侯保健 嚴(yán)兆丹 張令暉 蔡莉

(湖北省第三人民醫(yī)院,湖北 武漢 430030)

糖尿病性骨質(zhì)疏松(DOP)是由糖尿病(DM)引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松(OP),是目前臨床中常見的2型糖尿病(T2DM)并發(fā)癥,具有骨組織結(jié)構(gòu)損壞、骨韌性降低等多種病理特性,可造成患者骨質(zhì)量發(fā)生進(jìn)行性病變,進(jìn)而影響生活質(zhì)量和健康安全〔1〕。相關(guān)研究表示〔2〕,DOP發(fā)生時(shí)患者產(chǎn)生骨折及骨損傷的概率增加?，F(xiàn)階段,對于DOP的治療臨床常通過提高調(diào)控血糖及改善骨密度等方式進(jìn)行干預(yù),雖可在一定程度上改善患者的臨床癥狀,但由于治療時(shí)間較長,極易使機(jī)體產(chǎn)生其他不良反應(yīng),進(jìn)而對致病環(huán)境和體質(zhì)改善產(chǎn)生不利影響。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)〔3〕,在DM中胰島β細(xì)胞功能異常對疾病進(jìn)程中具有關(guān)鍵意義。利拉魯肽不僅對能顯著提高胰島素的合成/分泌,且有研究證實(shí)其對DOP大鼠具有一定的治療效果〔4〕。經(jīng)研究〔5〕,在OP中人類胚胎發(fā)育調(diào)控因子(Hedgehog)信號通路可產(chǎn)生一定的調(diào)控作用,且作為參與骨形成/骨分化的關(guān)鍵因子,由Hedgehog信號蛋白、Ptc/Smo受體及相關(guān)下游因子等組成,且激活Hedgehog信號通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞增加〔6〕。在DOP中成骨細(xì)胞合成的骨鈣素(BGP)、骨基質(zhì)、骨轉(zhuǎn)換等因素的降低均大大提高了DOP的風(fēng)險(xiǎn)〔7〕。經(jīng)研究〔8〕,機(jī)體內(nèi)的營養(yǎng)因子及鈣元素的調(diào)節(jié)障礙也是誘發(fā)OP的關(guān)鍵因素,而腸道鈣吸收以鈣調(diào)節(jié)蛋白(CaBp-D9K)調(diào)和為主,CaBp-D9K的活性失衡對OP的產(chǎn)生具有重要影響,因此改善機(jī)體營養(yǎng)吸收業(yè)是治療 DOP的關(guān)鍵途徑。但目前尚未有關(guān)利拉魯肽對Hedgehog信號通路及CaBp-D9k具體作用的相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)研究利拉魯肽對DOP大鼠骨鈣素、Hedgehog信號通路及CaBp-D9k基因表達(dá)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級SD大鼠購自長沙市天勤生物公司(許可證號:SCXK(湘)2020-0214),體質(zhì)量200～300 g,大鼠常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食飲水,適應(yīng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批號:Y2020-002-10)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 全自動(dòng)化學(xué)分析儀(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司,型號:BK-1200),胰島素試劑盒(浙江愛康生物科技有限公司,貨號:C00601),蘇木素-伊紅(HE)染色液(上海西格生物科技有限公司,貨號XG-X6822),PCR儀(西安天隆科技有限公司,型號:Gentier 96R),TUNEL試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司,貨號:AT005-2),音猬因子(Shh)、細(xì)胞表面受體(Ptch)1、鋅指蛋白(Gli)1一抗(上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司,貨號:1206R),辣根過氧化物酶二抗(南京都萊生物技術(shù)有限公司,型號:E0040)。

1.3模型建立及干預(yù) 取60只SD大鼠隨機(jī)分為健康組、DM組、DM+利拉魯肽組、去勢組、DM+去勢組、DM+去勢+利拉魯肽組,每組10只。去勢模型:大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉固定后剃除毛發(fā)并消毒,在背部中央縱向切口3 cm,牽拉皮膚切口至一側(cè),正線邊2 cm,髂嵴上1.5 cm位置將肌肉進(jìn)行剝離,入切口找尋一側(cè)卵巢將輸卵管結(jié)扎并切除卵巢,依照此方法將另一側(cè)卵巢相同處理,縫合皮膚后對切口進(jìn)行消炎處理。DM模建立需腹腔注射60 mg/kg STZ(溶于檸檬酸緩沖液中),待72 h后測定模型空腹血糖,>16.7 mmol/L為建模成功。DM+去勢組、DM+去勢+利拉魯肽組在DM模型建立成功后建立去勢模型。健康組、DM組、去勢組、DM+去勢組常規(guī)培養(yǎng);DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組于造模1 w后進(jìn)行給藥,在皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽,1次/d,均干預(yù)8 w。

