劉元杰,王秀麗,李 建,辛凌翔,朱良全,張一幟,姚文生,劉 燕

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,HPS),又稱為格拉瑟氏菌(Grassella),可引起豬的副豬嗜血桿菌病,造成豬的發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟(jì)失調(diào)等癥狀[1]。按照瓊脂擴(kuò)散血清分型方法,HPS可以分為15個(gè)血清型[2]。在我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)中,4、5、12型為主要流行血清型[3]。目前國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的滅活疫苗涉及1、4、5、6、12、13共六個(gè)血清型,其中包含4型和5型產(chǎn)品最多。目前HPS疫苗產(chǎn)品主要依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià),但由于不同企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)控菌株不同,缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),給評(píng)價(jià)工作造成一定難度,亟需篩選出一種統(tǒng)一的攻毒菌株并建立配套的評(píng)價(jià)方法。豚鼠是HPS疫苗效力評(píng)價(jià)的最經(jīng)濟(jì)有效的替代動(dòng)物,我們通過(guò)用豚鼠進(jìn)行毒力測(cè)定的方法,從現(xiàn)有菌種資源中篩選出毒力較強(qiáng)的菌株,為效力檢驗(yàn)攻毒菌種的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌株 CVCC3953、CVCC3955、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4121、CVCC4312、CVCC4355、CVCC4356,由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基 TSA、TSB購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)股份有限公司;NAD購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;新生牛血清購(gòu)自?shī)W普賽生物科技有限公司。TSA與TSB均添加5%新生牛血清和0.002%NAD。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF豚鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2 方 法

2.1 血清型鑒定 取CVCC3953、CVCC3955、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4121、CVCC4312、CVCC4355、CVCC4356菌種,接種于TSB,37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)12 h,將菌液高壓滅活制備PCR模板。以F0、F4為上游引物,R0、R4為下游引物(表1)[4-5],分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察條帶大小。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab 1 PCR amplification primers

2.2 生長(zhǎng)特性研究

2.2.1 菌種復(fù)壯 取CVCC3953、CVCC3955、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4121、CVCC4312、CVCC4355、CVCC4356菌種,劃線接種于TSA平板,37 ℃溫箱培養(yǎng)。在24、48、72 h觀察菌落生長(zhǎng)情況,分別計(jì)算菌落平均直徑。

2.2.2 擴(kuò)大培養(yǎng) 經(jīng)過(guò)平板復(fù)壯培養(yǎng)后,分別將挑取TSA平板上的單菌落,接種于100 mL TSB中, 37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)。在0、2、4、6、8、10、12、14 h分別取樣,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每個(gè)菌株各做2次重復(fù),以活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

2.2.3 離心對(duì)菌數(shù)影響研究 按2.2.1和2.2.2步驟將CVCC3953、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4355、CVCC4356進(jìn)行復(fù)壯和擴(kuò)大培養(yǎng),取新鮮菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。再各取新鮮菌液30 mL于離心管中,每株各取兩管,分別以5000 和8000 r/min進(jìn)行離心,棄上清液,各加30 mL TSB將菌體沉淀重懸,再次進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。進(jìn)行上述操作3次,以3次結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果,比較離心前后的活菌數(shù)量。

2.3 豚鼠測(cè)毒試驗(yàn)

2.3.1 攻毒菌液的制備 選取CVCC3953、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4355、CVCC4356菌種,劃線接種于TSA,37 ℃溫箱培養(yǎng)24～48 h。挑取單菌落,接種于100 mL TSA中,37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)8～10 h。細(xì)菌原液分別進(jìn)行16倍和4倍濃縮以及1/4和1/16稀釋,并取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

2.3.2 攻毒 將130只豚鼠分為26組,每組5只,分別進(jìn)行攻毒(表2)。

表2 豚鼠攻毒分組Tab 2 Groups of guinea pig challenge

2.3.3 豚鼠觀察和剖檢 攻毒完成后,以豚鼠死亡或出現(xiàn)不良臨床反應(yīng)并持續(xù)2 d以上作為預(yù)設(shè)發(fā)病標(biāo)準(zhǔn),逐日觀察豚鼠狀況。共觀察10 d,以觀察期內(nèi)發(fā)病豚鼠總數(shù)作為最終的發(fā)病數(shù)。死亡豚鼠進(jìn)行剖檢,觀察胸腔、腹腔是否有積液,各臟器是否出現(xiàn)病變。

3 結(jié)果與分析

3.1 血清型鑒定結(jié)果 CVCC3953、CVCC3955、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4121、CVCC4312、CVCC4355、CVCC4356以F0、R0為引物均擴(kuò)增出大小為275 bp的條帶,以F4、R4為引物均擴(kuò)增出大小為753 bp條帶(圖1),表明8株候選菌株均為HPS 4型。

