郝建玲 信婧婧 王靖 田紅 蘇海濤

摘要：目的 探討連翹苷通過調節(jié)NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性通路對急性胸膜炎大鼠滲出液和肺損傷的影響。方法 將90只大鼠采用隨機數(shù)字表法均分為對照組、模型組、連翹苷低劑量（PH-L，5 mg/kg）組、連翹苷中劑量（PH-M，10 mg/kg）組、連翹苷高劑量（PH- H，20 mg/kg）組及NLRP3通路抑制劑（PJ34，10 mg/kg）組。肺功能分析儀檢測大鼠用力肺活量（FVC）、第0.1秒用力呼氣量（FEV 0.1）、第0.3秒用力呼氣量（FEV 0.3）；電子天平稱量胸腔滲出物質量；瑞氏染色檢測滲出物白細胞數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測滲出液中前列腺素E2（PGE2）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量；全自動血氣分析儀檢測大鼠動脈CO2分壓［p（CO2）］、動脈氧分壓［p（O2）］；HE染色觀察肺組織病理學變化；免疫組織化學染色檢測NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）蛋白表達；Western blot檢測NLRP3通路蛋白表達。結果 與對照組比較，模型組大鼠胸腔滲出物質量和白細胞數(shù)、滲出液PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α含量、p（CO2）、NLRP3通路蛋白表達增加，F(xiàn)VC、FEV 0.1、FEV 0.3、p（O2）降低，肺組織出現(xiàn)明顯的病理損傷（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠胸腔滲出物質量、白細胞數(shù)、滲出液PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α含量、p（CO2）、NLRP3通路蛋白表達降低，F(xiàn)VC、FEV 0.1、FEV 0.3、p（O2）增加，肺組織病理損傷好轉（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論 PH可通過抑制NLRP3通路激活，抑制炎癥反應，改善急性胸膜炎引起的肺損傷。

關鍵詞：胸膜炎；急性?。贿B翹苷；肺損傷；NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3

中圖分類號：R285.5，R561.1文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230399

Effect of phillyrin regulating NLRP3 inflammatory pathway on exudates and lung injury in rats with acute pleurisy

Abstract： Objective To investigate the impacts of phillyrin on exudates and lung injury in rats with acute pleurisy by regulating the NLRP3 inflammatory pathway. Methods Ninety rats were randomly divided into the control group， the model group， the low-dose phillyrin （PH-L， 5 mg/kg） group， the medium-dose phillyrin （PH-M， 10 mg/kg） group， the high-dose phillyrin （PH-H， 20 mg/kg） group and the NLRP3 pathway inhibitor （PJ34， 10 mg/kg） group. FVC， FEV 0.1 and FEV 0.3 were detected by lung function analyzer. Electronic balance was used to weigh the mass of chest exudate. The number of white blood cells in exudate was detected by Wright staining. Contents of prostaglandin E2 （PGE2）， monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1）， interleukin （IL） -6 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in exudate were detected by ELISA. Automatic blood gas analyzer was used to detect p （CO2） and p （O2） of rats. HE staining was used to observe pathological changes of lung tissue. The expression levels of NLRP3 and Caspase-1 protein were detected by immunohistochemistry. Western blot assay was used to detect the expression of NLRP3 pathway protein. Results Compared with the control group， the quality of pleural exudate and the number of white blood cells， the contents of PGE2， MCP-1， IL-6， TNF-α， the expression of p （CO2） and NLRP3 pathway proteins in exudate of the model group increased obviously， FVC， FEV 0.1， FEV 0.3 and p （O2） decreased obviously， and the lung tissue showed obvious pathological damage （P＜0.05）. Compared with the model group， the quality of pleural exudate and the number of white blood cells， the contents of PGE2， MCP-1， IL-6， TNF-α， the expression of p （CO2）， NLRP3 pathway proteins in the exudate of rats decreased obviously in the PH group and the PJ34 group， FVC， FEV 0.1， FEV 0.3 and p （O2） increased obviously， the pathological injury of lung tissue was obviously improved （P＜0.05）. Compared with the PH-H group， there were no significant differences in the above indexes in the PJ34 group （P＞0.05）. Conclusion PH can improve lung injury induced by acute pleurisy in rats by inhibiting the activation of NLRP3 pathway and inhibiting inflammatory reaction.

