韓杰 鄭昌婧 張玲 劉倩

(唐山職業(yè)技術學院 1附屬醫(yī)院,河北 唐山 063000;2護理系)

宮頸癌常見危險因素包括多個性伴侶、性生活開始過早等。影響該病產(chǎn)生的主要危險因素為人乳頭瘤病毒(HPV)感染,其中以感染HPV16/18基因為主〔1,2〕。其發(fā)病原因多與感染HPV有關,性伴侶越多,感染概率越大。不同疾病進展中宮頸癌患者臨床表現(xiàn)差別很大,早期多無癥狀,但隨著疾病進展,患者會產(chǎn)生異常陰道流血等癥狀,隨后由于腫瘤增大、壓迫和侵犯鄰近器官組織而出現(xiàn)相應癥狀。晚期宮頸癌患者常見癥狀主要有陰道流血,還可能導致下肢深靜脈血栓或發(fā)生肺栓塞等危及生命,因此宮頸癌的治療至關重要。近年來關于長鏈非編碼 RNA(LncRNA)的研究逐漸增多,以LncRNA為靶向的分子治療在腫瘤研究領域也逐漸被關注〔3〕。HAGLR是LncRNA 成員之一,可影響多種腫瘤的增殖及遷移過程〔4,5〕。但其在宮頸癌中的具體作用機制尚不明確。miRNA 是一種人體內(nèi)的微控制系統(tǒng),參與細胞的生物學行為與組織修復等過程,與多種疾病相關。miR-143是miRNA成員之一,與多種腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展聯(lián)系密切,其表達水平還與腫瘤的預后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關〔6～8〕。在腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展中還存在多種信號通的參與,刺猬因子(Hedgehog)通路在胃癌〔9〕、肺癌〔10〕及宮頸癌〔11〕等腫瘤中均存在被異常激活的現(xiàn)象。但目前關于Hedgehog通路在宮頸癌中的相關報道較少。本研究探討LncRNA HAGLR靶向miR-143/Hedgehog信號通路對HPV16/18感染的宮頸癌細胞活性作用機制。

1 材料和方法

1.1一般資料 宮頸鱗狀上皮癌細胞株CaSki細胞購自美國標準生物品收藏中心(ATCC),每個 CaSki 細胞中含約600 個拷貝的整合的 HPV16 基因組,此外含 HPV18 的基因序列。取唐山市協(xié)和醫(yī)院2020年3月至2021年2月宮頸癌患者的癌組織(符合宮頸癌確診標準)與癌旁5 cm宮頸組織標本各10例(接受宮頸癌手術或活檢病理),患者均未進行放療、化療及其他輔助治療,患者知情并同意。已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(批號:Y-2020-04-11)。

1.2實驗試劑 噻唑藍(MTT)溶液(武漢普諾賽生命科技公司);聚合酶鏈反應(PCR)儀(南京貝登醫(yī)療公司,型號:CFX96);LncRNAHAGLR、miR-143引物序列(上海赫澎生物科技公司);流式細胞儀(大連華微生命科技公司,型號:HW-STORM);酶聯(lián)免疫檢測儀(濟南來寶生物公司,型號:4001型);音猬因子重組蛋白(Shh)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關基因同源蛋白(Gli)1一抗(深圳豪地華拓生物公司);辣根過氧化物酶二抗(北京博爾西科技公司)。

1.3細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 CaSki細胞均采用含10%胎牛血清 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在6孔板中接種對數(shù)生長期的CaSki細胞1×105/ml,細胞融合至70%時轉(zhuǎn)染。采用LipofectamineTM3000說明準備shRNA-LipofectamineTM2000復合物及陰性對照,將表達質(zhì)粒LipofectamineTM2000復合物及陰性對照加到培養(yǎng)基各孔中,轉(zhuǎn)染5 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。隨機分為宮頸癌組(宮頸癌細胞常規(guī)培養(yǎng))、NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染IncRNAHAGLR-shRNA)。

