王月月，劉 瑩，姜鵬飛，傅寶尚，祁立波，王利民，葛靜慧，尚 珊,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.遼漁集團(tuán)有限公司，遼寧 大連 116000）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉中的主要蛋白質(zhì)，屬于鹽溶性蛋白，除了可以維持肌纖維形態(tài)、參與肌肉收縮外，也是糜類制品形成凝膠的主要成分[1]，可以賦予糜類制品良好的質(zhì)地與口感。在水產(chǎn)品加工業(yè)中，NaCl含量對水產(chǎn)制品的品質(zhì)，尤其對糜類制品的凝膠性能、質(zhì)地和風(fēng)味至關(guān)重要。溶解度與MP的凝膠特性密切相關(guān)[2]，MP的溶解和展開是形成良好凝膠的基礎(chǔ)。因此，通常在糜類制品加工中加入NaCl的同時通過斬拌和擂潰提高M(jìn)P的溶解度。但目前人們NaCl攝入量普遍超標(biāo)，高鈉鹽的攝入會導(dǎo)致血壓升高、增加患心腦血管等疾病的風(fēng)險，全球每年約有300萬 人死于高鹽飲食引發(fā)的疾病[3]。因此，“減鹽”是全球公認(rèn)最具成本效益的慢性病干預(yù)策略之一。為了減少鈉鹽的攝入量，常使用鈉鹽替代物來降低水產(chǎn)制品中鈉鹽的含量，如用K＋、Mg2＋、Ca2＋和Zn2＋等陽離子代替Na＋[4]，多項研究表明，這些陽離子在魚糜凝膠化過程中具有與Na＋相似的功能[4-6]。在這些陽離子中，Ca2＋最常用于糜類制品加工，因為Ca2＋在凝膠過程中可以激活糜類蛋白中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase），通過ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸交聯(lián)生成ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸鍵，形成更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)；此外還可以引起肌球蛋白構(gòu)象變化，通過促進(jìn)未折疊的肌球蛋白分子之間的疏水相互作用改善肌動球蛋白的凝膠特性[4]。鹽離子濃度的改變會引起MP中各種蛋白質(zhì)分子組成的變化。通過影響MP中不同種類蛋白相對含量間接影響蛋白質(zhì)間相互作用力[7]。鄧偉[8]研究發(fā)現(xiàn)與單獨添加NaCl組相比，添加適當(dāng)濃度的CaCl2可以顯著提高鰱魚魚糜凝膠的肌球蛋白交聯(lián)程度。海藻酸鈉（sodium alginate，SA）是從褐藻中獲得的多糖，具有較好的增稠特性和凝膠能力[9]。有研究表明，在常溫或低溫條件下，SA溶液與Ca2＋作用可形成良好的熱不可逆凝膠[10]，改善肉制品的物理性質(zhì)，同時可增強(qiáng)其質(zhì)構(gòu)特性，減少營養(yǎng)成分損失，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量。

因此，本研究以蝦糜為研究對象，探究添加不同替代量的CaCl2協(xié)同SA對蝦糜3D打印效果、凝膠強(qiáng)度、持水力、蛋白質(zhì)熱力學(xué)特性、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、化學(xué)作用力和凝膠組織微觀結(jié)構(gòu)等指標(biāo)的影響，確定CaCl2在SA-蝦糜體系中的最適添加量，以期為減少添加劑和NaCl的使用并提高蝦糜的凝膠特性從而增強(qiáng)蝦糜制品熱加工品質(zhì)提供一定的參考，同時為蝦糜制品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦、南美白對蝦由大連遼漁遠(yuǎn)洋食品有限公司提供，冷凍的南極磷蝦和南美白對蝦運(yùn)送到實驗室后在－18 ℃冷庫中儲存?zhèn)溆谩?/p>