Key words： pleurisy; acute disease; phillyrin; lung injury; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein

急性胸膜炎是病毒、細菌感染后侵犯胸膜引起的滲出性炎癥［1］。該病臨床表現(xiàn)為胸悶、呼吸急促、肺音高、呼吸困難，胸腔積液過多等［2］。炎癥在胸膜炎發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，細胞因子是炎癥反應過程中的介質，其中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細胞介素（interleukin，IL）-1β等炎性因子可以激活白細胞和其他細胞類型，放大炎癥反應［3］。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）通路激活是炎癥細胞因子形成的關鍵，NLRP3炎癥小體是多種蛋白質的復合物，其以胱天蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）依賴性方式激活來促進炎細胞因子IL-1β的分泌，參與炎癥調節(jié)［4］。連翹苷（phillyrin，PH）是中藥連翹的重要活性成分，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等活性［5］。研究發(fā)現(xiàn)，PH可通過抑制蛋白激酶B（AKT）/核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）途徑來減輕去甲腎上腺素誘導的心臟肥大和炎癥反應［6］。NF-κB在受損組織中被激活后，可激活其下游NLRP3炎癥小體，加劇組織炎癥反應［7］。PH作為舒風節(jié)度膠囊中的重要組分，可治療上呼吸道感染所致肺損傷［8］。本研究以胸膜炎大鼠為研究對象，探討PH對急性胸膜炎的抗炎機制，為臨床治療胸膜炎相關肺損傷疾病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠90只，6～7周齡，體質量（220±20）g，購自導科醫(yī)藥技術（廣東）有限公司，動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0060。所有大鼠飼養(yǎng)于本院實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食水。連翹苷標準品、L型角叉菜膠、HE染色試劑盒均購自索萊寶生物科技有限公司；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-kB p65、凋亡斑點樣蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）、NLRP3、剪切的Caspase-1（Cleaved-Caspase-1，C-Caspase-1）、Caspase-1、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司。全自動生化分析儀、多功能酶標儀均購自賽默飛世爾科技中國有限公司；光學顯微鏡購自日本奧

林巴斯公司。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分組 大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組，連翹苷低（PH-L，5 mg/kg）、中（PH-M，10 mg/kg）、高（PH-H，20 mg/kg）劑量組［9］以及NLRP3通路抑制劑組（PJ34組，10 mg/kg）［10］，每組15只。PH各組鼻腔給予對應劑量藥物，PJ34組腹腔注射對應劑量藥物，對照組、模型組均在相同部位給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，1次/d。參照文獻［11］，對照組注射等體積生理鹽水，其余組給藥結束后2 h建立急性胸膜炎大鼠模型，麻醉大鼠，在大鼠右側第7肋間注射2%角叉菜膠致炎。造模大鼠胸腔滲出物質量和白細胞升高，表現(xiàn)出典型的急性炎癥，表明急性胸膜炎造模成功。

1.2.2 大鼠肺通氣功能檢測和樣本采集 造模成功6 h后，麻醉大鼠，手術切開氣管，將大鼠置于體描箱中，連接動物肺功能分析儀，測定用力肺活量（FVC）、第0.1秒用力呼氣量（FEV 0.1）、第0.3秒用力呼氣量（FEV 0.3）。肺通氣功能檢測完畢后，腹主動脈取血3 mL備用。采血完畢后，手術打開胸腔，無菌操作吸出滲出液，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌胸腔，將滲出液和洗滌液合并，收集至離心管中，3 000 r/min離心10 min，收集上清液和沉淀物質（滲出物）備用；完成上述操作后，剝離肺組織備用。

1.2.3 胸腔滲出液中滲出物質量和白細胞數(shù) 取1.2.2分離的胸腔滲出液的沉淀物，分析天平精密稱量沉淀物質量；稱定后用PBS稀釋、混勻，吸取50 μL細胞懸液于載玻片中，干燥后，進行瑞氏染色，光學顯微鏡觀察并拍照，對白細胞進行計數(shù)。

1.2.4 胸腔滲出液炎性因子含量測定和大鼠血氣值分析 取1.2.2采集的滲出液上清，根據(jù)ELISA試劑盒檢測滲出液上清中PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α含量，具體操作嚴格根據(jù)試劑盒說明書進行。取1.2.2采集的動脈血，使用全自動血氣分析儀檢測大鼠動脈CO2分壓［p（CO2）］、動脈氧分壓［p（O2）］。

