續(xù)上調，在12 h上調到最大值（5.1 倍）。逆境調控響應基因MSN4相對轉錄水平在12 h內無顯著變化。滲透脅迫響應基因HOG1轉錄水平隨培養(yǎng)時間延長持續(xù)下調，2、4、12 h分別下調41.7%、43.8%、69.3%。氧化脅迫調控基因SOD1轉錄水平在培養(yǎng)2 h上調至2.3 倍，但隨后上調水平逐漸回落?？梢?，除MSN4外，其他3 種調控基因均參與了魯氏接合酵母對高溫逆境的適應。與釀酒酵母HSF1在熱刺激初期大量上調而后恢復至正常水平的現(xiàn)象不同[50]，魯氏接合酵母在高溫逆境下持續(xù)增加HSF1表達用于滿足增殖期間蛋白體系穩(wěn)定的需要。雖然30%葡萄糖達不到超滲水平，但該濃度對HOG1的表達產生抑制效應，引起了氧化脅迫（SOD1表達上調）。考慮到不同逆境之間存在交聯(lián)關系[48]，魯氏接合酵母中高溫抑制高滲而激活氧化脅迫的機理還有待深入研究。

3 結論

溫度壓力和鹽壓力是魯氏接合酵母在醬油高鹽固態(tài)發(fā)酵過程中遭遇的主要逆境[51]。與其他環(huán)境壓力不同，微生物對這兩種逆境無法通過采用降解壓力因子的方式緩解。本研究基于低營養(yǎng)全合成培養(yǎng)基，在營養(yǎng)、代謝和轉錄3 個層面分析了魯氏接合酵母2013310從生長適應期到對數生長初期的高鹽和高溫逆境響應?？傮w而言，該酵母采用了不同的策略來適應高溫和高鹽逆境。遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細胞更需要外源氨基酸，而補充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細胞的高溫壓力。谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸和乙酸代謝對酵母細胞適應高溫和高鹽逆境極其重要。本研究加深了對耐鹽魯氏接合酵母耐溫機制的理解。同時，微生物不同抗性之間存在交互作用[52-53]。魯氏接合酵母耐高鹽的特性與對溫度的高敏感性之間的關聯(lián)性有待研究，這將有助于為雙抗逆新型魯氏接合酵母細胞株的構建提供方向和著力點。