NaCl（食品級）中鹽國本鹽業(yè)有限公司；SA青島明月海藻集團(tuán)有限公司；CaCl2（食品級）浙江一諾生物科技有限公司；戊二醛固定液 南京森貝伽生物科技有限公司；無水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他藥品與試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SD-JR57型絞肉機(jī) 佛山市順德區(qū)三的電器制造有限公司；3D打印機(jī) 上海富奇凡科技有限公司；TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司；DHR-2流變儀、TA-DSC250差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 上海TA儀器有限責(zé)任公司；M1N1 MR核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜儀 美國珀金埃爾默儀器有限公司；JSM-7800F熱場發(fā)射掃描電鏡 日本電子株式會社；CP100NX高速冷凍離心機(jī) 日本株式會社日立制作所；LC-1.0冷凍干燥機(jī) 沈陽航空信陽速凍廠。

1.3 方法

1.3.1 蝦糜及凝膠制備

蝦糜制備：取冷凍的南極磷蝦、南美白對蝦于4 ℃條件下解凍。按質(zhì)量比1∶1稱取南極磷蝦及南美白對蝦，用絞肉機(jī)空斬3 min，如表1所示，根據(jù)離子強(qiáng)度計算公式I＝1/2×[（C（陽離子）＋C（陰離子））×Z2]計算得出在總離子強(qiáng)度相等的情況下CaCl2的替代量。分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.50% NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00% NaCl＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.31% CaCl2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.70% NaCl＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%CaCl2，繼續(xù)鹽斬7 min，其余3 組在此基礎(chǔ)上分別加入總質(zhì)量0.5%的SA繼續(xù)斬拌3 min。以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%NaCl組為對照。在斬拌過程中，控制所有處理組斬拌時間相同，溫度保持在10 ℃以下。蝦糜過40 目篩，立即用于3D打印。

表1 相同離子強(qiáng)度的蝦糜凝膠中的CaCl2替代量Table 1 Levels of CaCl2 incorporation in minced shrimp under the same ionic strength

蝦糜凝膠制備：將斬拌獲得的蝦糜填充于柱狀管中（長×寬×高＝25 mm×25 mm×30 mm），并用保鮮膜封緊，采用二段加熱法于水浴鍋中加熱（40 ℃、60 min；90 ℃、30 min），將加熱后的蝦糜凝膠立即取出置于冰水中冷卻20 min，擦干表面水分后置于4 ℃冰箱中過夜貯藏備用[11]。

1.3.2 3D打印

蝦糜的3D打印參照Yu Nannan等[11]的方法并加以改進(jìn)。將蝦糜樣品擠入3D打印機(jī)的進(jìn)料筒中，打印形狀選擇圓柱體（直徑20 mm、高25 mm），3D打印條件：噴嘴直徑為1 mm，打印速率為15 mm/s，平臺移動速率為20 mm/s，打印溫度為25 ℃。

1.3.3 凝膠強(qiáng)度測定

蝦糜凝膠強(qiáng)度的測定參照Ding Yuqin等[12]的方法并加以改進(jìn)。將蝦糜凝膠樣品在室溫平衡0.5 h切成高為30 mm柱體，用質(zhì)構(gòu)儀測定其凝膠強(qiáng)度。參數(shù)測定：選用球形探頭P/5S，測試前速率1 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率1 mm/s，觸發(fā)力5 g，時間30 s，穿透比50%。蝦糜的凝膠強(qiáng)度按式（1）計算：

1.3.4 全質(zhì)構(gòu)特性測定

樣品前處理同1.3.3節(jié)，并參照Horita等[13]的方法加以改進(jìn)。選用質(zhì)構(gòu)儀的P/50圓柱形探頭測試其全質(zhì)構(gòu)特性，測試前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測試后速率2 mm/s，觸發(fā)力5 g，連續(xù)2 次下壓，形變量30%，測定溫度為室溫，每組樣品平行測定6 次。

1.3.5 持水力測定

將凝膠切割成約2 g的厚片，精確稱質(zhì)量m0，用3 層濾紙包裹，并在4 ℃條件下4 000 r/min離心20 min。離心后立刻稱質(zhì)量m1。樣品的持水力按式（2）計算[4]：

1.3.6 水分分布測定

將蝦糜凝膠切成2 cm×2 cm×2 cm左右的柱體，用保鮮膜包裹后置于低場核磁成像分析儀中，使用CPMG脈沖序列測定樣品的橫向弛豫信號。測試條件：重復(fù)采樣等待時間為1 000 ms，累加次數(shù)為8，180°脈沖為43.04 μs，回波時間為0.25 ms，回波個數(shù)為4 000。測定后每個樣品進(jìn)行反演，從而獲得樣品的弛豫時間與對應(yīng)峰面積[14]。

1.3.7 流變學(xué)性質(zhì)測定

將制備的蝦糜均勻置于流變儀平臺上，選取直徑40 mm的探頭，上下板夾縫1 mm，頻率為1 Hz，應(yīng)變設(shè)為0.5%，溫度范圍20～90 ℃，按照5 ℃/min速率升溫，記錄樣品的儲能模量（G’）[15]。

1.3.8 DSC分析

采用DSC儀對蝦糜樣品的熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測量。參考Cai Luyun等[5]的方法稍作修改。稱取10 mg左右樣品于鋁制耐高壓坩鍋中并密封，放入樣品池，以空坩堝為對照組，樣品以5 ℃/min恒定速率從20 ℃升溫至100 ℃，記錄升溫曲線，從曲線中獲得變性溫度（Tm）與總焓值（ΔH）。

1.3.9 化學(xué)作用力測定

參考Montero等[6]方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取蝦糜凝膠樣品（2.0 g），分別加入10 mL 0.05 mol/L NaCl溶液（S0）、0.6 mol/L NaCl溶液（S1）、0.6 mol/L NaCl溶液＋1.5 mol/L尿素（S2）、0.6 mol/L NaCl溶液＋8 mol/L尿素（S3）、0.6 mol/L NaCl溶液＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/Lβ-巰基乙醇（S4），采用勻漿機(jī)在10 000 r/min勻漿1 min后放在4 ℃層析柜中靜置1 h，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，采用Bradford法測定上清液中蛋白質(zhì)含量。離子鍵含量以溶解于S1與S0溶液中的蛋白含量差表示；氫鍵含量以溶解于S2與S1溶液中的蛋白含量差表示；疏水相互作用含量以溶解于S3與S2溶液中的蛋白含量差表示；二硫鍵含量以溶解于S4與S3溶液中的蛋白含量差表示；結(jié)果以每毫升溶液所含的溶出蛋白質(zhì)量表示（單位mg/mL）。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜分析

將蝦糜樣品冷凍干燥后研磨成粉與溴化鉀混合均勻并壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)記錄樣品的紅外光譜，用KBr的紅外光譜作為背景。利用OMNIC軟件分析該蛋白二級結(jié)構(gòu)變化[16]。

1.3.11 微觀結(jié)構(gòu)分析

將蝦糜凝膠切成3 mm厚切片，加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液中，于4 ℃固定48 h，然后用清水沖洗3 次，然后依次用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液漂洗脫水（10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%），每次15 min。處理好的樣品置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空干燥72 h，使用掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜3D打印特性的影響

