王嫣 金建懷 許友山 郝慶欽 夏衛(wèi)

（無錫市中心血站，江蘇 無錫 214000）

新型血清標(biāo)志物乙型肝炎核心相關(guān)抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）由前C基因和C基因編碼的HBcAg、HBeAg、p22cr 3種蛋白組成，它們共同擁有1 段149 個(gè)氨基酸的序列，可被同1抗體檢測。松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）感染肝細(xì)胞后，首先要被修復(fù)成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）[1]。HBV cccDNA 是復(fù)制的原始模板，它的形成和持續(xù)存在是引起HBV 慢性感染和導(dǎo)致慢乙肝患者難以治愈及肝癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，也是激活隱匿性HBV 感染（occult HBV infection,OBI）的主要原因[2]。臨床上肝活組織檢查可以準(zhǔn)確反映肝組織內(nèi)HBV cccDNA 的水平，但肝活檢是1 種有創(chuàng)檢查，且需要進(jìn)行多次有創(chuàng)檢查，多數(shù)患者很難接受，故通過肝活組織檢查來監(jiān)測患者HBV cccDNA 水平還存在著較大的困難，目前迫切需要尋找1種操作方便且能反映肝組織內(nèi)cccDNA水平的血清學(xué)替代指標(biāo)。

HBcrAg 能夠反映肝組織cccDNA 的含量和轉(zhuǎn)錄活性，是近年來的研究熱點(diǎn)[3]。研究表明，在未治療及經(jīng)NAs 治療后的慢乙肝患者中，無論HBeAg陽性或陰性患者，HBcrAg與cccDNA具有顯著相關(guān)性[4]。我國是乙型病毒性肝炎感染大國，慢性感染人數(shù)至少2.57 億人[5]，獻(xiàn)血者中潛在的HBsAg-/HBV DNA+感染者排除窗口期感染即為OBI。OBI作為HBV 持續(xù)性感染的特殊形式，成為威脅血液制品安全和受血者健康的隱患，隨著核酸技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在血液篩查中互補(bǔ)開展應(yīng)用逐漸被最大限度檢出。目前有關(guān)新型血清標(biāo)志物HBcrAg 的研究多為慢性乙肝感染、肝硬化、肝癌患者等。本研究從血液安全角度出發(fā)，旨在分析血清中HBcrAg 在獻(xiàn)血人群篩檢HBsAg-/HBV DNA+感染者的表達(dá)情況，為探討其在OBI感染發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的思路，從而改進(jìn)血液HBV篩查方法，降低漏檢率，提高臨床用血安全。

1 對象與方法

1.1 研究對象

對無錫市中心血站2019—2020 年104 917 名無償獻(xiàn)血者進(jìn)行2遍酶聯(lián)免疫吸附法及1遍實(shí)時(shí)熒光定量PCR 核酸初篩，選取了47 名HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者進(jìn)行電話追蹤，成功追蹤到37名至本站采集血液標(biāo)本。37 份HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者血液標(biāo)本進(jìn)行1 遍電化學(xué)發(fā)光法和PCR 核酸檢測篩查出22 名HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者標(biāo)本作為OBI組。選取20名經(jīng)過2遍酶聯(lián)免疫吸附法及1遍PCR核酸檢測都合格的獻(xiàn)血者作為健康對照組，選取20名經(jīng)無錫市第五人民醫(yī)院臨床診斷為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者作為CHB組，其中男15名，女5名；年齡25～51歲，所有病例6個(gè)月內(nèi)未使用抗病毒制劑；診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS299-2008)以及《慢性乙型肝炎防治指南》(2015更新版)[6]。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA 檢測試劑（英科新創(chuàng)公司，批號：B20201139;上海科華公司，批號：202009231），Cobas TaqScreen MPX test HBV 核酸檢測試劑(羅氏診斷公司，批號：G11355)。乙肝兩對半：乙型肝炎病毒抗原抗體檢測系統(tǒng)（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）（上海博陽生物科技有限公司，批號：A2001)；HBcrAg 檢測試劑（廈門侖昌碩公司，批號：202102210033）。LICA500 自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測儀（上海博陽公司），Hamilton STAR全自動(dòng)加樣儀、Microlab FAME 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)（Hamilton 公司），Cobas S201 全自動(dòng)核酸檢測系統(tǒng)（羅氏診斷公司），RT-6100 酶標(biāo)分析儀（Rayto 公司）;AU480 全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

