李文亞,謝 程,彭 莉 （. 長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 仙桃 433000；. 長(zhǎng)江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 仙桃 433000）

宮頸癌是女性最嚴(yán)重的惡性癌癥之一，具有較高的浸潤(rùn)性和病死率[1]。因此，闡明宮頸癌進(jìn)展的機(jī)制，尋找新的、有效的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是具有共價(jià)閉合環(huán)的RNA 分子，其有競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA 活性，即circRNA 可與微小RNA（microRNA,miRNA）識(shí)別元件結(jié)合發(fā)揮miRNA 抑制作用，從而提高靶mRNA 的表達(dá)[2]。circRNA 表達(dá)改變與宮頸癌進(jìn)展密切相關(guān)，再加上其發(fā)育階段特異性表達(dá)模式，circRNA 被認(rèn)為是宮頸癌治療的理想靶點(diǎn)[3-4]。研究顯示，hsa_circ_0011946在乳腺癌中的表達(dá)異常上調(diào)，敲減hsa_circ_0011946可明顯降低乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[5]。miRNA是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，其表達(dá)失調(diào)參與腫瘤細(xì)胞多個(gè)惡性進(jìn)程[6-7]。miR-767-3p可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）mRNA降解，增強(qiáng)其對(duì)替莫唑胺的敏感性[8]。肺腺癌中miR-767-3p 表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-767-3p 可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9]。靶基因預(yù)測(cè)顯示，miR-767-3p是hsa_circ_0011946的潛在靶點(diǎn)。但hsa_circ_0011946、miR-767-3p在宮頸癌中的表達(dá)和功能，以及hsa_circ_0011946 是否通過(guò)靶向miR-767-3p 調(diào)控宮頸癌進(jìn)展目前尚不清楚。因此，本研究旨在揭示hsa_circ_0011946靶向miR-767-3p在宮頸癌進(jìn)展中的作用，以期為宮頸癌的治療提供有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來(lái)源 收集2017 年5 月至2019 年5 月我院收治的43 例宮頸癌患者的癌組織和癌旁正常組織。患者年齡45～73 歲，中位年齡57 歲，均未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療。組織標(biāo)本離體后保存在-80 ℃冰箱備用。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（XTYYKY2017006），患者及家屬均對(duì)本研究知情同意。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 人宮頸上皮永生化細(xì)胞H8（批號(hào)：QS-H283）購(gòu)自旗賽生物科技（武漢）有限公司；宮頸癌SiHa 細(xì)胞（批號(hào)：CL-0210）、HeLa 細(xì)胞（批號(hào)：CL-0101）、Caski 細(xì)胞（批號(hào)：CL-0048）及MEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：PM150410P）、青鏈霉素雙抗（批號(hào)：PB180120）、胎牛血清（批號(hào)：164210）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技公司；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR037A）、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（批號(hào)：DRR041A）購(gòu)自大連TaKaRa 公司；miScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：218161）、miScript SYBR Green PCR 試劑盒（批號(hào)：218073）購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；si-hsa_circ_0011946、si-NC、miR-767-3p、pcDNA、pcDNA-hsa_circ_0011946、anti-miR-NC、anti-miR-767-3p、miR-NC、重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒購(gòu)自上海生工生物公司；CCK-8、NP-40 緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物公司；MMP-2 兔多抗（批號(hào)：AF0234）、MMP-9 兔多抗（批號(hào)：AF5234）、β-actin兔單抗（批號(hào)：AF5003）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)：A0208）購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0011946、miR-767-3p表達(dá)

使用TRIzol 試劑從H8 細(xì)胞、SiHa 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、Caski 細(xì)胞及癌組織和癌旁正常組織中提取總RNA，分別用PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成circRNA、miRNA 的cDNA，分別用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒、miScript SYBR Green PCR試劑盒對(duì)上述cDNA 進(jìn)行RT-qPCR。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次。U6 為miR-767-3p 的內(nèi)參，β-actin 為hsa_circ_0011946 的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析hsa_circ_0011946、miR-767-3p的表達(dá)水平。miR-767-3p上游引物5'-TCCATTTGTTTTGATGATGGACT-3'，下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3'，下游引物5'-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3'；hsa_circ_0011946 上游引物5'-GCTGGTGTTCCTTGACTGGA-3'，下游引物5'-C ACTGTAGCAAACCAGCATTTCT-3'；β-actin 上游引物5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，下游引物5'-TGC TGTCACCTTCACCGTTC-3'。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

