劉 晶, 梅 竹, 周 婷, 劉春影, 劉 丹, 閆承慧, 宋海旭

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 寒地心血管病全國重點實驗室 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016

血小板是外周循環(huán)血液中重要的組成部分,呈圓盤狀的無核小細胞,胞漿中含有大量的細胞器和分泌顆粒[1-2]。血小板的主要功能表現(xiàn)在維持出血和止血的動態(tài)平衡,也參與調(diào)控炎癥反應和組織修復等病理生理過程[3-4]。巨核細胞是血小板的前體細胞,經(jīng)過增殖、分化和多倍體化等一系列復雜的過程后分泌血小板。巨核細胞的成熟障礙可能會導致血小板的數(shù)目和功能異常,引起血小板相關(guān)的疾病[5-6]。目前,調(diào)控巨核細胞成熟障礙的研究機制仍需要深入探索。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes 1,Creg1)是含有220個氨基酸的分泌型糖蛋白,具有促進組織和細胞成熟分化的作用。多項研究已經(jīng)證實,Creg1是調(diào)控心血管系統(tǒng)的重要因子[7-10]。本研究旨在構(gòu)建巨核細胞/血小板特異性Creg1基因敲除小鼠,誘導胎肝巨核細胞分化,為研究Creg1在巨核細胞分化和血小板生理功能中的作用提供實驗工具和方法?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取4只8周齡雌性健康Creg1flox/flox小鼠,12只8周齡雄性健康Pf4-Cre+小鼠,體質(zhì)量20～25 g,購自集萃藥康生物有限公司。經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物管理委員會批準,標準飼養(yǎng)條件。雌性Creg1flox/flox小鼠與雄性血小板因子4(platelet factor 4,Pf4)-Cre+小鼠繁育,獲得Creg1flox/wtPf4-Cre+小鼠,進一步交配獲得巨核細胞/血小板特異性Creg1敲除小鼠(Creg1flox/floxPf4-Cre+,簡寫Creg1-/-)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司(美國);胎牛血清購自Gibico公司(美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司(日本);引物購自Sangon Biotech公司(中國);濾網(wǎng)(100/70/40 μm)購自Sangon Biotech公司(中國);重組血小板生成素(15 000 IU)購自沈陽三生制藥有限公司;Trizol裂解液購自Invitrogen公司(美國)。

1.3 Creg1-/-小鼠的構(gòu)建方法及基因型的鑒定 利用Cas9/RNA system gene targeting的技術(shù)手段,構(gòu)建針對小鼠Creg1基因的gRNA,指導Cas9蛋白在特定位點剪切Creg1基因的DNA雙鏈。小鼠Creg1基因共有4個外顯子,經(jīng)Cre/loxP切除第2和第3外顯子,造成移碼突變,終止翻譯,完成Creg1基因的失活。子代小鼠4周齡時,提取鼠耳組織進行基因鑒定[11]。

1.4 熒光定量聚合酶鏈式反應檢測Creg1的表達情況 采用Trizol法提取巨核細胞中的總RNA,按照實驗說明進行去除基因組DNA,再進行逆轉(zhuǎn)錄反應和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)。m-Creg1 Forward:GTGGCACTACTGGTGTCGC;m-Creg1 Reverse:CGCGCACCTCCTTTATTGTG;m-Gapdh Forward:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG;m-Gapdh Reverse:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.5 小鼠胎肝巨核細胞誘導分化 選取孕齡約15 d的孕鼠,麻醉處死,無菌條件下取出胎肝。將胎肝磨碎,用10%胎牛血清的DMEM沖洗。室溫條件下400 g離心5 min,加入適量的1×紅細胞裂解液,室溫下放置10 min。DMEM中和,400 g離心5 min,倒掉上清后用10%胎牛血清的DMEM重懸細胞,濾網(wǎng)過濾。將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中,加入濃度為15 IU/ml的血小板生成素,孵育培養(yǎng)4 d,每天加1次同等劑量的血小板生成素[12]。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Creg1-/-小鼠的構(gòu)建情況 本研究利用Cas9/RNA system gene targeting的技術(shù)手段成功構(gòu)建了Creg1-/-小鼠(圖1a)。收取小鼠鼠耳組織,提取基因組,對子代小鼠進行基因鑒定(圖1b)。

圖1 Creg1-/-小鼠的構(gòu)建和鑒定情況(a.構(gòu)建示意圖;b.PCR擴增鑒定)

2.2 應用實時熒光定量PCR檢測巨核細胞中Creg1 mRNA的表達水平 與Creg1flox/flox小鼠比較,Creg1-/-小鼠巨核細胞中Creg1 mRNA的表達量顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 實時熒光定量PCR檢測巨核細胞中Creg1 mRNA的表達

2.3 Creg1-/-小鼠胎肝巨核細胞的誘導分化情況 與Creg1flox/flox小鼠比較,Creg1-/-小鼠胎肝巨核細胞誘導分化4 d時,光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)巨核細胞的直徑明顯變小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 胎肝巨核細胞的誘導分化情況(a.光鏡下觀察巨核細胞分化4 d時的直徑大小;b.Creg1flox/flox小鼠與Creg1-/-小鼠巨核細胞直徑比較)

3 討論

巨核細胞是產(chǎn)生血小板的前體細胞,成熟分化障礙會導致血小板的數(shù)目減少或功能異常。調(diào)控巨核細胞增殖、分化、多倍體化和前血小板釋放的機制十分復雜,促進巨核細胞的成熟和血小板生成的機制尚不明確[13-14],仍有很多爭議,需要研究者們應用不同的實驗方法和工具去深入探索。

本研究發(fā)現(xiàn),Creg1在機體發(fā)育和維持機體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要功能,能夠促進心肌、脂肪、血管和平滑肌等組織細胞分化[15-17]。目前,筆者團隊已經(jīng)構(gòu)建了Creg1基因在心臟、脂肪、骨骼肌和單核細胞等組織細胞特異性敲除的工具小鼠,深入地闡述了相關(guān)疾病的發(fā)生機制,并給予了藥物和小分子化合物的干預[18-20]。本研究中,Creg1flox/flox小鼠和Creg1-/-小鼠作為研究血小板相關(guān)疾病機制的實驗工具小鼠被成功構(gòu)建和基因鑒定。隨后,本研究進一步誘導Creg1flox/flox小鼠和Creg1-/-孕鼠的胎肝巨核細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Creg1基因的敲除導致了巨核細胞直徑變小,可能會引起巨核細胞分化和多倍體過程異常,最終導致血小板生成的數(shù)目和生理功能發(fā)生改變。這提示,Creg1在巨核細胞成熟過程中可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述,Creg1-/-小鼠作為研究巨核細胞和血小板相關(guān)疾病發(fā)生機制的實驗工具鼠,可能揭示尚未發(fā)現(xiàn)和闡明的重要病理生理學機制,為臨床治療血小板疾病提供理論基礎(chǔ)支持。