賀瀟瑾, 周 娟, 龍?jiān)畦T, 李 丹, 歐陽(yáng)靜, 袁 婷, 卿 玲, 譚英征

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院 感染內(nèi)科,湖南 株洲 412006

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個(gè)重大的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題,可導(dǎo)致病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化乃至原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生[1]。明確診斷后積極抗病毒治療可有效抑制HBV DNA的復(fù)制,并最大程度減輕肝細(xì)胞壞死、炎癥及纖維化、肝小葉增生等,是延緩疾病進(jìn)展及改善預(yù)后的有效手段[2]。但有臨床研究發(fā)現(xiàn),20%～40%長(zhǎng)期規(guī)律接受一線核苷(酸)類似物治療的患者仍處于低病毒血癥狀態(tài)(low level viremia,LLV)[3],即采用靈敏的定量聚合酶鏈反應(yīng)法(quantitave polymerase chain reaction,qPCR)檢測(cè)血清HBV DNA持續(xù)或間歇大于檢測(cè)下限但低于2 000 IU/ml[4]。LLV可導(dǎo)致耐藥風(fēng)險(xiǎn)增加、病毒學(xué)突破、肝纖維化進(jìn)展、肝硬化進(jìn)展、肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加等一系列臨床危害[5],因此,開(kāi)發(fā)新的技術(shù)以提高檢測(cè)HBV的靈敏度和特異性對(duì)于指導(dǎo)低病毒載量慢性乙型肝炎人群的臨床管理至關(guān)重要,也有助于實(shí)現(xiàn)最終達(dá)到治愈乙型肝炎的目標(biāo)。多交叉置換擴(kuò)增(multiple cross displacement amplification,MCDA)是一種新型擴(kuò)增技術(shù),能夠在恒溫條件下快速、敏感、特異地?cái)U(kuò)增核酸,明顯提高檢測(cè)效率[6]。近年來(lái),MCDA已被用于檢測(cè)許多病原體,如結(jié)核分支桿菌[7]、膿腫分枝桿菌[8]、李斯特菌[9-10]、腦膜炎奈瑟菌[11]、布魯氏菌[12]、白色念珠菌[13]等。MCDA產(chǎn)物可以通過(guò)多種技術(shù)進(jìn)行分析,包括瓊脂糖凝膠、濁度法、比色法及納米生物傳感器(nanoparticle-based lateral biosensor,LFB)等。其中,LFB是一種特異的核酸檢測(cè)裝置,其根據(jù)MCDA的陽(yáng)性產(chǎn)物可以在1～2 min內(nèi)顯示結(jié)果,陰性表現(xiàn)為一條線,陽(yáng)性為兩條線,直接肉眼觀察即可判斷。既往研究表明,MCDA聯(lián)合LFB具有相對(duì)特異、敏感、經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[7,9-13]。本研究以HBV S基因?yàn)榘袠?biāo),擬應(yīng)用MCDA-LBF技術(shù)建立一種針對(duì)HBV的簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、有效的診斷方法,同時(shí)比較MCDA-LBF與qPCR對(duì)臨床實(shí)際樣本的檢測(cè)能力,以評(píng)估MCDA-LFB檢測(cè)HBV的應(yīng)用價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取株洲市中心醫(yī)院自2020年4月至2022年4月收治的42例擬聯(lián)合聚乙二醇干擾素α-2b(pegylated interferon alpha-2b,Peg-IFNα-2b)抗病毒治療的核苷(酸)類似物經(jīng)治低病毒載量慢性乙型肝炎患者和同期的15例健康受試者為研究對(duì)象。慢性乙型肝炎符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[1]診斷標(biāo)準(zhǔn),排除合并其他嗜肝病毒感染和人類免疫缺陷病毒感染。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢查方法 所有研究對(duì)象分別于聯(lián)用Peg-IFNα-2b抗病毒治療前、治療24周后、治療48周后空腹采集靜脈血5 ml,分離血清后-80℃低溫保存?zhèn)溆谩Ｋ醒獦訕?biāo)本分別采用MCDA-LFB和qPCR兩種方法進(jìn)行HBV DNA平行檢測(cè)。