蝦糜體系是一種黏性凝膠，3D打印與其凝膠性能密切相關(guān)，包含可擠出性和可支撐性兩方面[17]。如圖1所示，對照組的打印圓柱基本成型但存在變形現(xiàn)象，層與層之間存在縫隙，黏合效果差且存在塌陷現(xiàn)象，這可能與蝦糜中南極磷蝦水分含量高、鹽溶性蛋白含量低有關(guān)，使其黏彈性和支撐性較差[18]。CaCl2替代NaCl并協(xié)同SA影響了蝦糜的流動性和彈性，有助于物料連續(xù)擠出及形狀的保持。當(dāng)CaCl2替代量為0.31%時，打印出的樣品柱體支撐增強(qiáng)，呈現(xiàn)較為光滑緊湊的表面，層與層之間形狀規(guī)則、清晰。當(dāng)CaCl2替代量為0.5%時，打印的樣品可擠出性和支撐性變差，出現(xiàn)變形現(xiàn)象且存在明顯縫隙。這可能是因為少量CaCl2能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)展開，從而提高樣品穩(wěn)定性，而過量CaCl2在斬拌過程中會促使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降[19]，從而使3D打印特性變差。相較于對照組，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的SA后打印柱體支撐性增強(qiáng)，這是因為SA具有良好的凝膠增稠性，在擂潰過程中能夠融入樣品增強(qiáng)打印柱體可支撐性[20]。在SA-蝦糜體系中，CaCl2替代量為0.31%樣品打印時逐層沉積，打印柱體具有更好的支撐穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)指出陽離子介導(dǎo)凝膠化能夠增強(qiáng)打印樣品的穩(wěn)定性，SA在Ca2＋的作用下交聯(lián)形成良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于提高樣品的凝膠特性[21]。然而，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的CaCl2協(xié)同質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的SA打印柱體存在微弱變形，可能是因為Ca2＋濃度增大會加快蛋白質(zhì)的聚集速率，使其結(jié)構(gòu)粗糙，流動性變差[11]，從而導(dǎo)致物料擠出困難，打印性狀變差。

圖1 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜3D打印特性的影響Fig.1 Effect of CaCl2 combined with SA on 3D printing characteristics of shrimp surimi

2.2 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠強(qiáng)度影響

從圖2可以看出，CaCl2替代NaCl能顯著增強(qiáng)蝦糜的凝膠強(qiáng)度，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，與Ding Yuqin等[12]研究結(jié)果一致。其中0.5% CaCl2替代NaCl的凝膠強(qiáng)度相較于對照組蝦糜提高了37.6%（P＜0.05）。凝膠強(qiáng)度的提高可能是因為在一定替代量范圍內(nèi)，Ca2＋能夠激活內(nèi)源TGase的活性、促進(jìn)疏水相互作用和非二硫共價鍵的交聯(lián)從而改善凝膠化，使凝膠結(jié)構(gòu)更緊密，達(dá)到提高蝦糜凝膠強(qiáng)度的目的[4,15]。與對照組相比，僅添加SA的蝦糜凝膠強(qiáng)度略微下降但無顯著差異（P＞0.05），在此基礎(chǔ)上加入0.31% CaCl2后蝦糜的凝膠強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這是因為Ca2＋能夠引起蛋白質(zhì)與多糖分子間發(fā)生交聯(lián)，使SA填充于蝦糜蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)中，形成更為完整的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而提高凝膠性能[22]。而在0.50% CaCl2替代量的SA-蝦糜體系中，其凝膠強(qiáng)度較0.31% CaCl2替代量蝦糜凝膠顯著降低（P＜0.05），可能是體系中過量Ca2＋存在會促進(jìn)SA競爭性結(jié)合Ca2＋生成SA-Ca2＋聚合物，從而抑制Ca2＋對蝦糜蛋白凝膠形成的促進(jìn)作用，阻礙蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度下降[23]。

圖2 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠強(qiáng)度影響Fig.2 Effect of CaCl2 combined with SA on gel strength of shrimp surimi

2.3 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表2所示，隨CaCl2替代量的增大，蝦糜凝膠的硬度顯著增大，回復(fù)性顯著減小（P＜0.05），彈性、黏聚性和咀嚼度無顯著變化（P＞0.05），這可能與蝦糜凝膠中Ca2＋的存在對水結(jié)合能力具有一定負(fù)面作用有關(guān)[24]，蛋白聚集使結(jié)合水的能力降低導(dǎo)致其硬度較大。Horita等[13]也發(fā)現(xiàn)法蘭克福香腸因添加CaCl2后導(dǎo)致其硬度更高。相較于對照組，添加SA蝦糜凝膠的彈性和咀嚼度均顯著下降（P＜0.05），可能是因為SA的加入會干擾MP凝膠化，無法形成有序凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[25]。當(dāng)CaCl2部分替代NaCl后，含有SA的蝦糜凝膠硬度隨CaCl2替代量的增大顯著增加（P＜0.05），而0.31% CaCl2替代量蝦糜的凝膠彈性略高于其他組，可能是適量的Ca2＋濃度會促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)適度伸展。但Ca2＋濃度過高會破壞形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致蝦糜凝膠彈性降低[26-27]。此結(jié)果與凝膠強(qiáng)度分析結(jié)果相印證。