1.2.5 肺組織病理學變化觀察 從各組中隨機抽取5只大鼠麻醉處死后取右肺中葉，加入4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、連續(xù)4 μm切片，根據(jù)HE染色試劑盒說明書進行染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 免疫組織化學法檢測肺組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達 另從各組中隨機取5只大鼠，麻醉處死后取右肺中葉，加入10%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、O.C.T膠包埋，連續(xù)10 μm切片，烤片后，加入3%過氧化氫孵育，10 min后PBS沖洗，加入山羊血清室溫封閉，滴加一抗NLRP3（1∶200）、Caspase-1（1∶200），4 ℃過夜，再加入二抗（1∶200），PBS沖洗后，加入DAB顯色，蘇木素復染。光學顯微鏡下拍照，肺組織中NLRP3、Caspase-1免疫組化陽性表達成棕黃色。分析NLRP3、Caspase-1蛋白表達量。

1.2.7 Western blot檢測肺組織NLRP3通路蛋白表達 將剩余5只大鼠麻醉處死后取右肺中葉，液氮研磨后，加入蛋白裂解液提取蛋白，二辛可寧酸（dicinchonic acid，BCA）法測定蛋白濃度，取適量蛋白上樣，電泳、轉膜、封閉后，加入p-NF-κB p65、NF-kB p65、ASC、NLRP3、C-Caspase-1、Caspase-1及內參GAPDH（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃過夜，再加入二抗（1∶2 000），PBS沖洗后，加入ECL顯影，根據(jù)條帶灰度值計算蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺通氣功能比較 與對照組比較，模型組大鼠FVC、FEV 0.1、FEV 0.3降低（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠FVC、FEV 0.1、FEV 0.3增加（P＜0.05），且PH-L組、PH-M組、PH-H組上述指標依次增加（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組FVC、FEV 0.1、FEV 0.3差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 各組大鼠胸腔滲出物質量和白細胞數(shù)比較 與對照組比較，模型組大鼠胸腔滲出物質量和白細胞數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠胸腔滲出物質量和白細胞數(shù)降低（P＜0.05）；與PH-L組比較，PH-H組胸腔滲出物質量和白細胞數(shù)均降低，PH-M組胸腔滲出物質量降低（P＜0.05）；與PH-M組比較，PH-H組白細胞數(shù)降低（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組胸腔滲出物質量和白細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3 各組大鼠胸腔滲出液炎性因子水平比較 與對照組比較，模型組大鼠胸腔滲出液中PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠胸腔滲出液中PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05）；與PH-L組比較，PH-H組上述指標的含量均降低（P＜0.05），PH-M組PGE2、MCP-1、TNF-α含量降低（P＜0.05）；與PH-M組比較，PH-H組IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組胸腔滲出液中PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 各組大鼠p（CO2）、p（O2）值比較 與對照組比較，模型組大鼠p（CO2）增加，p（O2）降低（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠p（CO2）降低，p（O2）增加（P＜0.05）；與PH-L組比較，PH-H組p（CO2）降低，p（O2）增加，PH-M組p（CO2）降低（P＜0.05）；與PH-M組比較，PH-H組p（CO2）降低，p（O2）增加（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組p（CO2）、p（O2）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

2.5 各組大鼠肺組織病理變化 對照組大鼠肺組織結構清晰完整，未見炎性細胞浸潤；與對照組比較，模型組大鼠肺組織有紅細胞滲出，細胞核變形，炎性細胞浸潤到支氣管，肺泡壁也明顯增厚；與模型組比較，PH各組隨著藥物濃度增大，炎性細胞浸潤逐漸減輕，PJ34組炎性細胞浸潤減少，肺泡壁增厚現(xiàn)象減輕，見圖1。

2.6 各組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1陽性表達增強（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1陽性表達降低（P＜0.05），且PH-L組、PH-M組、PH-H組上述指標依次降低（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組NLRP3、Caspase-1陽性表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5、圖2。

2.7 各組大鼠肺組織中NLRP3炎性小體通路相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和C-Caspase-1表達增加（P＜0.05）；與模型組比較，PH各組和PJ34組大鼠肺組織p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和C-Caspase-1表達降低（P＜0.05），且PH-L組、PH-M組、PH-H組上述指標依次降低（P＜0.05）；與PH-H組比較，PJ34組p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和C-Caspase-1表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3、表6。