1.3 主要試劑及儀器 HBV和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(北京擎科生物科技有限公司);DNA核酸提取試劑盒(西安天隆科技有限公司);超敏HBV DNA熒光定量試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司);MCDA核糖核酸擴(kuò)增試劑盒和納米生物傳感檢測(cè)條(天津捷易特生物科技有限公司);孔雀石綠(malachite green,MG)比色指示劑(北京海泰正元科技有限公司);引物合成(北京擎科生物科技公司);實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司);實(shí)時(shí)濁度儀和Nano drop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 MCDA-LFB 嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用DNA核酸提取試劑盒提取DNA模板,通過(guò)Nano drop 2000進(jìn)行定量后,保存于-20℃冰箱待檢。參考相關(guān)資料,采用PRIMER PRIMER 5.0軟件設(shè)計(jì)10條引物(表1),采用BLAST分析工具驗(yàn)證HBV-MCDA引物的特異性,引物合成后用高效液相色普級(jí)別純化。HBV-MCDA反應(yīng)體系為25.0 μl,其中包含反應(yīng)緩沖液12.5 μl,1.0 μl BstDNA聚合酶(8 U),擴(kuò)增引物CP1和CP2各40.0 pmol,C1、D1、R1、C2、D2、R2各20.0 pmol,F1和F2各10.0 pmol,以及1.0 μl DNA模板。將以上混合物置于實(shí)時(shí)濁度儀中,65℃恒溫?cái)U(kuò)增30 min,閾值>0.1視為陽(yáng)性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)中用HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照,HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)品為陰性對(duì)照,蒸餾水為空白對(duì)照。為驗(yàn)證HBV-MCDA的敏感性,將HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別稀釋為5.0 IU/ml、0.5 IU/ml。擴(kuò)增產(chǎn)物采用比色指示劑(MG)和LFB兩種方法進(jìn)行檢測(cè)及驗(yàn)證。對(duì)于MG檢測(cè),反應(yīng)體系的顏色由無(wú)色變?yōu)闇\綠色表明陽(yáng)性擴(kuò)增,顏色保持無(wú)色為陰性擴(kuò)增。在LFB檢測(cè)中,對(duì)照線和檢測(cè)線同時(shí)出現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增,僅出現(xiàn)對(duì)照線為陰性擴(kuò)增。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次。

表1 HBV-MCDA引物信息

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV-MCDA產(chǎn)物檢測(cè)及驗(yàn)證 稀釋為5.0 IU/ml的HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果,而稀釋為0.5 IU/ml的HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、蒸餾水為陰性結(jié)果。見(jiàn)圖1。本研究用于HBV S基因檢測(cè)的HBV-MCDA引物對(duì)于建立HBV-MCDA檢測(cè)方法的特異性良好,HBV-MCDA的最低檢測(cè)下限為5.0 IU/ml。

圖1 HBV-MCDA產(chǎn)物檢測(cè)及驗(yàn)證[a.HBV-MCDA擴(kuò)增產(chǎn)物采用比色指示劑(MG)肉眼觀察顏色變化進(jìn)行分析:A1管為HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽(yáng)性擴(kuò)增(稀釋為5.0 IU/ml),A2管為HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陰性擴(kuò)增(稀釋為0.5 IU/ml),A3管為HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陰性對(duì)照(稀釋為0.5 IU/ml),A4管為蒸餾水空白對(duì)照(稀釋為0.5 IU/ml);b.LFB對(duì)HBV-MCDA擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化檢測(cè):LFB-B1為HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽(yáng)性擴(kuò)增(稀釋為5.0 IU/ml),LFB-B2為HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陰性擴(kuò)增(稀釋為0.5 IU/ml),LFB-B3為HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陰性對(duì)照(稀釋為0.5 IU/ml),LFB-B4為蒸餾水空白對(duì)照(稀釋為0.5 IU/ml)]

