鮑鑫宇,周慶偉

1.阜外華中心血管病醫(yī)院,河南 鄭州 450000; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥為主要特征,多由變應(yīng)原刺激而誘發(fā),多以呼吸困難、喘息、胸悶、咳嗽等為主癥,具有可逆性呼氣氣流受限及氣道高反應(yīng)的異質(zhì)性疾病。世界哮喘發(fā)病率以1.4%～2.1%的速度逐年上升,預(yù)計到2025年,全球?qū)⑿略?億哮喘患者[1]。2019年我國哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示,總發(fā)病率為4.2%,男性高于女性,農(nóng)村多于城鎮(zhèn),總患者達4 570萬[2]。支氣管哮喘是臨床常見病,多反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈,加重社會經(jīng)濟負擔(dān)。西醫(yī)治療急性發(fā)作期哮喘有較好的臨床療效,但停藥后容易復(fù)發(fā),遠期療效不佳的弊端還沒有解決。中醫(yī)對哮喘的認識歷史悠久,中醫(yī)藥輔助治療往往能緩解西藥不良反應(yīng)、縮減病程、增強免疫、預(yù)防復(fù)發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn),固本平喘劑能改善哮喘癥狀及肺功能,且療效確切[3]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,利用生信技術(shù)發(fā)掘固本平喘劑作用機制,為后期實驗奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 獲取固本平喘劑活性成分及靶標在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP數(shù)據(jù)庫以“防風(fēng)”為關(guān)鍵詞,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)>30%,類藥性(drug-likeness,DL)>0.18為條件篩選其活性成分及靶標,利用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫注釋靶標;在中藥與化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫以“補骨脂、地龍”為關(guān)鍵詞,利用瑞士生物信息研究所(SIB)平臺設(shè)置藥物動力學(xué)參數(shù)(absorption為high,Druglikeness中的5種規(guī)則至少符合3項),獲得“補骨脂、地龍”主要活性成分,并利用SwissTargetPrediction在平臺中獲得其所對應(yīng)的靶標[4-5]。

1.2 支氣管哮喘靶標基因的獲取在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫Genecards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫中以“Bronchial asthma”為關(guān)鍵詞,檢索與支氣管哮喘相關(guān)靶標基因[6-7]。

1.3 固本平喘劑治療支氣管哮喘潛在作用靶點預(yù)測通過Venny 2.1繪圖工具,將固本平喘劑主要活性成分對應(yīng)的靶基因與支氣管哮喘靶基因相映射,獲得固本平喘劑治療支氣管哮喘的關(guān)鍵作用靶基因。

1.4 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析利用Cytoscape 3.6.1構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點(node)代表補骨脂、地龍、防風(fēng)活性成分、關(guān)鍵靶基因,邊(edge)代表活性成分與靶基因相互作用關(guān)系。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建篩選與潛在作用靶蛋白之間有相互作用關(guān)系的靶蛋白,將1.3篩選出的共同靶標導(dǎo)入String數(shù)據(jù)平臺,將蛋白種類定義為“Homo sapiens”,設(shè)置信度>0.9為篩選條件,獲取蛋白相互作用關(guān)系,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1中,并運用其插件“Network Analyze”分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù),以節(jié)點度值越大說明其越重要[8]。

1.6 基因富集分析及其可視化將固本平喘劑與支氣管哮喘的共同基因?qū)牍δ茏⑨屔镄畔W(xué)分析平臺(DAVID)數(shù)據(jù)庫,進行基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析和基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析。篩選P<0.001的通路,選取富集基因數(shù)最多的前10條通路,并繪制高級氣泡圖[9]。

1.7 分子對接為了支撐預(yù)測的可靠性,進行分子對接,為了驗證固本平喘劑活性成分預(yù)測靶點的準確性,利用Autodock vina軟件使預(yù)測靶點與固本平喘劑的核心活性成分進行對接,篩選結(jié)合能最低的結(jié)構(gòu)為最優(yōu)結(jié)構(gòu)[10]。

2 結(jié)果

2.1 固本平喘劑活性成分與相應(yīng)靶點通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫和中藥與化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫進行篩選,符合篩選條件的共有53個活性成分,補骨脂18個,地龍17個,防風(fēng)18個,見表1。