3 討論

胸膜是覆蓋在肺組織表面和胸壁內側壁上的一層膜狀軟組織，可調節(jié)胸膜腔穩(wěn)態(tài)。胸膜炎屬于慢性炎癥疾病，而角叉菜膠誘導的大鼠胸膜炎是一種以炎癥為特征的模型，是研究胸腔積液的有效模型，會導致胸腔積液外滲和細胞積聚到胸膜腔，引起肺部嚴重并發(fā)癥［12］。在本研究中，角叉菜膠誘導后模型大鼠胸腔滲出物質量增加，白細胞數(shù)目增多，說明造模成功。胸腔積液外滲和白細胞遷移會導致肺組織病變，引起肺泡壁增厚和炎性細胞浸潤等病理損傷［11］。本研究對模型大鼠的肺功能和血氣以及病理變化等進行檢測后發(fā)現(xiàn)，模型大鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷，主要表現(xiàn)為肺功能降低，肺組織炎性細胞浸潤增加，肺泡壁增厚，這與既往研究［11］結果一致，提示急性胸膜炎可導致肺損傷。

PGE2是炎癥反應的主要介質，可以促進白細胞向炎癥區(qū)域聚集，引發(fā)組織水腫、充血等病變［13］。MCP-1、TNF-α、IL-6在急性肺損傷患者體內高表達，促進中性粒細胞等白細胞聚集并釋放更多炎癥介質，加重肺組織炎癥［14］。研究顯示，在急性胸膜炎大鼠血清和胸腔滲出液中PGE2、TNF-α、IL-6水平均增加［11，15］。此外，MCP-1是胸膜滲出液形成的關鍵驅動因素，在角叉菜膠誘導的胸膜炎小鼠模型血清和胸腔積液中MCP-1水平增加，使用MCP-1拮抗劑阻斷MCP-1活性可減少胸膜炎小鼠炎性胸腔積液的形成［16］。本研究在模型大鼠胸腔滲出液中檢測到較高的炎性細胞因子PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α水平，并且白細胞數(shù)增多，肺組織發(fā)生明顯的病理學變化，說明胸腔積液的滲漏引起了肺部嚴重的并發(fā)癥。經過PH預處理后，模型大鼠胸腔滲出液炎性介質PGE2、MCP-1、IL-6、TNF-α釋放減少，白細胞數(shù)減少，肺部病理學改變明顯好轉，肺功能明顯好轉，且PH-H組優(yōu)于PH-L組和PH-M組，表明PH可抑制炎癥反應，減輕急性胸膜炎大鼠肺損傷，提示PH具有治療胸膜炎導致的肺損傷的潛力。

NLRP3是一種胞質多蛋白復合物，由先天免疫受體蛋白NLRP3、適配器蛋白ASC和炎癥蛋白pro-Caspase-1組成，其過度激活會促進各種炎癥性疾病的發(fā)展［17］。有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體活化后，pro-Caspase-1會裂解為具有活性的Cleaved Caspase-1，進而將pro-IL-1β裂解為成熟的IL-1β，促進炎性細胞募集，參與肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展［18-19］。PH改善肺損傷的機制可能與抑制NLRP3炎性通路激活有關。在炎癥疾病中，NLRP3受NF-κB調節(jié)而激活［20］，抑制NLRP3炎性通路的激活可以減輕組織損傷［21］。在本研究中，模型大鼠肺組織中p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和C-Caspase-1表達明顯增加，表明NLRP3炎性通路被激活；經過PH預處理后，p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和C-Caspase-1蛋白表達明顯降低，表明NLRP3炎性通路被抑制，推測PH對肺損傷的改善作用可能是通過抑制NLRP3炎性通路實現(xiàn)。為了驗證PH的抗炎作用是否與抑制NLRP3炎性通路有關，筆者設置了通路抑制劑組，發(fā)現(xiàn)通路抑制劑組與PH-H組呈現(xiàn)相似的治療效果，再次證實了PH可能通過抑制NLRP3炎性通路激活，從而減輕胸膜炎大鼠的肺損傷。

綜上所述，PH可以抑制NLRP3炎性通路激活，減少胸膜炎大鼠炎性介質釋放和白細胞聚集，改善肺損傷。然而，炎癥反應涉及多種通路協(xié)同作用，PH對胸膜炎大鼠肺損傷的治療作用是否同時涉及其他通路作用，還有待進一步研究。

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