M: Marker; 1: CVCC4355; 2. CVCC4356; 3. CVCC3953; 4. CVCC3955; 5: CVCC3962; 6: CVCC4115; 7: CVCC4121; 8: CVCC4312; 9:陽(yáng)性對(duì)照;10:陰性對(duì)照?qǐng)D1 血清型鑒定結(jié)果Fig 1 Results of serotype identification

3.2 TSA平板復(fù)壯結(jié)果 相同菌種在同一觀察時(shí)間的菌落大小基本一致,其中CVCC3955、CVCC4121、CVCC4355經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后菌落為針尖大小,48 h菌落平均直徑達(dá)到1 mm,菌種復(fù)壯時(shí)間宜采取48 h;CVCC3953、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4356經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后菌落平均直徑可以達(dá)到1 mm,菌種復(fù)壯時(shí)間宜采取24 h;CVCC4312經(jīng)過(guò)72 h培養(yǎng)后菌落平均直徑可以達(dá)到1 mm,選取72 h為復(fù)壯時(shí)間。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8株候選菌平板復(fù)壯結(jié)果Tab 3 Plate rejuvenation results of 8 candidate strains

3.3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 8株菌生長(zhǎng)曲線均基本符合細(xì)菌遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期四個(gè)階段。相同菌種在同一取樣時(shí)間的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果差異不大,其中CVCC3953、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4355、CVCC4356活菌數(shù)平均值的峰值基本可達(dá)到2×109CFU/mL,選取作為毒力測(cè)定的候選菌株。但CVCC3955、CVCC4121、CVCC4312活菌數(shù)平均值的峰值均低于1×109CFU/mL,故不再進(jìn)行后續(xù)研究。生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 8株候選菌生長(zhǎng)曲線Fig 2 Growth curve of 8 candidate strains

3.4 離心對(duì)菌數(shù)影響結(jié)果 CVCC3953、CVCC3962、CVCC4115、CVCC4355、CVCC4356分別經(jīng)5000和8000 r/min離心后,菌數(shù)與原菌液差別不明顯。但5000 r/min離心后的活菌數(shù)略高于8000 r/min離心,故選取5000 r/min作為后續(xù)研究的離心方法。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 離心對(duì)菌數(shù)影響結(jié)果Tab 4 Effect of centrifugation on viable count

3.5 豚鼠觀察和剖檢結(jié)果 豚鼠發(fā)病均在攻毒后2～3 d,死亡均在攻毒后1～3 d。發(fā)病豚鼠主要表現(xiàn)為精神沉郁、被毛粗亂,嚴(yán)重的出現(xiàn)便血等癥狀(圖3),一般發(fā)病后3～5 d可恢復(fù)正常。

圖3 發(fā)病豚鼠癥狀Fig 3 Symptoms of diseased guinea pigs

對(duì)死亡豚鼠進(jìn)行剖檢,其胸腹腔出現(xiàn)積液,脾臟和腸系膜淋巴結(jié)出血、腫大,肺臟和肝臟也有出血;發(fā)病豚鼠的各臟器也存在一定程度的上述病變;對(duì)照豚鼠各臟器正常。病變情況見(jiàn)圖4。

圖4 豚鼠剖檢癥狀Fig 4 Autopsy symptoms of Guinea pigs

3.6 測(cè)毒結(jié)果 使100%豚鼠發(fā)病的最小劑量為最小發(fā)病劑量,CVCC3953最小發(fā)病劑量為1.1×1010CFU;CVCC4355最小發(fā)病劑量為8.3×109CFU。CVCC3962、CVCC4115、CVCC4356雖未測(cè)出最小發(fā)病劑量,但根據(jù)數(shù)據(jù)分析,CVCC3962的最小發(fā)病劑量應(yīng)高于1.2×1010CFU;CVCC4115應(yīng)高于1.0×1010CFU;CVCC4356應(yīng)高于1.1×1010CFU。綜合判斷CVCC4355的最小發(fā)病劑量最低。豚鼠發(fā)病情況見(jiàn)表5。

表5 攻毒豚鼠發(fā)病結(jié)果Tab 5 Disease outcomes of Challenge guinea pigs

4 討論和結(jié)論

制備攻毒菌液一般要經(jīng)過(guò)復(fù)壯和擴(kuò)大培養(yǎng)兩個(gè)步驟。本研究中采用平板劃線的復(fù)壯培養(yǎng)方式,菌落大小是復(fù)壯培養(yǎng)時(shí)間確定的主要依據(jù)。菌落過(guò)小,肉眼難以觀察,接種操作困難;菌落過(guò)大,細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期,活菌數(shù)量減少。經(jīng)驗(yàn)表明,細(xì)菌復(fù)壯過(guò)程中,菌落直徑1 mm左右時(shí)活菌數(shù)量較多且易接種操作,故宜將菌落直徑達(dá)到1 mm的時(shí)間作為復(fù)壯培養(yǎng)時(shí)間。從8株菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線可以看出,遲緩期不明顯,這應(yīng)與接種量有一定關(guān)系,單菌落接種TSB后,起始菌數(shù)可達(dá)106CFU/mL,培養(yǎng)8～10 h后即可達(dá)到活菌數(shù)峰值。但在測(cè)毒試驗(yàn)中,其中5株菌種的活菌數(shù)均未達(dá)到曲線中的最大菌數(shù),這可能與采取的培養(yǎng)方式有關(guān)。在繪制生長(zhǎng)曲線過(guò)程中,由于需要頻繁地開(kāi)塞取樣,空氣交換比較充分;液體培養(yǎng)時(shí)雖然采用了透氣膠塞,但仍可能無(wú)法達(dá)到相應(yīng)的空氣交換效率。后續(xù)研究中擬采取用無(wú)菌硫酸紙?zhí)娲z塞以增加空氣交換效率。

在常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,HPS只對(duì)小鼠和豚鼠有致死作用[6],對(duì)豚鼠的致病性強(qiáng)于小鼠[7],所以豚鼠是HPS測(cè)毒的最佳替代動(dòng)物。不過(guò)HPS對(duì)豚鼠致病菌數(shù)仍然很高,根據(jù)本研究中的測(cè)毒數(shù)據(jù),即便是毒力最強(qiáng)的CVCC4355,其最小發(fā)病劑量也達(dá)到了8.3×109CFU。這意味著液體擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)獲得的菌液活菌數(shù)可能無(wú)法滿足攻毒的要求,需對(duì)菌液進(jìn)行適當(dāng)濃縮。本研究通過(guò)5000和8000 r/min離心前后活菌數(shù)的比較,證實(shí)離心對(duì)活菌數(shù)的影響可以忽略不計(jì)。后續(xù)研究中如果擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)菌液活菌數(shù)達(dá)不到攻毒要求,可通過(guò)濃縮方式加以解決。

通過(guò)吸光度值估算活菌數(shù)也是確定活菌計(jì)數(shù)的常用方法之一。計(jì)芬芬等曾通過(guò)測(cè)量菌液OD600 nm的方法建立了金黃色葡萄球菌活菌數(shù)與OD值的線性回歸方程[8];部分副豬嗜血桿菌類疫苗,如副豬嗜血桿菌病三價(jià)滅活疫苗(4型BJ02株+5型GS04株+13型HN02株),在效力檢驗(yàn)操作中也通過(guò)測(cè)定OD值的方法估算攻毒菌液活菌含量[9]。但吸光度測(cè)定法無(wú)法區(qū)分死菌和活菌,估算出的菌數(shù)結(jié)果可能高于實(shí)際的活菌數(shù)。本研究旨在篩選攻毒菌株,需要準(zhǔn)確把握候選菌株的實(shí)際最小發(fā)病劑量,故采取了直接確定活菌數(shù)的預(yù)實(shí)驗(yàn)和復(fù)數(shù)的方法。

目前HPS類疫苗產(chǎn)品效力檢驗(yàn)多采用豬免疫攻毒法,尚未有可應(yīng)用于產(chǎn)品效力檢驗(yàn)的替代動(dòng)物免疫攻毒法。HPS對(duì)豬的致死性較差,對(duì)豬的致病性一般通過(guò)臨床癥狀和剖檢病變綜合判斷。故在豚鼠測(cè)毒試驗(yàn)中,對(duì)測(cè)毒豚鼠也進(jìn)行了剖檢。其中脾臟、淋巴結(jié)腫大、出血是最明顯的剖檢癥狀,但未出現(xiàn)豬臟器纖維素性滲出等典型剖檢癥狀[10]。從不良反應(yīng)來(lái)看,雖然發(fā)病豚鼠出現(xiàn)了精神沉郁、被毛粗亂,嚴(yán)重的出現(xiàn)便血等癥狀,但一般發(fā)病后3 d左右可自行恢復(fù)。在建立豚鼠發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)參照這一事實(shí)依據(jù),宜將豚鼠臨床癥狀持續(xù)時(shí)間2 d以上作為發(fā)病指標(biāo)。

本研究通過(guò)豚鼠測(cè)毒試驗(yàn)篩選出毒力最強(qiáng)的HPS 4型CVCC4355菌株;通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)特性的研究明確了CVCC4355的攻毒菌液制備方法;同時(shí)歸納了HPS 4型感染豚鼠的臨床癥狀和剖檢病變,為建立豚鼠免疫攻毒效力檢驗(yàn)方法奠定基礎(chǔ)。