2.2 聯(lián)合Peg-IFNα-2b治療前病毒載量檢測(cè)結(jié)果比較及一致性分析 MCDA-LFB、qPCR兩種方法檢測(cè)的HBV DNA下限分別為5 IU/ml、20 IU/ml。因此,本實(shí)驗(yàn)規(guī)定HBV DNA>20 IU/ml為檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,反之為陰性。在57例樣本的基線HBV DNA平行檢測(cè)中:MCDA-LFB檢出陽(yáng)性標(biāo)本42例,陽(yáng)性檢出率為73.7%(42/57),陰性檢出率為26.3%(15/57);qPCR檢出陽(yáng)性標(biāo)本38例,陽(yáng)性檢出率為66.7%(38/57),陰性檢出率為33.3%(19/57)。見(jiàn)表2。兩種方法的陽(yáng)性檢出率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125)。進(jìn)一步行一致性分析,結(jié)果顯示,Kappa=0.833,P<0.001,說(shuō)明兩種方法的診斷結(jié)果存在較好的一致性。

表2 MCDA-LFB、qPCR檢測(cè)臨床樣本的基線HBV DNA結(jié)果比較/例

2.3 聯(lián)合Peg-IFNα-2b治療不同階段病毒載量檢測(cè)結(jié)果比較及一致性分析 在治療24周后,MCDA-LFB陽(yáng)性檢出率為49.1%(28/57),qPCR陽(yáng)性檢出率為7.0%(4/57),MCDA-LFB陽(yáng)性檢出率高于qPCR,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);Kappa=0.295,P=0.035,提示兩種方法存在一致性,但一致性情況較基線水平(Kappa=0.833,P<0.001)明顯下降。在治療48周后,MCDA-LFB陽(yáng)性檢出率為33.3%(19/57),qPCR陽(yáng)性檢出率為3.5%(2/57),MCDA-LFB陽(yáng)性檢出率高于qPCR,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);Kappa=0.136,P=0.042,提示兩種方法一致性成立,但一致性情況較差。

3 討論

雖然乙型肝炎疫苗已在全球普及,但HBV感染及其所致的相關(guān)肝病仍是我國(guó)乃至全世界需要攻克的一大難題。HBV感染肝后,病毒的持續(xù)復(fù)制是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的重要原因,因此,HBV的檢測(cè)對(duì)于抗病毒治療的決策及長(zhǎng)期疾病進(jìn)展的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。目前,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和PCR相關(guān)技術(shù)是臨床上應(yīng)用廣泛的HBV鑒定方法[14]。ELISA是基于針對(duì)HBV抗原或抗體的血清學(xué)反應(yīng),只能反映HBV的免疫應(yīng)答狀態(tài),且在感染的早期階段敏感性較低;qPCR檢測(cè)HBV DNA具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn),現(xiàn)已成為監(jiān)測(cè)HBV復(fù)制最常用的檢測(cè)手段之一[15]。但qPCR需要依賴昂貴的熱循環(huán)儀器來(lái)擴(kuò)增靶基因,且檢測(cè)繁瑣、耗時(shí),在許多資源有限的地區(qū)無(wú)法廣泛開(kāi)展。本研究建立了一種簡(jiǎn)單、低成本、敏感性和特異性均較好的MCDA-LFB方法來(lái)檢測(cè)HBV。

MCDA技術(shù)根據(jù)目標(biāo)基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)10條引物特異性識(shí)別靶序列上的10個(gè)獨(dú)立區(qū)域,在恒溫條件下(約58℃～69℃),在一種置換酶聚合酶的作用下,短時(shí)間內(nèi)(15～40 min)引起多循環(huán)鏈置換反應(yīng),大量合成目標(biāo)DNA[16],因此,反應(yīng)特異性強(qiáng),且快速、敏感。LFB具有較高的生物相容性、吸附性及反應(yīng)活性,被廣泛用于檢測(cè)一些病原體的MCDA產(chǎn)物[17]。相較于瓊脂凝膠電泳、濁度分析和比色指示劑檢測(cè),LFB可以更加客觀、準(zhǔn)確且快速地判斷出結(jié)果。本研究參考了相關(guān)文獻(xiàn)及設(shè)備[18],根據(jù)MCDA作用機(jī)制設(shè)計(jì)了10條HBV-MCDA引物,特異性識(shí)別HBV S基因10個(gè)區(qū)域,在65℃恒溫?cái)U(kuò)增30 min,通過(guò)比色法及LFB分析擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果顯示:稀釋為5.0 IU/ml的HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果,而稀釋為0.5 IU/ml的HBV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、HCV核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、蒸餾水為陰性結(jié)果;本研究用于HBV S基因檢測(cè)的HBV-MCDA引物對(duì)于建立HBV-MCDA檢測(cè)方法的特異性良好,HBV-MCDA的最低檢測(cè)下限為5.0 IU/ml。目前,我院已開(kāi)展的高敏qPCR檢測(cè)HBV DNA最低下限是 20 IU/ml,檢測(cè)時(shí)間約2～3 h,費(fèi)用較高。相比之下,HBV的MCDA-LFB檢測(cè)方法不僅操作時(shí)間短,所有流程在1 h內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn),而且所需的設(shè)備較為簡(jiǎn)單,提供恒溫設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用,成本相對(duì)較低,同時(shí),該項(xiàng)檢測(cè)具備較高的特異性和更高的敏感性,因此,對(duì)于臨床上提高HBV感染的診斷率、降低漏診率具有極大的輔助作用。

