林文松,黃 冠,林寶行

(深圳市龍崗中心醫(yī)院,廣東 深圳 518000)

約有50%的甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌,可局限于甲狀腺病灶內(nèi)數(shù)年,臨床高發(fā)群體為兒童或女性[1]。甲狀腺乳頭狀癌生長較緩慢,可由原發(fā)部位經(jīng)腺內(nèi)淋巴管向其他腺體部位擴(kuò)散[2]。BRAF V600E基因突變發(fā)生于29%～83%的甲狀腺癌,激活RAS/RAF/促分裂原活化蛋白激酶途徑congress導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。本研究分析甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征與BRAF V600E基因之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2019年7月～2020年2月在深圳市龍崗中心醫(yī)院就診的甲狀腺乳頭狀癌患者100例,年齡26～67歲,平均(52.4±3.2)歲;男34例,女66例。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。納入標(biāo)準(zhǔn):符合WHO制定的甲狀腺乳頭狀癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3];經(jīng)臨床病理檢查、超聲等檢查確診。組織學(xué)分型:混合型21例,囊內(nèi)型12例,嗜酸細(xì)胞型10例,高細(xì)胞型16例,濾泡型10例,經(jīng)典型31例。病變部位:其中46例局限于甲狀腺內(nèi);腫瘤直徑1～4 cm,平均(2.1±0.3)cm;腫瘤單發(fā)62例,多發(fā)38例。疾病分期:Ⅰ期～Ⅱ期58例,Ⅲ期～Ⅳ期42例。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。

1.2方法:白片切取腫瘤組織蠟塊,提取DNA,厚度為8 μm,白片內(nèi)刮取腫瘤組織。根據(jù)DNA試劑說明書嚴(yán)格執(zhí)行,提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增,引物合成,PAGE純化。PCR反應(yīng)體系:10 μl去離子水,1 μl引物(3.2 μmol/L),8 μl BigDye(2.5X),1 μg/L PCR純化產(chǎn)物(10 μg/L);PCR反應(yīng)產(chǎn)物:95℃預(yù)變性7 min,95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s,共循環(huán)40次,72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物后純化,PCR產(chǎn)物純化后測序。BRAF擴(kuò)增測序:50 μl反應(yīng)體積,含DNA模板50 ng,10 pmol上、下游引物,1.5U Taq酶,0.2 mmol/L dNTPs終濃度。乙醇、醋酸鈉純化測序產(chǎn)物后,基因分析儀測序基因,應(yīng)用Sequencing軟件讀取序列。RO82-W-1、K1提取濃度為30 ng/μl DNA,將BRAF基因V600E突變(K1)、RO82-W-1野生型BRAF基因的DNA相混合,獲得DNA混合模板(1%、3%、10%、25%、50%突變),30 ng等位基因PCR特異性擴(kuò)增,DHPLC分析擴(kuò)增產(chǎn)物。分析甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和BRAF V600E基因、BRAF之間的關(guān)系。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS21.0軟件系統(tǒng)處理分析,計數(shù)資料以[n(%)]表示,行χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對BRAF V600E基因突變、甲狀腺乳頭狀癌病理因素Logistic回歸分析,亞變量為多分類變量,自變量為患者的資料,因變量為BRAF V600E基因突變,逐步回歸變量篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和BRAF V600E基因突變:BRAF V600E基因突變、BRAF蛋白表達(dá)與腫瘤隨診6個月～2年復(fù)發(fā)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、腫瘤大小、年齡等因素密切相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),100例甲狀腺乳頭狀癌出現(xiàn)鈣化者為47例(47.0%),通常具有粗大片狀鈣化、砂礫樣鈣化,研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變狀態(tài)與鈣化類型、是否出現(xiàn)鈣化無明顯相關(guān)性。見表1～3,圖1～4。

圖1 腫瘤組織侵襲甲狀腺被膜外橫紋肌組織(HE,×20)

圖2 甲狀腺乳頭狀癌高細(xì)胞亞型,癌細(xì)胞寬度為高度的1/3 (HE,×40)

圖3 BRAF V600E未發(fā)生突變,為野生型

圖4 BRAF V600E 基因突變型

表1 甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和BRAF V600E基因突變及BRAF蛋白表達(dá)分析[n(%)]