1.4檢測各組血糖及胰島素水平 給藥結(jié)束后,取各組大鼠下腔靜脈血2 ml,離心 15 min (轉(zhuǎn)速3 000 r/min),采集上層血清,將血清置于全自動(dòng)化學(xué)分析儀檢測空腹血糖值,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測胰島素水平。

1.5HE染色觀察病理形態(tài) 給藥結(jié)束后,腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死,收集股骨組織,將其在甲醛溶液中固定后,置于10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)溶液中脫鈣30 d。脫水-透蠟-包埋,5 μm切片,烘干-脫蠟至水-蘇木素染色,1%鹽酸乙醇處理5 s,洗滌,伊紅染色,梯度乙醇3 min,無水乙醇5 min,二甲苯5 min,擦干后,中性樹膠封片,晾干,顯微鏡下觀察并拍照。

1.6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測BGP、CaBp-D9k mRNA水平 取各組大鼠股骨組織,剪碎、研磨、離心后,Trizol法提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA,檢測RNA濃度,計(jì)算OD值,依據(jù)試劑盒,將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì),以β-actin為內(nèi)參。PCR體系為20 μl,60 ℃預(yù)熱3 min,90 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃變性60 s,70 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量,引物序列:BGP上游引物:5′-TCATGTCCAAGCAGGAGGGCAGTAA-3′,下游:5′-TTGTAGGCGTCCTGGAAGCCAATGT-3′;CaBp-D9k上游引物:5′-GATAAGAACGGTGATGGAGAAGT-3′,下游:5′-TCAATCAGTAGGTGGTGTCGG-3′;β-actin上游引物:5′-AGGGGTCCTCTGTGAACTTG-3′,下游:5′-CAGCAGTCTCATTCCAAGCC-3′。

1.7TUNEL檢測成骨細(xì)胞凋亡 取各組股骨組織石蠟標(biāo)本,切片固定,漂洗并用0.1 % Triton X-100浸潤,然后使用TUNEL分析試劑盒對凋亡的DNA片段進(jìn)行異硫氰酸熒光素(FITC)末端標(biāo)記。熒光顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的TUNEL陽性細(xì)胞并拍照。 根據(jù)骨組織細(xì)胞凋亡指數(shù) (AI)的計(jì)算公式,AI=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))× 100%。

1.8Western印跡檢測Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá) 將各組股骨組織進(jìn)行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進(jìn)行測量。每孔上樣蛋白量20 μg,將蛋白溶液與緩沖溶液(4∶1)混勻后煮沸,變性,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷,然后將50 μg蛋白轉(zhuǎn)移聚偏氟乙烯膜上,脫脂奶粉封閉1 h。加入Shh、Ptch1、Gli1一抗(1∶150)孵育過夜,磷酸鹽緩沖溶液漂洗3次,10 min/次,最后加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1 000),常溫封閉1.5 h。取出聚偏氟乙烯膜,上述方法漂洗。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑曝光顯影3 min,用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參。計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值,即為Shh、Ptch1、Gli1蛋白的相對表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行方差分析,兩組間對比采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組空腹血糖值及胰島素水平 與健康組相比,DM組、去勢組、DM+去勢組空腹血糖值明顯升高,胰島素水平明顯降低(P<0.05),經(jīng)過利拉魯肽干預(yù)后,與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組空腹血糖值顯著降低,胰島素水平顯著升高(P<0.05),DM組、去勢組及DM+去勢組空腹血糖、胰島素水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組空腹血糖值及胰島素水平對比

2.2HE染色觀察病理形態(tài) 與健康組相比,DM組和去勢組中骨小梁排列紊亂,數(shù)量減少,變細(xì),發(fā)生斷裂,空洞增多,成骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少,DM+去勢組中這種病理變化更加嚴(yán)重;DM+利拉魯肽組和DM+去勢+利拉魯肽組骨新生數(shù)量顯著增加,成骨細(xì)胞增多,見圖1。

圖1 各組股骨病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.3各組BGP mRNA、CaBp-D9k mRNA表達(dá) 與健康組相比,DM組、去勢組、DM+去勢組BGP、CaBp-D9k mRNA表達(dá)顯著降低,且以去勢組與DM+去勢組表達(dá)變化最顯著(P<0.05),經(jīng)過利拉魯肽干預(yù)后,與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組BGP、CaBp-D9k mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),DM組、去勢組及DM+去勢組BGP、CaBp-D9k mRNA表達(dá)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組BGP mRNA、CaBp-D9k mRNA表達(dá)對比

2.4各組成骨細(xì)胞凋亡 與健康組〔(4.06±0.30)%〕相比,DM組AI〔(13.08±1.31)%〕、去勢組〔(16.45±1.67)%〕、DM+去勢組〔(21.26±2.38)%〕增加,且以去勢組與DM+去勢組AI變化最顯著(P<0.05),經(jīng)過利拉魯肽干預(yù)后,與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組AI〔(8.27±1.54)%〕、DM+去勢+利拉魯肽組〔(11.42±1.73)%〕顯著降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組成骨細(xì)胞凋亡(免疫熒光染色,×200)

