惠 虹, 胡亞翎, 蔡 堃, 鐘抒宇, 李 飛, 姚春梅

淮北礦工總醫(yī)院1.病理科;2.胃腸外科;3.腫瘤放療科,安徽 淮北 235000

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,早期癥狀不明顯,隨著腫瘤生長而逐漸出現(xiàn)排便習(xí)性改變、便血和腹瀉等癥狀,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-3]。錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)是細(xì)胞間相互作用的重要紐帶,通過在DNA復(fù)制、基因重組及外源損傷等過程中糾正DNA雙螺旋上錯(cuò)配的堿基對(duì),以維持和保障靶細(xì)胞基因組的穩(wěn)定,從而降低基因突變概率[4-6]。MMR的缺失加速正常突變,誘發(fā)原癌基因和抑癌基因的聚集或失活,從而引發(fā)癌變[7-8]。多項(xiàng)研究證實(shí),CRC與MMR蛋白表達(dá)相關(guān),其中約15%的CRC由MMR蛋白表達(dá)缺失所引起[9-11]。本研究旨在探討CRC組織中MMR蛋白及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與臨床病理特征的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取淮北礦工總醫(yī)院自2020年1月至2023年8月收治的81例CRC患者的癌組織及癌旁組織為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):確診為CRC,且術(shù)后病理檢測再次證實(shí)為CRC;腫瘤分期(tumor node metastasis,TNM)為Ⅰ～Ⅳ期[12];術(shù)后均接受輔助化療。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他部位惡性腫瘤或嚴(yán)重器官功能衰竭者;無法提供完整病理組織樣本或臨床數(shù)據(jù)不全者;合并免疫系統(tǒng)疾病或正在接受免疫抑制治療者。其中,男性48例,女性33例;平均年齡(69.98±10.13)歲;直腸癌38例;結(jié)腸癌43例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色 癌組織及癌旁組織均浸泡至10%中性緩沖甲醛溶液中24 h,通過取材、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片處理后,得到組織蠟片。采用全自動(dòng)免疫組化染色儀(德國Leica公司)將處理好的組織蠟片進(jìn)行免疫組化染色。一抗為鼠抗人單克隆抗體、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)同源蛋白2(muts homolog 2,MSH2)抗體(克隆號(hào)RED2)、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)同源蛋白6(muts homolog 6,MSH6)抗體(克隆號(hào)EP49)、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)蛋白2(postmeiotic segregation increased 2,PMS2)抗體(克隆號(hào)EP51)及錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)同源物1(mutl homolog 1,MLH1)抗體(克隆號(hào)GM002)。巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白163(cluster of differentiation 163,CD163)(克隆號(hào)10D6),巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白68(cluster of differentiation 68,CD68)(克隆號(hào)KP1)等均購自上?；蚩萍脊煞萦邢薰尽Ｃ庖呓M化試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺顯色液均購自徠卡生物系統(tǒng)(紐卡斯?fàn)?有限公司。

1.3 染色結(jié)果判定 采用徠卡光學(xué)顯微鏡[型號(hào)DM2500,徠卡生物系統(tǒng)(紐卡斯?fàn)?有限公司]進(jìn)行染色結(jié)果判定。如果目標(biāo)細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域出現(xiàn)黃褐色或棕黃色顆粒,判定為陽性細(xì)胞。無顏色標(biāo)記定為0分,淡黃色標(biāo)記定為1分,棕黃色標(biāo)記定為2分,深褐色標(biāo)記定為3分。視野內(nèi)無陽性細(xì)胞定為0分,0<陽性細(xì)胞占比<10%定為1分,10%≤陽性細(xì)胞占比≤50%定為2分,50%<陽性細(xì)胞占比<75%定為3分,陽性細(xì)胞占比≥75%定為4分。兩項(xiàng)評(píng)分相加定為最終的染色結(jié)果。分?jǐn)?shù)>3分為蛋白表達(dá)正常,分?jǐn)?shù)≤3分為蛋白表達(dá)缺失。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均正常表達(dá)判定為蛋白表達(dá)正常,蛋白表達(dá)缺失≥1種判定為蛋白表達(dá)缺失。先于低倍鏡下確定陽性染色數(shù)量高密度區(qū)域,后于高倍鏡下對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。當(dāng)CD68陽性細(xì)胞<22個(gè)、CD163陽性細(xì)胞<19個(gè)時(shí)判定為低表達(dá),反之判定為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料用例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析篩選CRC組織中MMR蛋白缺失、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)情況 81例CRC患者中, MMR蛋白表達(dá)正常69例(85.19%),MMR蛋白表達(dá)缺失12例(14.81%)。其中,僅MSH6缺失1例(1.23%),僅PMS2缺失2例(2.47%),MSH6和PMS2缺失2例(2.47%),MSH2和MSH6缺失2例(2.47%),MLH1和PMS2缺失5例(6.17%)。