表2 甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E基因突變影響因素的Logistic回歸分析

表3 甲狀腺乳頭狀癌B-raf蛋白表達(dá)影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌超聲聲像圖顯示邊界明確、呈不規(guī)則狀,為玻璃樣變性,內(nèi)部回聲欠均勻,實質(zhì)性,內(nèi)部出現(xiàn)乳頭狀凸起,囊腫大小不一,部分實質(zhì)出現(xiàn)纖維化,隨著病情的進(jìn)展出現(xiàn)鈣化、甚至骨化[4-5]。橋本甲狀腺炎、碘缺乏、甲狀腺腫物質(zhì)、放射性物質(zhì)、環(huán)境、遺傳、激素等因素均為甲狀腺乳頭狀癌的誘發(fā)因素[6-7]。甲狀腺乳頭狀癌首發(fā)臨床特征為無痛性頸部腫物,隨著吞咽可上下移動,少數(shù)出現(xiàn)壓迫感、吞咽困難、聲音嘶啞等癥狀[8-9]。近年隨著基因測序的不斷發(fā)展,發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌與某些基因突變密切相關(guān),同時可用于評估臨床預(yù)后[10-11]。目前,甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征與BRAF 600E基因之間的關(guān)系已成為醫(yī)學(xué)熱點研究課題[12]。

本研究觀察甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和BRAF V600E基因之間的關(guān)系,結(jié)果與Elliott Range D等[13]的研究結(jié)果大體一致,ERK/MAP激酶信號通路和下游產(chǎn)物對細(xì)胞的增殖及分裂起到重要作用[14]。BRAF基因編碼為絲氨酸-蘇氨酸激酶,基因位于7q34,是KRAS的下游反應(yīng)分子,是最強(qiáng)的MAPK信號傳導(dǎo)通路激活劑,密碼子600突變是其主要的突變位點,激活磷酸化后在傳導(dǎo)RAS-RAF-NEK-ERK信號通路中發(fā)揮重要作用[15-16];BRAF常在第15號外顯子密碼子600位點出現(xiàn)突變,胸腺嘧啶向腺苷酸轉(zhuǎn)化后,頡氨酸在氨基酸水平代替谷氨酸,突變位點又稱為BRAF V600E[17-18]。約有30個BRAF基因位點突變,其中90%為V600E。臨床發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌與腫瘤復(fù)發(fā)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期Ⅲ期～Ⅳ期、腫瘤直徑3～4 cm、年齡超過45歲者的BRAF V600E基因突變率更高,說明甲狀腺乳頭狀癌的BRAF V600E基因突變可用于評估甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后狀態(tài)。甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后與甲狀腺被膜外侵犯密切相關(guān),病灶組織侵襲被膜及鄰近被膜時的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率顯著增高,說明病灶組織侵襲甲狀腺外后極易出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管道播散。同時研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺乳頭狀癌經(jīng)典亞型的BRAF突變比率顯著升高,顯著高于嗜酸細(xì)胞型及濾泡型。100例甲狀腺乳頭狀癌出現(xiàn)鈣化者為47例(47.0%),通常具有粗大片狀鈣化、砂礫樣鈣化,研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變狀態(tài)與鈣化類型、是否出現(xiàn)鈣化無明顯相關(guān)性。BRAF基因主要職責(zé)在于RAF激酶蛋白的細(xì)胞信號傳遞編碼,致癌基因為VRAF基因,該蛋白屬于RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的組成部分,可導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞。BRAF突變是甲狀腺乳頭狀癌的常見發(fā)病原理。在正常情況下,RAF蛋白會按照信號接收狀態(tài)對下游信號通路的細(xì)胞及活動進(jìn)行控制,但BRFA基因產(chǎn)生于致病性突變時,可持續(xù)激活RAF蛋白,在未接收到化學(xué)信號時也持續(xù)對其下游通路傳導(dǎo)信號,導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的增殖與生長。V600E為常見的致癌性BRAF基因突變位點。

綜上所述,甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理指標(biāo)與BRAF V600E基因突變、B-raf蛋白表達(dá)密切相關(guān),是評估甲狀腺乳頭狀癌的相關(guān)預(yù)后因子之一。