1.4實時熒光(RT)-PCR檢測LncRNAHAGLR、miR-143水平 取細胞及組織,胰酶消化后提取細胞懸液,沖洗。提取總 RNA,Primer5.0 合成引物。 PCR條件:95 ℃預變性3 min,95 ℃;變性20 s,60 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,共40個循環(huán)。 以GAPDH為內(nèi)參,引物序列為:LncRNA HAGLR正義:5′-GGCTCTTCCCTAATGTGTGG-3′,反義:5′-CAG GTCCAGCATGAAACAGA-3′;miR-143正義:5′-TGTAGTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3′,反義:5′-CCTA CGATCGAAAACGACGCGAACG-3 ′;GAPDH正義:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAA-3 ′,反義:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3 ′。

1.5MTT檢測細胞增殖 取轉(zhuǎn)染24 h后CaSki細胞,接種到6孔板中(2×103個/ml),置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于12、24、48 h每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl培養(yǎng)4 h,再加入胎牛血清(150 ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,使用酶標儀于570 nm處檢測吸光度值。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 取各組CaSki細胞,接種到6孔板中,胰酶消化,完全培養(yǎng)基培養(yǎng),磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,計數(shù)細胞,3 000 r/min,離心min后棄上清,加入結(jié)合緩沖液重懸。加入5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)、10 μl碘化丙啶(PI)混勻,孵育15 min后,流式細胞儀檢測。

1.7Western印跡檢測Shh、Gli1蛋白水平 取各組CaSki細胞,二喹啉甲酸(BCA)法提取總蛋白,后將蛋白放于緩沖液中混勻,煮沸、變性后與電泳儀中電泳,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉后加入Shh、Gli1一抗(1∶500)漂洗3次,隔10 min/次,加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1 000)封閉1 h。取出PVDF膜,漂洗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后照相。另取CaSki細胞貼壁生長,狀態(tài)良好后消化細胞,以1 × 105/ml接種于6孔板培養(yǎng),每孔加入2 ml完全培養(yǎng)基,分為Cyclopamine組(Hedgehog通路抑制劑),第2天換液后將細胞給予40 μmol Cyclopamine孵育。

1.8雙熒光素酶報告 將融合至80%的癌細胞接種于6孔板中,按照LipofectamineTM2000說明將niR-143-3′-UTR-野生型(WT)、niR-143-3′-UTR-突變型(MUT);Shh-3′-UTR-WT、Shh-3′-UTR-MUT;Gli1-3′-UTR-WT、Gli1-3′-UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LncRNA KCNQ1OT1-NC(NC組),IncRNAHAGLR mimics(IncRNAHAGLR組)共轉(zhuǎn)染至細胞,嚴格按照說明檢測熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、SNK法。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA HAGLR、miR-143水平 宮頸癌組織中LncRNA HAGLR表達(0.86±0.07)明顯高于癌旁組織(0.63±0.15;t=23.300,P<0.001)。宮頸癌組與NC組LncRNA HAGLR、miR-143水平無顯著差異(P>0.05)。與NC組相比,轉(zhuǎn)染組LncRNA HAGLR水平明顯降低,miR-143水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組LncRNA HAGLR、miR-143相對表達及不同時間點吸光度值

2.2各組細胞增殖情況 宮頸癌組與NC組增在不同時間點的吸光度值均無顯著差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染組吸光度值在24 h與48 h時均顯著低于NC組(P<0.05)。見表1。

2.3各組細胞凋亡情況 宮頸癌組細胞凋亡率〔(3.56±0.31)%〕與NC組〔(3.24±0.25)%〕無明顯差異(t=1.968,P=0.077);轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率〔(19.46±1.53)%〕較NC組顯著增加(t=25.630,P<0.001)。見圖1。

圖1 各組細胞凋亡

2.4Shh、Gli1水平 宮頸癌組與NC組Shh、Gli1水平無顯著差異(P>0.05)。NC組Shh、Gli1水平顯著高于轉(zhuǎn)染組與Cyclopamine組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染組與Cyclopamine組Shh、Gli1水平無明顯差異(P>0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組Shh、Gli1蛋白表達