在慢性乙型肝炎患者抗病毒治療過(guò)程中,每個(gè)個(gè)體治療應(yīng)答情況不盡相同,有臨床研究證實(shí),部分慢性乙型肝炎患者長(zhǎng)期接受核苷(酸)類似物治療后仍持續(xù)或間接存在LLV,且其與多種臨床不良結(jié)局相關(guān)[19]。由于檢測(cè)下限的不同,LLV的檢出率也存在較大差異。目前,國(guó)內(nèi)針對(duì)HBV DNA的高敏qPCR檢測(cè)下限多為20 IU/ml,隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,當(dāng)采用更高靈敏的檢測(cè)方法時(shí),既往認(rèn)為持續(xù)完全病毒學(xué)應(yīng)答的患者可能會(huì)被歸類為L(zhǎng)LV。因此,近期有學(xué)者提出極低水平病毒血癥(very low-level viremia,VLLV)的概念,即定義為HBV DNA<20 IU/ml但大于更高靈敏PCR的檢測(cè)下限(5～10 IU/ml),在部分VLLV患者中可以觀察到有肝硬化、肝癌等不良事件發(fā)生[20]。在本研究中:聯(lián)合Peg-IFNα-2b治療前,MCDA-LFB陽(yáng)性檢出率為73.7%(42/57),qPCR陽(yáng)性檢出率為66.7%(38/57),兩種方法的陽(yáng)性檢出率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.125);一致性分析結(jié)果顯示,Kappa=0.833,P<0.001,兩種方法的診斷結(jié)果存在較好的一致性。但隨著聯(lián)用Peg-IFNα-2b抗病毒治療后,出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的患者增加,在治療24周、48周后,兩種方法的檢出率一致性明顯下降,MCDA-LBF的陽(yáng)性檢出率高于qPCR。

本研究存在一定的局限性。首先,MCDA-LFB是對(duì)HBV DNA的定性測(cè)定,不能確定樣本中的病原體數(shù)量,因此,需要設(shè)計(jì)一個(gè)更精確的研究實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定。其次,盡管MCDA-LFB具有較高的特異性和敏感性,但仍需要控制實(shí)驗(yàn)室污染造成假陽(yáng)性結(jié)果的可能,通過(guò)第三方試劑幫助驗(yàn)證。最后,本研究中的研究對(duì)象選擇并非完全隨機(jī),還需要通過(guò)大樣本、多中心的數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)方法的適用性。

綜上所述,MCDA-LFB是一種敏感、特異、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法,可用于低病毒載量慢性乙型肝炎人群的診斷,尤其對(duì)于抗HBV治療后的極低病毒水平檢測(cè),MCDA-LFB比qPCR更敏感。HBV MCDA-LFB擴(kuò)增效率高,操作過(guò)程簡(jiǎn)單,更節(jié)省時(shí)間和成本,且具有更高的敏感性,有成為經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)且缺少檢測(cè)設(shè)備地區(qū)進(jìn)行HBV快速檢測(cè)及指導(dǎo)慢性乙型肝炎患者臨床管理新方法的巨大潛力。