表1 固本平喘劑活性成分

2.2 支氣管哮喘潛在靶點預(yù)測通過GenCards、OMIM數(shù)據(jù)庫剔除重復(fù)后,共收集支氣管哮喘潛在靶點2 358個。

2.3 固本平喘劑治療支氣管哮喘潛在作用靶點將固本平喘劑和支氣管哮喘靶點進行映射取交集共得到237個交叉靶點,即固本平喘劑治療支氣管哮喘潛在作用靶點,見圖1。

圖1 固本平喘劑和支氣管哮喘靶點韋恩圖

2.4 構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)在Cytoscape 3.6.1軟件中導(dǎo)入固本平喘劑的活性成分與潛在作用靶點,構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò),見圖2。此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點293個,邊765條。節(jié)點(node)代表固本平喘劑所含中藥防風(fēng)、地龍、補骨脂,其活性成分以及治療支氣管哮喘潛在作用靶點;邊(edge)代表其相互作用關(guān)系。以degree值排名前10位的活性化合物包括補骨脂雙氫黃酮(bavachin)、異補骨脂雙氫黃酮(isobavachin)、補骨脂雙氫黃酮甲醚(bavachinin)、補骨脂色烯查耳酮(bavachromene)、異補骨脂查耳酮(isobavachalcone)、補骨脂呋喃查耳酮(bakuchalcone)、漢黃芩素(wogonin)、補骨脂酚(bakuchiol)、新補骨脂查耳酮(neobavachalcone)、β-谷甾醇(beta-sitosterol),度值分別為62、62、61、57、57、37、31、28、27、26;以degree值大于二倍均值的靶點為PTGS2、ESR1、ACHE、ESR2、PTGS1、DPP4、ADORA3,表明以上活性成分及靶點在網(wǎng)絡(luò)中的具有一定的重要性。

注：紅色節(jié)點為藥物,綠色節(jié)點為活性成分,黃色節(jié)點為靶點。圖2 固本平喘劑-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將固本平喘劑可能與支氣管哮喘相關(guān)的237個靶蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中,獲取其相互作用關(guān)系,利用Cytoscape 3.6.1軟件可視化,得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3。圖中共涉及237個節(jié)點、1 540條邊,其中,節(jié)點越大度值越大,其關(guān)系越密切,其在網(wǎng)絡(luò)中更重要。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲數(shù)據(jù)進一步分析可知,degree值排名前5位的靶蛋白為PIK3CA、MAPK3、MAPK1、TP53、AKT1。

注：紅色節(jié)點代表靶蛋白,綠色邊代表靶蛋白相互作用,degree越大則節(jié)點越大。圖3 固本平喘劑核心靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫,將固本平喘劑與支氣管哮喘相映射的靶點進行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析,以“count”排名制作柱狀圖及高級氣泡圖。通過GO功能富集分析可知,富集基因數(shù)量前10位的生物過程是炎癥反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄DNA模板、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化、凋亡過程的負調(diào)控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、肽基絲氨酸磷酸化、調(diào)節(jié)細胞增殖,見圖4。這提示支氣管哮喘的發(fā)生,涉及多種生物過程,而固本平喘劑可以通過對以上多種生物過程的調(diào)節(jié),起到治療支氣管哮喘的作用。KEGG通路富集分析可知,固本平喘劑治療支氣管哮喘的靶標主要與PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、HTLV-I感染、甲型流感、HIF-1信號通路、TNF信號通路、趨化因子信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等通路關(guān)系較為密切,見圖5。以上結(jié)果表明,固本平喘劑可能通過多通路共同起到治療支氣管哮喘的作用。

圖4 固本平喘劑靶點的GO(BP-CC-MF)富集分析柱狀圖

圖5 固本平喘劑治療支氣管哮喘靶標的KEGG通路富集氣泡圖

2.7 分子對接將2.4篩選的14個主要活性成分作為小分子配體,通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載保存為“SDF”格式文件;將2.5下Degree值排名前5的蛋白靶點作為受體,通過PDB數(shù)據(jù)庫下載保存為“PDB”格式文件,利用PyMOL軟件去水加氫后將受體及配體保存成“pdbqt”格式文件,利用Autodock Vina進行分子對接,篩選結(jié)合能絕對值最高的為最優(yōu)結(jié)構(gòu),見圖6。結(jié)果顯示：固本平喘劑活性成分均能與關(guān)鍵靶標穩(wěn)定結(jié)合,其中,4個對接(5.7%)的結(jié)合能值<-9.0(結(jié)合能力高,構(gòu)象穩(wěn)定),44個對接(62.9%)在-7.0～-9.0 之間(結(jié)合能力較高),有21個結(jié)合(30.0%)在-5.0～-7.0 之間(結(jié)合能力一般),有1個(1.4%)>-5.0(結(jié)合能力差或不能結(jié)合);與PIK3CA結(jié)合最好的為isopsoralidin(結(jié)合能為-9.9 kcal·mol-1),其次為bavachromene(結(jié)合能為-9.2 kcal·mol-1)分子對接模式,見圖7、圖8。由此可見,固本平喘劑的活性成分和關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力較好,從側(cè)面初步證明了預(yù)測結(jié)果的可靠性。

圖6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)