表2 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性影響Table 2 Effect of CaCl2 combined with SA on texture properties of shrimp surimi

2.4 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜持水力影響

凝膠的持水力反映了凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子吸收和保持水分子的能力。如圖3所示，CaCl2替代部分NaCl對蝦糜凝膠的持水力有顯著影響，隨CaCl2替代量的增大而減?。≒＜0.05），由62.0%下降至57.6%。表明在等離子強(qiáng)度下，CaCl2含量越多，樣品的持水力越差。Ca2＋含量的增加會導(dǎo)致Ca2＋和Cl－的“鹽析”作用增強(qiáng)，蛋白聚集速率大于展開速率，使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出不均勻孔洞，水分被擠出，從而導(dǎo)致凝膠體系的持水性降低[11]。與對照組相比，添加SA能顯著提高蝦糜凝膠持水力（P＜0.05），SA由于自身的親水作用會促進(jìn)其與蝦糜蛋白相互作用，從而提高凝膠持水力[28]。而隨著體系內(nèi)CaCl2替代量的增大，在0.31% CaCl2替代量條件下其持水力達(dá)到最大值，這可能因為SA與Ca2＋更易結(jié)合并發(fā)生相互作用，影響SA與蝦糜蛋白分子原有的相互作用，進(jìn)而影響其持水性能[23]。從持水力結(jié)果看，0.31% CaCl2替代量會增強(qiáng)含有0.5% SA蝦糜凝膠的持水效果。

圖3 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠持水力影響Fig.3 Effect of CaCl2 combined with SA on water-holding capacity of shrimp surimi gels

2.5 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜水分分布的影響

氫質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時間（T2）可用來估計凝膠體系中水分子的遷移率和分布。蝦糜凝膠的橫向弛豫時間（T2）和水分分布狀態(tài)如圖4和表3所示，所有比例都存在3 個特征峰，從左到右依次為T21（0.01～3 ms）、T22（14～330 ms）和T23（＞330 ms），分別代表結(jié)合水、不易流動水和自由水[11]，其對應(yīng)的峰面積總體（A21、A22和A23）揭示了這3 種水分子分布的變化。T2越短，表明水分流動性越低，因此T2可以表征水分的自由度。從圖中可以看出，蝦糜凝膠中水分主要為不易流動水，與對照組相比，隨著CaCl2替代量的增加，蝦糜凝膠的T22出現(xiàn)先減小后增加趨勢。當(dāng)蝦糜凝膠中NaCl被0.5%的CaCl2替代時，T22相較于對照組增加了1.70%，且A22減小、A23增大，說明較高含量的Ca2＋反而使凝膠網(wǎng)絡(luò)與水分子之間的作用減弱，水分的移動性增強(qiáng)，蝦糜凝膠的持水性下降[11]。這與Pan Teng等[14]的研究結(jié)果一致。在添加SA的蝦糜凝膠中T22無顯著變化，但A23減小，表明自由水向不易流動水方向遷移，使凝膠持水性增加。隨著體系內(nèi)CaCl2的加入，T22與A22也相對降低，當(dāng)CaCl2替代量為0.31%時，T22、T23最短，A23最?。≒＜0.05），說明水分的移動性較小，凝膠與水分子緊密結(jié)合，增強(qiáng)水的穩(wěn)定性，這與持水性的結(jié)果保持一致。

圖4 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜水分遷移的影響Fig.4 Effect of CaCl2 combined with SA on water migration in shrimp surimi

表3 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠3 種狀態(tài)水分相對含量Table 3 Effect of CaCl2 combined with SA on relative contents of bound,immobilized and free water in shrimp surimi gels %

2.6 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜流變學(xué)性質(zhì)的影響

圖5顯示蝦糜的儲能模量（G’）在添加CaCl2和SA后隨溫度變化的關(guān)系，CaCl2和SA的加入顯著影響蝦糜的G’。隨著溫度升高，蝦糜的G’在40 ℃以下呈先緩慢上升后下降趨勢，可能由于肌球蛋白尾部的α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋，分子間初步形成松散的凝膠網(wǎng)絡(luò)[29]。在45～50 ℃溫度范圍內(nèi)出現(xiàn)第2個峰值，這可能與肌球蛋白輕鏈和肌球蛋白的展開交聯(lián)有關(guān)[30]。繼續(xù)加熱，G’迅速升高，肌動球蛋白開始變性，形成穩(wěn)定有序的不可逆凝膠網(wǎng)絡(luò)[31]。溫度繼續(xù)升高，CaCl2替代部分NaCl蝦糜的G’快速增高且隨CaCl2替代量的增大而增大，可能是由于Ca2＋的加入促進(jìn)了肌球蛋白的展開，在肌球蛋白展開的過程中，一些官能團(tuán)如疏水性氨基酸殘基和巰基暴露出來，而疏水性氨基酸的暴露可導(dǎo)致MP分子之間形成疏水性相互作用，改善蝦糜蛋白的凝膠性能，從而促使更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，使G’增加[30]。此外，隨著CaCl2替代量的增大初始峰值溫度逐漸減小，證明CaCl2能夠降低蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[30]。添加SA后G’降低，這可能是因為SA與蛋白質(zhì)相互作用，干擾蝦糜蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，導(dǎo)致G’降低[22]。然而，在SA-蝦糜蛋白體系中，添加CaCl2后G’增加，且隨CaCl2替代量的增大而增大，這表明CaCl2的加入能夠減弱SA與蝦糜蛋白間的相互作用，從而改變凝膠流變特性。Ca2＋對SA更為敏感，在常溫下能發(fā)生相互作用形成熱不可逆凝膠，進(jìn)而導(dǎo)致蝦糜體系硬度增強(qiáng)[32]。

圖5 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜流變學(xué)性質(zhì)的影響Fig.5 Effect of CaCl2 combined with SA on rheological properties of shrimp surimi

2.7 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜熱穩(wěn)定性的影響

焓值和熱變性溫度是決定蝦糜制品熱穩(wěn)定性質(zhì)的兩個主要因素[33]，可通過DSC法進(jìn)行測定。圖6及表4顯示了CaCl2及SA對蝦糜熱變性溫度及焓值變化的影響。對照組的肌球蛋白Tm為43.94 ℃，ΔH為0.36 J/g。CaCl2的加入降低了肌球蛋白的熱變性溫度與焓值，且隨著CaCl2替代量的增加而顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)CaCl2替代量為0.5%時，肌球蛋白的Tm為42.73 ℃，ΔH為0.25 J/g。ΔH是吸熱反應(yīng)（熱誘導(dǎo)變性）和放熱反應(yīng)（蛋白質(zhì)聚集）的總和[30]，在CaCl2存在時，蛋白聚集增加可能抵消了吸熱變性的熱焓值，因此ΔH隨CaCl2濃度的增加而降低，這與本研究結(jié)果一致。CaCl2可能通過與肌球蛋白分子中帶負(fù)電荷的殘基相互作用形成雙層離子基團(tuán)，改變蛋白質(zhì)間靜電排斥力，使吸引力和排斥力處于平衡狀態(tài)，顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-水之間的相互作用，從而加速蛋白質(zhì)的展開，使蛋白質(zhì)更容易發(fā)生熱變性[15,30]。但有研究表明高濃度的CaCl2會導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度聚集，不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)形成[11]。此外，在添加SA后蝦糜熱變性溫度略有增加、焓值降低，說明SA的添加對蝦糜蛋白的變性和聚集行為也有影響。然而在SA-蝦糜體系中，CaCl2的加入使蝦糜中峰1的熱變性溫度和焓值進(jìn)一步降低（P＜0.05），這可能是Ca2＋在SA作用下發(fā)生交聯(lián)，使分子間的結(jié)合更加緊密，形成更加完整的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[9]。蝦糜蛋白的DSC結(jié)果與G’結(jié)果相對應(yīng)。有研究指出，較低的熱變性溫度有利于蝦糜在加工過程中保持良好特性與營養(yǎng)價值[34]。綜合以上結(jié)果，CaCl2與SA的協(xié)同作用會顯著影響蝦糜的熱穩(wěn)定性。

圖6 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜熱穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of CaCl2 combined with SA on thermal stability of shrimp surimi

表4 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜熱變性溫度及焓值變化的影響Table 4 Effect of CaCl2 combined with SA on Tm and ΔH of shrimp surimi

2.8 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜化學(xué)作用力的影響

非共價鍵（離子鍵、氫鍵和疏水相互作用）在維持凝膠三維結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度方面發(fā)揮著重要作用。從圖7可以看出，CaCl2替代部分NaCl后，離子鍵含量顯著下降（P＜0.05），氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵含量顯著增加（P＜0.05）。在熱誘導(dǎo)過程中其他非共價化學(xué)鍵（主要是疏水相互作用）的形成和離子鍵的斷裂導(dǎo)致離子鍵比例下降。而CaCl2會促進(jìn)肌球蛋白表面展開，暴露巰基和疏水氨基酸殘基，促進(jìn)疏水相互作用和二硫鍵的形成，增加蝦糜凝膠聚集程度[15]，氫鍵含量也隨之增加。添加SA的蝦糜凝膠中離子鍵、氫鍵和疏水相互作用出現(xiàn)不同程度的下降，這可能是由于SA的負(fù)電荷中和了暴露在蝦糜蛋白表面的正電荷，破壞了離子鍵并導(dǎo)致聚合物進(jìn)一步聚集，掩埋更多的疏水氨基酸殘基[35]。然而，CaCl2替代部分NaCl協(xié)同SA增強(qiáng)了蝦糜凝膠的氫鍵和疏水相互作用，凝膠強(qiáng)度提高。這與Montero等[6]研究結(jié)果一致。但CaCl2添加量過高會與肌球蛋白形成鈣橋，從而使凝膠變硬、持水力降低。可能是因為SA更易與Ca2＋結(jié)合并發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響蛋白-多糖以及蛋白-蛋白之間相互作用，改變蝦糜凝膠特性[11,36]。

圖7 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.7 Effect of CaCl2 combined with SA on chemical forces of shrimp surimi gels

2.9 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜二級結(jié)構(gòu)的影響

圖8顯示了蝦糜及其熱誘導(dǎo)凝膠的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量變化。有文獻(xiàn)指出，較高的β-折疊相對含量可以促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)，有利于形成更好的凝膠性能[19]。CaCl2和SA的加入對蝦糜中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生顯著影響。如圖8A所示，隨著CaCl2替代量的增大，蝦糜中的β-折疊相對含量相較于對照組顯著上升，0.31% CaCl2替代量蝦糜中β-轉(zhuǎn)角相對含量達(dá)到最大值（38.46%），α-螺旋相對含量達(dá)到最小值（13.43%），這表明CaCl2促進(jìn)了肌球蛋白展開從而形成更有序的蛋白結(jié)構(gòu)，與Nú?ez-Flores等[37]研究結(jié)果相似。與對照組相比，添加SA后蝦糜的β-折疊相對含量略有下降，α-螺旋相對含量由14.30%上升到16.02%，而無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角無顯著變化（P＞0.05）。在此基礎(chǔ)上用CaCl2替代后，各處理組隨著替代量的增加，β-折疊相對含量升高，α-螺旋相對含量無顯著差異。因此，Ca2＋的加入對SA-蝦糜蛋白體系的二級結(jié)構(gòu)無顯著影響，可能是體系中Ca2＋未與MP結(jié)合，而是通過靜電作用與SA結(jié)合形成凝膠，進(jìn)而提高凝膠特性[10,36]。經(jīng)熱誘導(dǎo)處理后蝦糜凝膠二級結(jié)構(gòu)均以β-折疊為主，而無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量無顯著差異（圖8B），這與在熱誘導(dǎo)過程中肌球蛋白發(fā)生聚集有關(guān)[16]。β-折疊相對含量增加表明經(jīng)熱誘導(dǎo)處理后蝦糜蛋白結(jié)構(gòu)比未加熱蝦糜更有序和穩(wěn)定。