2.5Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá) 與健康組相比,DM組、去勢組、DM+去勢組Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá)明顯降低,且以去勢組與DM+去勢組水平變化最顯著(P<0.05);與DM組、去勢組及DM+去勢組相比,DM+利拉魯肽組、DM+去勢+利拉魯肽組Shh、Ptch1、Gli1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);DM組、去勢組及DM+去勢組Shh、Ptch1、Gli1表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

1～6:健康組、DM組、DM+利拉魯肽組、去勢組、DM+去勢組、DM+去勢+利拉魯肽組圖3 各組Shh、Ptch1、Gli1水平對比

表3 各組Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達(dá)對比

3 討 論

DOP的疾病進(jìn)程與胰島細(xì)胞的相關(guān)功能具有密切聯(lián)系,以往臨床DOP治療藥物對調(diào)控胰島細(xì)胞增殖分化及骨代謝具有一定的局限性。而利拉魯肽可有效加速修復(fù)胰島細(xì)胞,改善骨代謝。相關(guān)研究表示〔9〕,利拉魯肽對降低骨折發(fā)生具有良好效果,且男性肥胖T2DM患者接受利拉魯肽治療后,骨形成增加同時(shí)骨吸收受到抑制〔10〕。臨床治療中,利拉魯肽是控制T2DM患者的血糖及體質(zhì)量的新藥且具有良好治療效果。 此外,利拉魯肽能夠有效改善OP動(dòng)物模型的骨結(jié)構(gòu)及骨密度,對骨的良好形成具有積極作用〔11〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)〔12〕利拉魯肽可有效調(diào)節(jié)骨代謝,抑制破骨細(xì)胞增加,對糖尿病去卵巢大鼠起骨保護(hù)作用。經(jīng)研究,不僅可調(diào)節(jié)骨代謝激素、反映成骨細(xì)胞活性,也是骨形成及骨質(zhì)量判定的重要標(biāo)志物〔13〕。本研究提示提示利拉魯肽具有降血糖,促骨形成的作用,這與王志剛等〔14〕及溫濱紅等〔15〕的研究結(jié)果一致。

Hedgehog不僅可干預(yù)成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化,還對調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和介導(dǎo)信號中Shh及多種骨骼生長發(fā)育密切相關(guān)〔16,17〕。 此外,Shh與細(xì)胞在肢體、體節(jié)、神經(jīng)管發(fā)育中的分化建立有關(guān),參與軟骨發(fā)育。 Ptch1、Gli1在Hedgehog 通路中發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。研究表明〔18〕Shh升高對激活Gli1/Ptc轉(zhuǎn)錄和增加Gli1蛋白表達(dá),促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化進(jìn)而促進(jìn)治療具有重要意義。有學(xué)者〔19〕表示,OP產(chǎn)生機(jī)制與Hedgehog信號傳導(dǎo)通路Shh、Gli1 mRNA和蛋白活性下降有關(guān),在經(jīng)過治療后,通過激活Hedgehog信號傳導(dǎo)通路中的Shh、Gli1,以促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收,起到防止骨質(zhì)疏松的作用。此外,高建強(qiáng)等〔20〕研究提示,GLP-1激動(dòng)劑可通過激活Hedgehog通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過利拉魯肽干預(yù)后 PTCH1、Gli1、Shh水平升高,與上述研究結(jié)果相似,提示利拉魯肽通過調(diào)控TCH1、Gli1、Shh表達(dá)激活Hedgehog通路,促進(jìn)成骨分化。

在腸道鈣吸收中跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程是其關(guān)鍵方式。常規(guī)小腸內(nèi)鈣離子吸收以十二指腸為主,并由腸鈣吸收通道基因CaBp-D9K進(jìn)行介導(dǎo)〔21〕。而CaBp-D9K作為受維生素D介導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)及促進(jìn)鈣離子穿透細(xì)胞到達(dá)基底側(cè),并與鈣吸收呈正相關(guān)。小腸吸收的鈣進(jìn)入機(jī)體后,多數(shù)鈣通過儲(chǔ)存使骨礦化增加,提示骨密度等增加,從而改善OP。研究顯示〔22〕,CaBp-D9K下降是絕經(jīng)后OP高發(fā)的關(guān)鍵,由于絕經(jīng)女性雌激素水平降低可導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺和維生素 D顯著降低,進(jìn)而導(dǎo)致腸道功能及腸黏膜內(nèi)CaBp-D9K 發(fā)生障礙。韓龍等〔23〕研究提示,通過增加小腸CaBp-D9k mRNA表達(dá),促進(jìn)腸鈣吸收,從而降低去卵巢大鼠OP程度。本研究提示,利拉魯肽可通過促進(jìn)CaBp-D9K的合成,增強(qiáng)小腸鈣吸收能力,從而糾正體內(nèi)負(fù)鈣平衡狀態(tài)抑制破骨作用,促進(jìn)成骨作用。