圖7 固本平喘劑分子對接

3 討論

哮喘多以發(fā)作性咳嗽、胸悶、氣喘、甚至呼吸困難,易反復(fù)發(fā)作為特征,是一種由多種細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病。西醫(yī)多從緩解氣道痙攣和改善氣道炎癥治療。元代醫(yī)家朱丹溪首創(chuàng)“哮喘”病名,明確病機于痰,確立“未發(fā)以扶正為主,既發(fā)以攻邪為急”的施治要領(lǐng)。后世醫(yī)家認為“哮必兼喘”,故統(tǒng)稱哮喘。哮喘病機多由邪氣、飲食、勞倦、情志誘發(fā),以肺、脾、腎氣虛為本,痰飲伏肺為標,痰滯氣道,痰氣相搏,發(fā)為本病。針對病機中醫(yī)治療多以標本兼治、補虛瀉實為主。固本平喘劑是由補骨脂、防風(fēng)、地龍三藥組成,共達補肺健脾、補腎納氣、化痰平喘之功。《本草分經(jīng)》云：“補骨脂辛、苦,大溫,入心包命門,補相火以通君火,暖丹田,壯元陽,能納氣歸腎。”《藥類法象》云：“防風(fēng)治風(fēng)通用。瀉肺實,散頭目中滯氣,除上焦風(fēng)邪?！薄渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載地龍清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿,多用于肺熱哮喘,喉中哮鳴有聲者。

固本平喘劑對于急性支氣管哮喘治療效果較好,但其作用機制尚不清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以全面、聯(lián)系的思想,科學(xué)闡釋其治療哮喘的作用機制。有研究表明,補骨脂雙氫黃酮甲醚可以調(diào)控GATA-3的水平,抑制Th2細胞因子的產(chǎn)生,對哮喘氣道炎癥具有抑制作用[11]。異補骨脂查爾酮通過抑制STAT6磷酸化及GATA-3的表達達到抑制白細胞介素(interleukin,IL)-4的表達,減少氣道高反應(yīng)性、嗜酸性粒細胞及氣道黏液分泌[12]。漢黃芩素通過抑制STAT6活化,還可通過抑制IgE,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和IL-6的產(chǎn)生,抑制MAPK/Akt信號傳導(dǎo),促使中性粒細胞凋亡,減輕過敏性哮喘氣道炎癥[13-14]。β-谷固醇可能通過抑制細胞反應(yīng)以及Th2細胞因子合成來抑制 TNF-α、IL-4和IL-5細胞因子增多,達到抗感染、免疫調(diào)節(jié)作用[15]。新補骨脂異黃酮通過抑制活性氧、活性氮及IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等的產(chǎn)生起到抗感染作用[16]。補骨脂酚具有抗菌、抗感染、抑制細胞NO生成的作用[17-18]。未見報道的核心成分為補骨脂雙氫黃酮(bavachin)、異補骨脂雙氫黃酮(isobavachin)、補骨脂色烯查耳酮(bavachromene)、補骨脂呋喃查耳酮(bakuchalcone)、新補骨脂查耳酮(neobavachalcone),可做進一步實驗,以驗證其治療支氣管哮喘的作用機制。

通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫,本研究預(yù)測了固本平喘劑治療哮喘的信號通路,包括PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路、HTLV-I感染、甲型流感、HIF-1 信號通路、TNF信號通路、趨化因子信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等信號通路。涉及核心靶點最多的PI3K-Akt信號通路可調(diào)控細胞生存、增殖及凋亡[19];機體受炎癥、細胞因子、生長因子等刺激后,致使PI3K、Akt的活化是氣道重塑形成的重要途徑[20]。TNF-α通路與兒童哮喘發(fā)病機制密切相關(guān),可能通過激活TNF-α通路促使Caspase-3、Caspase-8表達增加誘導(dǎo)哮喘發(fā)生[21]。另外,TNF-α 還可誘導(dǎo)多種細胞因子產(chǎn)生,從而加重哮喘,甚至發(fā)生氣道重建[22]。MAPK信號通路改變免疫、炎性因子、氣道上皮細胞引發(fā)氣道高反應(yīng),產(chǎn)生Th1/Th2免疫失衡,誘發(fā)哮喘[23]。研究表明,FOXO1具有促炎作用,可上調(diào)Th2免疫反應(yīng),增加趨化因子、黏液細胞誘發(fā)哮喘[24-25]。Toll樣受體可能通過PI3K/Akt信號通路對哮喘氣道炎癥起調(diào)控作用[26]。

以上結(jié)果表明,固本平喘劑主要作用機制是通過調(diào)節(jié)PTGS2、ESR1、ACHE、ESR2、PTGS1、DPP4、ADORA3、PIK3CA、MAPK3、MAPK1、TP53、AKT1等核心靶點起到抗感染、調(diào)節(jié)免疫、抑制氣道重塑等發(fā)揮治療支氣管哮喘作用。不同信號通路之間有相互作用聯(lián)系,共同調(diào)控人體機能,體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多途徑相互聯(lián)系的作用機制。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討了固本平喘劑治療支氣管哮喘的可能分子機制,使以后的研究者更有針對性,但仍具有一定局限性,有待進一步探究及實驗驗證。