無菌操作采集37 份既往HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者的新鮮血清，分成酶免(分離膠)檢測和核酸(帶分離膠，EDTA-K2抗凝)檢測各1 管（5 mL/管）。采血后4 h 內(nèi)1 800×g，離心20 min，2～8℃保存，并在48 h內(nèi)完成檢測。剩余血清-80℃保存。

1.3.2 血清學(xué)檢測

對37 份既往HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者血清用化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg，若為陰性，則進(jìn)行下一步核酸檢測。

1.3.3 核酸檢測

采用Cobas Taqsceen MPX 試劑進(jìn)行單標(biāo)本檢測，單標(biāo)本檢測有反應(yīng)性判定為NAT 陽性，即為HBsAg-/HBV DNA+OBI 組；單標(biāo)本檢測無反應(yīng)性判定為NAT陰性，不納入本研究范圍。

1.3.4 乙肝兩對半檢測

對納入研究的OBI 組標(biāo)本進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝抗原抗體系統(tǒng)。

1.3.5 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測

對OBI組標(biāo)本進(jìn)行ALT檢測,檢測范圍是5～50 U/L。

1.3.6 HBcrAg含量的檢測

對本研究的3 組標(biāo)本都采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。檢測范圍是（0.25～8）ng/mL。

1.3.7 HBV DNA定量

采用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部自建系統(tǒng)定量（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。HBcrAg與乙肝血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般資料

CHB 組、OBI 組與健康對照組在年齡、性別構(gòu)成比、ALT 方面均無差異（P＞0.05），各組間具有可比性，見表1。

表1 3組研究對象基本信息Table 1 Basic information of 3 groups of research subjects

2.2 OBI組乙肝兩對半的檢出特征

37份獻(xiàn)血者標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg 和核酸篩查，檢出22 份HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本，檢出率59.46%(22/37)，對這22 例OBI 進(jìn)行乙肝兩對半的檢測，HBsAg 檢測都為陰性，HBcAb 檢出率86.36%(19/22)，HBeAb檢出率22.73%（5/22）。

2.3 CHB 組、OBI 組與健康對照組的血清中HBcrAg表達(dá)水平比較

HBcrAg表達(dá)水平在3組間兩兩比較（單因素方差分析），均有差異（P＜0.05），見表2。

表2 3組研究對象HBcrAg表達(dá)比較（±s）Table 2 Comparison of the expression of HBcrAg among three groups（x±s）

表2 3組研究對象HBcrAg表達(dá)比較（±s）Table 2 Comparison of the expression of HBcrAg among three groups（x±s）

注：F=49.87，P＜0.05

CHB組1.14±0.23 HBcrAg（ng/mL）健康對照組0.47±0.09 0BI組0.92±0.13

2.4 OBI 組HBcrAg 與HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA的相關(guān)性

HBcrAg 與HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA 無相關(guān)性（P＞0.05），見表3。

表3 OBI 組HBcrAg 與HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA的相關(guān)性Table 3 Correlation between HBcrAg and HBeAb, HBcAb,ALT,and HBV DNA in the OBI group

3 討論

血清HBV DNA 水平易受抗病毒藥物，特別是核苷（酸）類似物抗HBV 藥物的影響，不能很好地反映肝內(nèi)HBV 的復(fù)制情況[8]，新型血清標(biāo)志物HBcrAg不但可避免反復(fù)肝臟穿刺取材檢測cccDNA的風(fēng)險(xiǎn)與繁瑣及被檢者的痛苦，而且能反映整合HBV DNA 的轉(zhuǎn)錄活性，是反映肝內(nèi)HBV cccDNA水平的較好替代指標(biāo)，其準(zhǔn)確性優(yōu)于血清HBV DNA和HBsAg水平[9]。唐紅等[10]曾對139例接受肝活組織檢查的慢乙肝患者血清中HBcrAg、HBsAg、HBV DNA和肝內(nèi)cccDNA的水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)血清HBcrAg水平與肝內(nèi)HBV cccDNA水平呈顯著相關(guān)(r=0.929，P＜0.05)，且這一相關(guān)性明顯優(yōu)于HBsAg(r=0.742，P＜0.05) 和HBV DNA(r=0.854，P＜0.05)。由于cccDNA 主要存在于肝細(xì)胞核中，當(dāng)肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，才釋放到血液中，血清中微乎其微，幾乎檢測不到，因此臨床上采取檢測肝活組織的cccDNA 的含量才能準(zhǔn)確評估患者HBV 的復(fù)制程度和制定相應(yīng)的診療方案。本研究中的22例OBI 雖然檢測HBV DNA 有反應(yīng)性，但病毒載量不高，不足以嚴(yán)重?fù)p害肝細(xì)胞，其釋放于血清的cccDNA極低，目前檢測技術(shù)尚未能檢測到其含量，故未做血清HBcrAg 與肝活組織HBV cccDNA 之間的相關(guān)性研究。

本研究中的3 組研究對象HBcrAg 水平依次為：CHB 組＞OBI 組＞健康對照組。推測其原因，是由于HBV cccDNA即使量很少，在慢性乙型肝炎中通常只占肝內(nèi)HBV DNA 總量的1%以下[11]，卻可以十分穩(wěn)定地存在，目前臨床廣泛使用的核苷（酸）類似物抗HBV藥物對其沒有直接抑制作用。采供血機(jī)構(gòu)篩查出的HBsAg-/HBV DNA+感染者都是未使用過核苷（酸）類似物的自然人，其潛在的cccDNA完整的保留在肝細(xì)胞中，但并不是所有的受血者都會(huì)發(fā)生HBV感染，宿主的免疫功能、輸血量和患者的病毒載量會(huì)影響其發(fā)生率[12]。臨床上78%的接受抗病毒治療的患者經(jīng)常無法檢測到血清HBV DNA，卻可檢測到血清HBcrAg[13]，其原因是cccDNA的穩(wěn)定存在，也是導(dǎo)致隱匿性肝炎再激活的主要原因之一。

西方等發(fā)達(dá)國家HBV 的流行率低，大多采用聯(lián)合HBsAg 與抗-HBc 或HBV 核酸檢測的方法來篩查獻(xiàn)血者，輸血后肝炎發(fā)生率非常低[14]。本研究中OBI 組HBcAb 檢出率為86.36%，提示我們可以將HBcAb和HBsAg同時(shí)做為篩查獻(xiàn)血者的血清指標(biāo)。另外，HBeAb 是感染者血液中HBV 復(fù)制受到抑制而表現(xiàn)出乙肝病毒減少，可以出現(xiàn)在慢性乙肝患者和無癥狀HBsAg 攜帶者。我們對22 名HBsAg-/HBV DNA+感染者的HBcrAg 與其HBeAb、HBcAb、ALT、HBV DNA 等血清學(xué)檢測指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果表明HBcrAg與上述指標(biāo)之間無相關(guān)性。其原因是本研究僅為本中心小樣本的追蹤性實(shí)驗(yàn)，追蹤的數(shù)量和時(shí)間有限，需要在今后研究中擴(kuò)大樣本量并且聯(lián)合多中心進(jìn)行針對不同年齡、不同病程的OBI 感染者對其拉長持續(xù)追蹤的時(shí)間和增加次數(shù)，動(dòng)態(tài)了解HBsAg-/HBV DNA+人群的HBcrAg 表達(dá)水平，才能更充分體現(xiàn)出血清HBcrAg水平在篩查HBsAg-/HBV DNA+人群的優(yōu)越性，最大限度降低輸血HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)。

雖然試驗(yàn)用的是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清HBcrAg 水平，但這與目前我國血站檢測HBsAg 的方法一致，且目前很少有文獻(xiàn)報(bào)道此方法檢測血清HBcrAg 水平與HBsAg-/HBV DNA+獻(xiàn)血者的相關(guān)性，這是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)之一。綜上所述，新型血清標(biāo)志物血清HBcrAg在本研究中對篩查出HBsAg-/HBV DNA+感染者有一定的影響和應(yīng)用前景，在一定程度上可反映肝細(xì)胞中的cccDNA 的存在水平。