表2 各組Shh、Gli1蛋白表達

2.5雙熒光素酶報告 雙熒光素酶報告結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染LncRNA HAGLR后miR-143-3′-UTR-WT活性明顯升高,Shh-3′-UTR-WT、Gli1明顯降低(P<0.05),對MUT基因無影響(P>0.05),表明miR-143、Shh、Gli1是LncRNA HAGLR的靶基因。見表3。

表3 雙熒光素酶報告

3 討 論

盡管近年來宮頸癌的化療取得長足進展,然而復發(fā)率仍有1/3左右,其中腫瘤細胞耐藥是重要原因之一〔12〕。因此,現(xiàn)在迫切需要找到一種可以有效抵抗宮頸癌的手段。關于LncRNA的研究越來越受到重視。

LncRNA在腫瘤的生物學行為具有重要作用〔13,14〕。在肺癌中HAGLR表達異常降低并與患者的預后相關,升高其表達后可抑制肺癌細胞在體內(nèi)外的生長,發(fā)揮抑癌作用〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn),低水平的HAGLR可抑制宮頸癌細胞的增殖。miRNA可通過與其靶基因結(jié)合調(diào)控相關基因水平。LncRNA含有與miRNA互補結(jié)合的反應元件,可與miRNA競爭性結(jié)合,進而調(diào)控miRNA靶基因的表達。miRNA 參與多種腫瘤的產(chǎn)生、干擾或重建其表達后可能是治療腫瘤的有效途徑〔16〕。研究表明,miR-143在腫瘤發(fā)生中具有一定的調(diào)節(jié)作用,在結(jié)肝癌〔17〕、胰腺癌〔18〕等中低表達。本研究中,經(jīng)過轉(zhuǎn)染低表達的HAGLR后,miR-143水平升高、增殖受到抑制并促進了癌細胞的凋亡,表明 HAGLR可靶向調(diào)控miR-143的表達。已有研究證實〔19〕,HAGLR在前列腺癌等腫瘤中為高表達,通過降低其表達后可調(diào)控腫瘤細胞的惡性行為。蘭國玉等〔20〕研究表明,HAGLR通過調(diào)控miR-93-5p水平可抑制胃癌的增殖。黃翀等〔21〕研究表明,miR-143在宮頸癌細胞中低表達,高表達的miR-143可抑制癌細胞增殖并誘導凋亡。本文研究與上述研究結(jié)果相似,因此推測LncRNA HAGLR通過靶向調(diào)控miR-143水平,抑制HPV16/18感染的宮頸癌細胞的增殖并誘導凋亡,且本文雙熒光素酶報告結(jié)果也可證實這一結(jié)論。

Hedgehog信號通路在人類胚胎發(fā)育過程起重要作用,也是細胞的重要調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)〔22〕,Hedgehog信號通路參與多種疾病的產(chǎn)生與發(fā)展,在腫瘤中過度激活,可加速腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。Shh是Hedgehog通路的配體,Gli1是Hedgehog通路的下游因子,二者水平升高提示Hedgehog通路被激活。Shh可與相關受體激活Gli1進而激活Gli1下游因子,啟動基因轉(zhuǎn)錄的作用。Shh、Gli水平升高是Hedgehog通路激活的標志。多項研究發(fā)現(xiàn),Hedgehog通路在腸癌〔23〕等腫瘤中被激活,且Shh、Gli1為異常高表達。另有研究發(fā)現(xiàn)〔24〕,Hedgehog通路Shh、Gli1在宮頸癌中存在過表達,且與人HPV16型感染密切相關。劉潔等〔25〕研究表明,抑制Hedgehog通路后宮頸癌細胞的增殖受到抑制并誘導凋亡。周明莉〔26〕研究提示,長鏈編碼RNA通過抑制Hedgehog通路抑制乳腺癌細胞的增殖。本文與上述研究結(jié)果相似,提示LncRNA HAGLR可能是通過靶向抑制Shh、Gli1水平抑制了Hedgehog通路,從而抑制癌細胞的增殖并促進凋亡,雙熒光素酶報告結(jié)果也可證實Shh、Gli1是LncRNA HAGLR的靶基因。

綜上,LncRNA HAGLR靶向升高miR-143及抑制Hedgehog信號通路可抑制HPV16/18感染的宮頸癌細胞的增殖并誘導凋亡。