2.2 CRC患者腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況 81例患者中,CD68低表達(dá)42例(51.85%),高表達(dá)39例(48.15%);CD163低表達(dá)46例(56.79%),高表達(dá)35例(43.21%)。

2.3 MMR蛋白、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性 CRC患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、組織分化相關(guān)(P<0.05),與性別、腫瘤形態(tài)、病理類型無關(guān)(P>0.05)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68、CD163與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化相關(guān)(P<0.05),與性別、腫瘤形態(tài)、腫瘤部位、病理類型無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 CRC患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物與臨床病理特征相關(guān)性/例(百分率/%)

2.4 MMR蛋白缺失、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析 腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤位于右半結(jié)腸、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為MMR蛋白缺陷高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05);腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2～4。

表2 MMR蛋白缺失危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析

表3 CD68高表達(dá)危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析

表4 CD163高表達(dá)危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

CRC來源于致癌基因的激活和抑癌基因的失活,這些變化均導(dǎo)致基因微結(jié)構(gòu)改變,從而致使基因組突變,促進(jìn)惡性細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]。MMR通過修復(fù)堿基和插入/缺失錯(cuò)配來防止積累的突變DNA復(fù)制錯(cuò)誤,以確保遺傳信息的穩(wěn)定性[11]。MMR蛋白缺失直接導(dǎo)致MMR系統(tǒng)功能缺失,從而使得錯(cuò)配的堿基DNA片段不能被切除,致使DNA損傷并產(chǎn)生基因突變,促使突變聚集繼而形成腫瘤。有研究報(bào)道,12種MMR基因/蛋白比較容易發(fā)生突變,主要的家族成員包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6[12]。有研究報(bào)道,惡性腫瘤病理特征與MMR表達(dá)缺失明顯相關(guān)[13]。與蛋白表達(dá)正常的CRC患者比較,蛋白表達(dá)缺失的CRC患者更容易出現(xiàn)直徑>5 cm的腫瘤、腫瘤更易出現(xiàn)在右半結(jié)腸和分化程度更差。MMR蛋白缺失具有顯著的特征,包括分化程度差、腫瘤膨脹性增長,少見淋巴細(xì)胞反應(yīng)。這可能是MMR蛋白缺失引發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的結(jié)果。因此,MMR可為早期診斷和抗腫瘤治療提供思路。巨噬細(xì)胞是免疫反應(yīng)的重要組成部分,在各種疾病微環(huán)境中發(fā)揮不同的作用[14]。CD68特異性表達(dá)于巨噬細(xì)胞中,并在細(xì)胞碎片清除中發(fā)揮作用[15]。CD163是一種I型膜蛋白,參與免疫細(xì)胞的內(nèi)吞作用,保護(hù)目標(biāo)組織免受氧化損傷[16]。

本研究結(jié)果顯示,CRC患者M(jìn)MR蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、組織分化相關(guān)(P<0.05),與性別、腫瘤形態(tài)、病理類型無關(guān)(P>0.05)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68、CD163與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化相關(guān)(P<0.05),與性別、腫瘤形態(tài)、腫瘤部位、病理類型無關(guān)(P>0.05)。MMR蛋白的表達(dá)與腫瘤的侵襲性特征如腫瘤直徑和組織分化程度相關(guān),可能反映出MMR系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性中的重要角色;而腫瘤部位的相關(guān)性可能暗示了腸道不同區(qū)域的微環(huán)境因素對(duì)MMR蛋白表達(dá)的潛在影響[17]。CD68與CD163的表達(dá)與晚期腫瘤特征相關(guān),可能反映出腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展和惡化中的促進(jìn)作用[18]。本研究中多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤位于右半結(jié)腸、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為MMR蛋白缺陷高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05);腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。這提示,MMR蛋白缺失在大直徑腫瘤和右半結(jié)腸的CRC患者中更為常見,可能反映了腸道不同部位的腫瘤生物學(xué)行為差異[19-21]。高表達(dá)的CD68和CD163與晚期、低分化腫瘤顯著相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)其在腫瘤免疫逃逸和侵襲性增加中的重要作用[22]。

綜上所述,CRC組織中MMR蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期和組織分化相關(guān),腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期和組織分化相關(guān)。