陶曉芳 王雅潔 王文斌 費(fèi)年華

(咸寧市中心醫(yī)院 1老年病科,湖北 咸寧 437000;2甲狀腺乳腺外科)

冠心病(CHD)是冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或閉塞所導(dǎo)致的心臟病〔1,2〕。CHD患者的臨床表現(xiàn)主要有心絞痛、心肌梗死、心悸,嚴(yán)重者引發(fā)猝死〔3〕。線粒體和死亡受體是CHD發(fā)病過(guò)程中細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑。線粒體是一種由兩層膜包被的細(xì)胞器,也是細(xì)胞中制造能量的場(chǎng)所〔4〕。微小RNA(miR)-182可通過(guò)調(diào)節(jié)不同的靶mRNA對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔5,6〕。相關(guān)研究表明miR-182高表達(dá)會(huì)造成心肌細(xì)胞損傷,可能參與CHD的發(fā)生發(fā)展,但具體的生物學(xué)功能和機(jī)制尚不清楚。基于此,本文旨在探究miR-182調(diào)控線粒體凋亡通路對(duì)CHD模型大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康SD成年大鼠30只,鼠齡8～10 w,體質(zhì)量(200±20)g,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)文號(hào):WYZLL〔2016〕1601。適應(yīng)性喂養(yǎng)1～2 w。其中15為構(gòu)建CHD大鼠模型:于術(shù)前給予大鼠禁食處理6 h,麻醉后置于無(wú)菌操作臺(tái)固定,先進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè),等氣管插管后,帶上動(dòng)物呼吸機(jī)。打開胸腔后剪開心包,暴露心臟,在心臟左心室下方結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,在結(jié)扎線、冠狀動(dòng)脈之間放置一根直徑2 mm的塑料管,形成急性心肌缺血模型。剩余15只為假手術(shù)組僅切皮。觀察心電圖,以ST段弓背向上抬高為模型制備成功。建模成功后等待6 h后再處理。

1.2組織樣本收集 大鼠麻醉后,固定于操作臺(tái),剪開胸壁,暴露心臟,模型組沿左心室長(zhǎng)軸剪下左心室梗死區(qū),對(duì)照組取相同位置的心臟組織,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次,4%多聚甲醛中固定,待檢。

1.3心肌組織細(xì)胞獲取和培養(yǎng)方法 模型組大鼠心臟組織應(yīng)用Ⅱ型膠原酶和0.08%的中性蛋白酶進(jìn)行消化后,置于1%青鏈霉素和10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液中,在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2 h,更換培養(yǎng)液,吸取未貼壁細(xì)胞接種到6孔板中,按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,每3 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞增殖至80%時(shí)按上述操作進(jìn)行傳代。應(yīng)用3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞增殖 將1.3中培養(yǎng)好的細(xì)胞按5×105個(gè)每孔接種于6孔板中,生長(zhǎng)至75%融合開始脫氧。每孔加入100 μl新培養(yǎng)基,再分別加入10 μl四唑氮化合物(MTS),混勻后37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h,鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)并記錄。誘導(dǎo)1、3、6 h,進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分成3組,每組8孔,對(duì)照組不作處理,其余兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分別用miR-182抑制劑和miR-182-Apmimic進(jìn)行轉(zhuǎn)染作為下調(diào)miR-182組和上調(diào)miR-182組。轉(zhuǎn)染步驟按照說(shuō)明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.5引物序列 采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞miR-182、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá),采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,20 μl反應(yīng)體系下將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列(5′-3′):miR-182正向:ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC,反向:AATCCATGAGAGA TCCCTAGCG;Bcl-2正向:GTGGAGGAGCTCTTCA GGGA,反向:AGGCACCCAGGGTGATGCAA;Bax正向:GGCC-CACCAGCTCTGAGCAGA,反向:GCCACG TGGGGGTCCCAAAGT;GAPDH正向:CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA,反向:TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC。95 ℃預(yù)反應(yīng)10 min后,95 ℃變性7 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸38 s,40個(gè)循環(huán)后,檢測(cè)各指標(biāo)相對(duì)表達(dá)。

1.6細(xì)胞凋亡 于4%多聚甲醛溶液中固定心肌組織,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,應(yīng)用一站式生物素檢測(cè)原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒〔二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法〕檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況,試劑盒由上海聯(lián)邁生物工程有限公司提供。于光鏡下觀察,并使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7心肌組織miR-182、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)心肌組織miR-182、GSH-PX、SOD、MDA水平。將心肌組織切片脫蠟后用梯度乙醇水化,修復(fù)抗原,加入5%山羊血清封閉靜置30 min,滴加一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次后滴加稀釋的二抗,37 ℃孵育30 min,DAB顯色,脫水,透明,中性樹膠封片。分析檢測(cè)結(jié)果。