SiHa 細(xì)胞接種含1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基，并在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。用胰蛋白酶消化80%融合的SiHa細(xì)胞，1∶3傳代。取第3 代對(duì)數(shù)期SiHa 細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種至96 孔板，用 Lipofectamine 2000 將 si-NC、si-hsa_circ_0011946、 miR-NC、 miR-767-3p、 pcDNA、 pcDNAhsa_circ_0011946、anti-miR-NC+si-hsa_circ_0011946、anti-miR-767-3p+si-hsa_circ_0011946 分別轉(zhuǎn)染50%融合的SiHa 細(xì)胞，分別作為si-NC 組、si-hsa_circ_0011946 組、miR-NC 組、miR-767-3p 組、pcDNA 組、pcDNA-hsa_circ_0011946 組、anti-miR-NC+si-hsa_circ_0011946 組、anti-miR-767-3p+si-hsa_circ_0011946 組。未轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞作為NC組。轉(zhuǎn)染48 h后，收集SiHa細(xì)胞，RT-qPCR 檢測(cè)hsa_circ_0011946、miR-767-3p 的表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將轉(zhuǎn)染48 h 后的SiHa 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種至96孔板，細(xì)胞貼壁后每孔添加10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（absorbance，A）值以表示細(xì)胞活力。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆數(shù)

將轉(zhuǎn)染48 h 后的SiHa 細(xì)胞以5×102個(gè)/孔接種至6 孔板，培養(yǎng)約12 d 至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆。4%多聚甲醛固定1 h，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)

將轉(zhuǎn)染48 h 后的SiHa 細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。Transwell 上室添加100 μL 細(xì)胞懸液，下室添加600 μL 完全培養(yǎng)基，然后在培養(yǎng)箱中孵育24 h。用棉簽除去膜上表面的細(xì)胞，膜下表面的細(xì)胞為遷移細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定遷移細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色后，顯微鏡下對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行拍照。選取5個(gè)隨機(jī)視野細(xì)胞數(shù)的均值表示各組細(xì)胞遷移數(shù)。侵襲數(shù)測(cè)定時(shí)先用0.5 mg/mL 的基質(zhì)膠包被Transwell上室膜，其余步驟同遷移測(cè)定。

1.7 Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

用NP-40 緩沖液提取蛋白并測(cè)定濃度。將50 μg蛋白樣品在100 V 下用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（200 mA，80 min）。膜封閉后，除去封閉液，添加MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 500）、β-actin（1∶1 500）一抗，4 ℃搖床孵育2 h，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（山羊抗兔IgG,1∶2 000）在37 ℃下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)。以Image J 軟件測(cè)得的目的條帶和β-actin灰度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

circular RNA interactome 預(yù)測(cè)miR-767-3p 與hsa_circ_0011946 的結(jié)合位點(diǎn)。將含miR-767-3p 結(jié)合位點(diǎn)的hsa_circ_0011946 野生序列或不含預(yù)測(cè)位點(diǎn)的突變序列分別克隆到pmirGLO 質(zhì)粒，構(gòu)建WThsa_circ_0011946 和MUT-hsa_circ_0011946 重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。用Lipofectamine 2000將WT-hsa_circ_0011946 或MUT-hsa_circ_0011946 分別與miR-767-3p mimics、miR-NC 共轉(zhuǎn)染至SiHa 細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)測(cè)定轉(zhuǎn)染48 h后的相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中hsa_circ_0011946和miR-767-3p表達(dá)

宮頸癌組織中hsa_circ_0011946 表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），miR-767-3p 表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中hsa_circ_0011946 和miR-767-3p表達(dá)

2.2 不同細(xì)胞系中hsa_circ_0011946和miR-767-3p的表達(dá)

與H8 細(xì)胞比較，宮頸癌細(xì)胞系（SiHa、HeLa、Caski）中hsa_circ_0011946 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-767-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。選擇表達(dá)差異較大的SiHa 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 宮頸癌細(xì)胞系中hsa_circ_0011946和miR-767-3p的表達(dá)情況

2.3 干擾hsa_circ_0011946 表達(dá)抑制宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

與NC 組比較，si-hsa_circ_0011946 組SiHa 細(xì)胞hsa_circ_0011946 表達(dá)水平、A 值、克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低/減少（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表1。

表1 干擾hsa_circ_0011946表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（）

表1 干擾hsa_circ_0011946表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（）

*：與NC組比較，P＜0.05

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圖3 干擾hsa_circ_0011946表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞克隆及蛋白表達(dá)的影響

2.4 過(guò)表達(dá)miR-767-3p 抑制宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

與miR-NC 組比較，miR-767-3p 組SiHa 細(xì)胞miR-767-3p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞A 值、克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著降低/減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表2。

表2 過(guò)表達(dá)miR-767-3p抑制SiHa宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（）

表2 過(guò)表達(dá)miR-767-3p抑制SiHa宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（）

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圖4 過(guò)表達(dá)miR-767-3p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞克隆及蛋白表達(dá)的影響

2.5 hsa_circ_0011946靶向調(diào)控miR-767-3p的表達(dá)

circular RNA interactome 預(yù)測(cè)到miR-767-3p 和hsa_circ_0011946 存在特異性結(jié)合序列（圖5）。與miR-NC 組比較，miR-767-3p 組WT-hsa_circ_0011946的SiHa 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性降低（P＜0.05）；而MUT-hsa_circ_0011946 的SiHa 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。pcDNAhsa_circ_0011946 組SiHa 細(xì)胞hsa_circ_0011946 表達(dá)水平顯著高于pcDNA 組（P＜0.05），miR-767-3p表達(dá)水平顯著低于pcDNA 組（P＜0.05）；si-hsa_circ_0011946組SiHa 細(xì)胞hsa_circ_0011946 表達(dá)水平顯著低于si-NC 組（P＜0.05），miR-767-3p 表達(dá)水平顯著高于si-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖5 miR-767-3p與hsa_circ_0011946的結(jié)合位點(diǎn)

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

圖7 RT-qPCR檢測(cè)hsa_circ_0011946、miR-767-3p的表達(dá)

2.6 抑制miR-767-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0011946表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與anti-miR-NC+si-hsa_circ_0011946 組比較，anti-miR-767-3p+si-hsa_circ_0011946 組SiHa 細(xì)胞miR-767-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞A 值、克隆數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著升高/增加（P＜0.05），見(jiàn)圖8、表3。

表3 抑制miR-767-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0011946表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（）

表3 抑制miR-767-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0011946表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（）

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圖8 抑制miR-767-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0011946對(duì)SiHa細(xì)胞克隆及蛋白表達(dá)的影響

3 討論

circRNA 已被證實(shí)參與調(diào)控多種生物過(guò)程，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如宮頸癌臨床標(biāo)本中circ_0000388 表達(dá)上調(diào)，且與FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度相關(guān)，circ_0000388 高表達(dá)可顯著增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[10]。circRNA8924 通過(guò)抑制miR-518d-5p/519-5p 活性促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[11]。過(guò)表達(dá)circEYA1 可降低宮頸癌細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制異種移植瘤生長(zhǎng)[12]。circMTO1通過(guò)調(diào)控miR-6893 促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和化療耐藥性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0011946在宮頸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，表明hsa_circ_0011946 可能參與宮頸癌的進(jìn)展。hsa_circ_0011946 已被證實(shí)參與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，其表達(dá)與肝細(xì)胞癌的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，敲除hsa_circ_0011946 可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲，提示hsa_circ_0011946 在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮致癌作用[14]。本研究結(jié)果顯示，干擾hsa_circ_0011946表達(dá)可抑制SiHa 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這與既往研究[5,14]報(bào)道的hsa_circ_0011946 在其他腫瘤細(xì)胞中的作用相吻合。MMP-2、MMP-9 是降解基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，為細(xì)胞遷移和侵襲提供有利條件[15-16]。研究證實(shí)，沉默circ-0000212 可通過(guò)抑制MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)降低宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17]。本研究干擾hsa_circ_0011946 表達(dá)后，MMP-2和MMP-9 蛋白表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)干擾hsa_circ_0011946 表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。

研究表明，circRNA 在宮頸癌中的功能與調(diào)控miRNA 表達(dá)有關(guān)，如circ_0000515 可通過(guò)靶向miR-326 抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡和自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲[18]。本研究中雙熒光素酶檢測(cè)和RT-qPCR 證實(shí)，miR-767-3p 是hsa_circ_0011946 的特異性靶點(diǎn)。miR-767-3p 已被報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，敲減circ_0018818通過(guò)上調(diào)miR-767-3p表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并阻礙上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[19]。此外，miR-767-3p 還介導(dǎo)敲減hsa_circ_0000673對(duì)肝癌細(xì)胞惡性行為的抑制作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織和細(xì)胞中miR-767-3p 表達(dá)水平顯著下降，過(guò)表達(dá)miR-767-3p 可下調(diào)MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)，抑制SiHa 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。hsa_circ_0011946 對(duì)miR-767-3p 具有負(fù)調(diào)控作用，且過(guò)表達(dá)miR-767-3p 與干擾hsa_circ_0000673 的抗腫瘤作用一致，故本研究推測(cè)宮頸癌中可能存在hsa_circ_0011946/miR-767-3p調(diào)控途徑。為進(jìn)一步證實(shí)干擾hsa_circ_0011946 的作用依賴(lài)于miR-767-3p 表達(dá)上調(diào)，本研究將si-hsa_circ_0011946 和anti-miR-767-3p 共轉(zhuǎn)染至SiHa 細(xì)胞，結(jié)果顯示，抑制miR-767-3p 表達(dá)可顯著削弱干擾hsa_circ_0011946對(duì)SiHa細(xì)胞的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用，進(jìn)一步證實(shí)了hsa_circ_0011946 靶向miR-767-3p 促進(jìn)SiHa細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上，宮頸癌中hsa_circ_0011946 呈高表達(dá)，miR-767-3p 呈低表達(dá)。干擾hsa_circ_0011946 通過(guò)靶向上調(diào)miR-767-3p 抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此，hsa_circ_0011946/miR-767-3p 途徑可能是抑制宮頸癌進(jìn)展的潛在有效靶點(diǎn)。