圖8 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜（A）及熱誘導(dǎo)凝膠（B）二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of CaCl2 combined with SA on protein secondary structures of shrimp surimi (A) and heat-induced gels (B)

2.10 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜微觀結(jié)構(gòu)的影響

從圖9可以觀察到，添加CaCl2和SA蝦糜凝膠在肌原纖維束、孔洞等方面與對照組相比存在顯著差異。對照組的蝦糜凝膠呈現(xiàn)疏松、多孔的微觀結(jié)構(gòu)，可能是蝦糜中水溶性肌漿蛋白比例高，而肌漿蛋白會影響肌球蛋白的聚集程度進(jìn)而降低MP凝膠形成能力[38]。相較于對照組，隨著CaCl2替代量的增大，形成的蝦糜凝膠聚集體逐漸增多，凝膠網(wǎng)束變粗，孔洞減少，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得緊密，這是因為CaCl2能夠誘導(dǎo)肌球蛋白部分展開，平衡熱凝膠化過程中分子展開與聚集的速率，同時能進(jìn)一步促進(jìn)分子間疏水相互作用和二硫鍵的形成，使蛋白交聯(lián)度增加，形成較為致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[15,27]。添加SA的蝦糜凝膠孔洞減少但仍存在部分較大孔徑，呈現(xiàn)不均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蝦糜凝膠的硬度降低。SA的加入可能會抑制蛋白質(zhì)分子之間的聚集，導(dǎo)致生成較大孔徑，這為固定水分提供更多可能[16,39]。在替代量為0.31% CaCl2的SA-蝦糜蛋白體系中，凝膠聚集程度增加，表面致密性有所提高，但仍存在少量較大孔徑，這表明CaCl2與SA的添加對蝦糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用。當(dāng)CaCl2替代量增加至0.5%時，凝膠結(jié)構(gòu)表面出現(xiàn)明顯聚集體，孔洞增加，對水分的束縛能力降低。綜上所述，CaCl2的添加能夠提高蝦糜凝膠致密性，低濃度CaCl2更有利于SA蝦糜蛋白形成凝膠體系，改善在低鹽條件下肌球蛋白的凝膠性能。

圖9 CaCl2協(xié)同SA對蝦糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.9 Effect of CaCl2 combined with SA on microstructure of shrimp surimi gels

3 結(jié)論

本研究探討了不同替代量CaCl2協(xié)同SA對蝦糜蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠特性的影響。結(jié)果表明，CaCl2替代部分NaCl后，蝦糜的硬度、凝膠強(qiáng)度、流變特性、氫鍵含量和β-折疊相對含量隨著Ca2＋濃度增加顯著上升，可以有效改善蝦糜凝膠特性，形成更有組織的凝膠基質(zhì)。但過量CaCl2會引起蝦糜凝膠特性的劣化，從而使凝膠彈性和持水力均呈現(xiàn)減小趨勢，3D打印支撐性變差。此外，在SA-蝦糜體系中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.31% CaCl2替代量協(xié)同質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% SA可以有效使T22縮短，改變水分分布，改善蝦糜的3D打印支撐穩(wěn)定性，提高蝦糜凝膠的氫鍵含量和疏水相互作用，促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成。綜合考慮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.31% CaCl2替代協(xié)同SA可提高蝦糜制品的凝膠特性，改善蝦糜制品的品質(zhì)，本研究可為制備低鹽蝦糜制品提供新思路。