1.8Western印跡檢測(cè) 采用Western印跡法測(cè)定蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平,蛋白定量后進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,和封閉。滴加一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)清洗3次,滴加二抗,室溫孵育1 h,試劑盒均由博輝生物科技(廣州)有限公司提供。掃描膠片,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描,以Bcl-2、Bax蛋白灰度值與β-actin灰度值之比計(jì)算。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行重讀測(cè)量方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組miR-182表達(dá)比較 如表1所示,誘導(dǎo)1、3、6 h與對(duì)照組相比,下調(diào)miR-182組miR-182表達(dá)水平較低,上調(diào)miR-182組miR-182表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)miR-182組相比,上調(diào)miR-182組miR-182表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組誘導(dǎo)不同時(shí)間miR-182表達(dá)、心肌細(xì)胞增殖密度值、足細(xì)胞凋亡率比較

2.23組心肌細(xì)胞增殖密度值比較 如表1所示,誘導(dǎo)1、3、6 h與對(duì)照組相比,下調(diào)miR-182組細(xì)胞吸光密度值較低,上調(diào)miR-182組細(xì)胞吸光密度值較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)miR-182組相比,上調(diào)miR-182組細(xì)胞吸光密度值較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.33組心肌細(xì)胞凋亡率比較 如表1所示,誘導(dǎo)1、3、6 h與對(duì)照組相比,下調(diào)miR-182組細(xì)胞凋亡率較低,上調(diào)miR-182組細(xì)胞凋亡率較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)miR-182組相比,上調(diào)miR-182組細(xì)胞凋亡率較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4miR-182對(duì)3組線粒體GSH-PX、SOD、MDA的影響 如表2所示,誘導(dǎo)1、3、6 h與對(duì)照組相比,下調(diào)miR-182組GSH-PX、SOD表達(dá)水平較高,MDA表達(dá)水平較低,上調(diào)miR-182組GSH-PX、SOD表達(dá)水平較低,MDA表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)miR-182組相比,上調(diào)miR-182組GSH-PX、SOD表達(dá)水平較低,MDA表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 誘導(dǎo)不同時(shí)間miR-182對(duì)3組線粒體GSH-PX、SOD、MDA的影響

2.53組細(xì)胞WT1信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 如表3所示,誘導(dǎo)1、3、6 h與對(duì)照組相比,下調(diào)miR-182組Bcl-2表達(dá)水平均較高,Bax表達(dá)水平較低,上調(diào)miR-182組Bcl-2表達(dá)水平均較低,Bax表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與下調(diào)miR-182組相比,上調(diào)miR-182組Bcl-2表達(dá)水平較低,Bax表達(dá)水平較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 3組誘導(dǎo)不同時(shí)間細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

心肌細(xì)胞又稱心肌纖維是有橫紋的短柱狀細(xì)胞〔7〕。心肌細(xì)胞是心肌組織的主體部分,心臟的動(dòng)力功能主要依靠心肌細(xì)胞完成〔8〕。缺血缺氧時(shí),心肌組織灌注不足,在心肌缺血或梗死時(shí),將出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡的情況〔9〕。

心臟是一種動(dòng)力器官,其功能受線粒體提供的能量調(diào)控,心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體含量豐富,可為心肌提供絕大部分的能量〔10〕。線粒體也是能量代謝、活性氧生成和細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵細(xì)胞通路的交叉點(diǎn),起著至關(guān)重要的作用〔11〕。相關(guān)研究表明,CHD后某些微小RNA(miRNA)表達(dá)失調(diào),可能會(huì)有助于減少心肌組織損傷、抑制細(xì)胞凋亡,有助于改善CHD患者預(yù)后〔12〕。miR-182定位于人的7號(hào)染色體,與miR-96、miR-183形成了一個(gè)基因簇〔13,14〕。有相關(guān)研究證實(shí),在大鼠缺血再灌注模型中miR-182表達(dá)下調(diào),并通過(guò)下調(diào)Bcl2/E1B-19kDa相互作用蛋白(BNIP)3來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,miR-182能引起心肌細(xì)胞損傷和功能惡化,可能參與CHD的發(fā)生發(fā)展。

GSH-PX是體內(nèi)重要的催化酶,可以催化過(guò)氧化氫分解,從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能得到完整保護(hù)〔16〕。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶,反映氧自由基損傷的敏感指標(biāo)〔17〕。MDA是一種有機(jī)化合物,會(huì)對(duì)線粒體呼吸鏈及各種酶造成不同程度的損傷,是反映膜脂過(guò)氧化的敏感性指標(biāo)〔18〕。Bcl-2通過(guò)調(diào)控凋亡的線粒體通路,改變線粒體膜的通透性,阻止線粒體內(nèi)的凋亡分子細(xì)胞色素的釋放,抑制凋亡效應(yīng)caspase的活性〔19〕。Bax在發(fā)揮自身促凋亡作用的同時(shí)使線粒體膜通透性改變,釋放能進(jìn)入胞質(zhì)的細(xì)胞色素,進(jìn)而激活線粒體通路。Bax還能下調(diào)Bcl-2表達(dá),降低其抑制作用〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,miR-182低表達(dá)影響著Bcl-2、Bax表達(dá)水平,三者水平升高是心肌細(xì)胞凋亡的重要原因之一。

綜上所述,miR-182過(guò)表達(dá)靶向作用于線粒體凋亡通路Bcl-2、Bax,使CHD模型大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡。