韓寧寧,趙富華,王 軒,彭文繡,汪 霞

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

細菌內(nèi)毒素是獸藥注射劑中最主要和最易導(dǎo)致熱原反應(yīng)的污染物,其為革蘭氏陰性菌細胞壁上的脂多糖(LPS)成分,在細菌死亡或自溶后釋放。細菌內(nèi)毒素由三部分構(gòu)成:O-特異性側(cè)鏈、核心多糖和類脂A,其中類脂A是LPS的主要毒性[1]。內(nèi)毒素可能會在革蘭氏陰性菌死亡后在細胞壁片段中保持活性,因此,供試品可能是無菌的,但仍可能檢測出內(nèi)毒素。注射劑中存在細菌內(nèi)毒素時,表明在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的某一個或幾個節(jié)點存在革蘭氏陰性菌的污染[2]。為保證獸藥注射劑的安全可控,《中國獸藥典》附錄0102規(guī)定,靜脈用注射劑必須進行細菌內(nèi)毒素的檢查[3]。

新獸藥細菌內(nèi)毒素檢查方法建立的過程,涉及到內(nèi)毒素限值的制定、最大稀釋倍數(shù)(MVD)或最小稀釋濃度(MVC)的計算、藥物前處理、干擾試驗的設(shè)計與驗證等多個關(guān)鍵步驟。產(chǎn)品申報方應(yīng)按照《中國獸藥典》附錄1143細菌內(nèi)毒素檢查法的相關(guān)要求[4],結(jié)合自身產(chǎn)品特點和國內(nèi)外相關(guān)研究現(xiàn)狀,制定適宜的內(nèi)毒素檢查方法。與此同時,申報方亦應(yīng)關(guān)注該方法的技術(shù)評審要點,避免方法建立過程中的常見問題,保證方法的準(zhǔn)確可靠。

1 細菌內(nèi)毒素限值制定的相關(guān)評審要點與常見問題

細菌內(nèi)毒素的限值是指動物對獸藥中細菌內(nèi)毒素所能耐受的不致引起熱原反應(yīng)的臨界值(L)。其計算公式為:L=K/M。

式中,L根據(jù)供試品給藥方式的不同,一般以EU/mL、EU/mg或EU/U表示。

K為每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量。目前,《中國獸藥典》中的K值借鑒了人用藥[5]的相關(guān)指標(biāo),即注射劑K=5EU/(kg·h),放射性注射劑K=2.5EU/(kg·h),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg·h)。需要注意的是,由于動物與人體對內(nèi)毒素耐受程度存在差異,不同動物品種之間對內(nèi)毒素耐受程度亦存在差異,采用同一K值用于不同動物的內(nèi)毒素限值計算存在一定的偏差。

M為每千克體重每小時的最大供試品單次劑量。當(dāng)供試品的用法用量為頻繁間隔注射或連續(xù)輸注時,M為每小時給藥的最大總劑量。M的單位應(yīng)與供試品給藥方式相適應(yīng),例如,當(dāng)供試品按體積給藥時,M以mL/kg表示;當(dāng)供試品按重量給藥時,M以mg/kg表示;當(dāng)供試品以生物活性單位給藥時,M以U/kg表示;當(dāng)供試品可用于多個動物品種時,應(yīng)使用最小動物品種使用的最大供試品劑量;當(dāng)幼年動物的每千克體重劑量高于成年動物時,應(yīng)使用幼年動物的每千克體重劑量。

新獸藥產(chǎn)品,可以根據(jù)上述公式結(jié)合產(chǎn)品給藥方式進行計算以制定內(nèi)毒素限值。另外,對于仿制藥品種,可以參考原研產(chǎn)品的限值;當(dāng)國際藥典等法定標(biāo)準(zhǔn)收載相應(yīng)產(chǎn)品時,亦可參考法定標(biāo)準(zhǔn)的限值。

評審過程中最常見問題是注冊資料中缺少限值的制定依據(jù)或計算過程,僅提供了干擾試驗的驗證過程和產(chǎn)品的檢測結(jié)果。而限值的制定是評價該檢查項是否可良好反映產(chǎn)品安全性的重要依據(jù),更是后續(xù)稀釋倍數(shù)計算和干擾試驗設(shè)計的前提。因此,申報方應(yīng)充分闡述相應(yīng)產(chǎn)品內(nèi)毒素限值的制定過程。

第二個常見問題是混淆了原料限值與制劑限值的推導(dǎo)邏輯關(guān)系。內(nèi)毒素限值是根據(jù)注射劑的給藥方式和動物耐受程度計算出的結(jié)果。當(dāng)制劑限值確定時,可根據(jù)產(chǎn)品含量規(guī)格,推導(dǎo)出原料的限值[6]。例如,某注射液限值是10 EU/mL,規(guī)格是2 mg/mL,則對應(yīng)原料限值是10÷2=5 EU/mg。但是,根據(jù)原料限值推導(dǎo)制劑限值則是不合邏輯的推導(dǎo)過程。

第三個常見問題是,當(dāng)同時申報無菌原料與制劑時,二者的內(nèi)毒素限值存在較大差異又缺乏合理解釋。例如,某企業(yè)申報注冊的布舍瑞林注射液限值為50 EU/mL;同時申報的布舍瑞林原料內(nèi)毒素限值參考了EP標(biāo)準(zhǔn),為55.5 EU/mg。該注射液規(guī)格為4.2 μg/mL,推算原料限值應(yīng)為50÷0.0042=11905 EU/mg,與55.5 EU/mg差異巨大。申報方并未提供注射液除主藥外其他成分的內(nèi)毒素測定情況,無法合理解釋制劑中內(nèi)毒素來源,評審員則有理由質(zhì)疑注射液限值計算過程的合理性。

2 MVD或MVC計算的相關(guān)評審要點與常見問題

MVD指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù),在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素的檢測。其計算公式為MVD=cL/λ,其中L為供試品的內(nèi)毒素限值;c為供試品溶液的濃度;λ在凝膠法中為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/mL),在光度測定法中為所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥,MVD=1,計算MVC=λ/L。以下三個實例演示MVD或MVC的計算過程:

某注射液規(guī)格為20 ml:5 g,內(nèi)毒素限值L=0.50 EU/mL,鱟試劑λ=0.125EU/mL,則MVD=cL/λ=1×0.50/0.125=4。

某注射液規(guī)格為20 ml:5 g(250 mg/mL),內(nèi)毒素限值L=0.50 EU/mg,鱟試劑λ=0.125 EU/mL,則MVD=cL/λ=250×0.50/0.125=1000。

某注射用粉針內(nèi)毒素限值L=0.50 EU/mg,鱟試劑λ=0.125 EU/mL,則MVC=λ/L=0.125/0.50=0.25 mg/mL。

評審過程中最常見問題是MVD與MVC混淆。例如,某企業(yè)申報注冊泰拉霉素原料,材料中說明了MVD的計算過程,并根據(jù)MVD進行了稀釋。但無論稀釋過程正確與否,原料均應(yīng)計算MVC而非MVD。

第二個常見問題是未根據(jù)限值L的單位進行合理的MVD計算。例如,某企業(yè)申報某注射液規(guī)格為20 mL:5 g(250 mg/ml),內(nèi)毒素限值為L=0.50 EU/mL,鱟試劑λ=0.125 EU/mL。申報材料將L的單位EU/mL轉(zhuǎn)化為了EU/mg,即L=0.50/250=0.002 EU/mg,又進而計算MVC=λ/L=0.125/0.002=62.5 mg/mL,再反過來推算MVD=250/62.5=4。但如前所述,僅供試品為注射用無菌粉末或原料藥時才進行MVC的計算。當(dāng)L以EU/mL表示時,c取1 mg/ml,可直接計算MVD=1×0.50/0.125=4。雖然兩種計算方法的稀釋倍數(shù)結(jié)果是一致的,但前者反映了申報方對MVD、MVC存在概念的理解差異和應(yīng)用錯誤。

3 細菌內(nèi)毒素檢查實驗材料的相關(guān)評審要點與常見問題

細菌內(nèi)毒素檢查法涉及的實驗材料包括細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、細菌內(nèi)毒素檢查用水、鱟試劑、溶劑、緩沖液或酸堿調(diào)節(jié)劑等。其中,細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品又分為國家標(biāo)準(zhǔn)品(RSE)和工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)。我國法定的國家標(biāo)準(zhǔn)品和工作標(biāo)準(zhǔn)品均由中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)和組織協(xié)作標(biāo)定賦值[7]。需要注意的是,我國與其他國家對內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的管理和使用有較大差別。例如,美國RSE由美國食品藥品監(jiān)督管理局(US Food and Drug Administration, FDA)生產(chǎn)并組織協(xié)作標(biāo)定賦值,CSE由鱟試劑生產(chǎn)廠家生產(chǎn)并根據(jù) RSE來標(biāo)定[8]。在進行細菌內(nèi)毒素檢查時,如果使用的是我國的鱟試劑,則應(yīng)選擇使用中國的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。如果使用的是進口鱟試劑,則應(yīng)按其要求使用對應(yīng)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),不宜交叉使用。

評審中最常見的問題是使用了非法定來源的工作標(biāo)準(zhǔn)品,例如我國國內(nèi)某些鱟試劑生產(chǎn)廠家亦可提供工作標(biāo)準(zhǔn)品,但申報材料中未對該工作標(biāo)準(zhǔn)品的賦值進行相應(yīng)標(biāo)定或確認。

第二個常見問題是選擇的鱟試劑靈敏度與內(nèi)毒素限值不匹配。例如,某注射液內(nèi)毒素限值L為0.2 EU/mL,則相應(yīng)鱟試劑靈敏度應(yīng)至少不低于對應(yīng)限值,可選擇λ=0.125 EU/mL甚至更高靈敏度的鱟試劑。但需要注意的是,鱟試劑的靈敏度并非越高越好,因為靈敏度越高意味著稀釋倍數(shù)的增加,也就意味著操作步驟和實驗用品消耗的增加,除了增加實驗成本外,還使得引入外源性內(nèi)毒素的風(fēng)險加大。

4 細菌內(nèi)毒素檢查實驗過程的相關(guān)評審要點與常見問題

新獸藥細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立,應(yīng)包括細菌內(nèi)毒素限值的確定、適宜靈敏度鱟試劑的選擇、MVD或MVC的計算、鱟試劑的靈敏度復(fù)核、供試品干擾試驗、產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素檢查等關(guān)鍵步驟。當(dāng)沒有相關(guān)研究資料可參考時,在進行干擾試驗之前,還需要設(shè)計干擾試驗預(yù)實驗,以預(yù)測供試品不產(chǎn)生干擾的濃度范圍[9]。按照《中國獸藥典》的相關(guān)要求,應(yīng)選擇至少兩個廠家的鱟試劑對至少三批產(chǎn)品進行干擾試驗。另外,需要注意的是,若無法排除供試品對細菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用或只能使用最高靈敏度鱟試劑(凝膠法 0.03 EU/mL,光度法0.001 EU/mL),則表明該產(chǎn)品不適宜采用常規(guī)方法進行細菌內(nèi)毒素檢查[10]。

評審中最常見的問題是缺少鱟試劑靈敏度復(fù)核資料,或干擾試驗的鱟試劑廠家數(shù)或產(chǎn)品批數(shù)不符合法規(guī)最低要求。

第二個常見問題是僅使用了最高靈敏度的鱟試劑,而未加以其他靈敏度鱟試劑實驗數(shù)據(jù)來佐證,尤其是在產(chǎn)品中存在β-葡聚糖等輔料干擾[11],或產(chǎn)品因pH值偏酸或偏堿等因素可能引起干擾時,評審員則有理由質(zhì)疑產(chǎn)品采用常規(guī)方法是否可充分排除干擾。

5 細菌內(nèi)毒素檢查質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)評審要點與常見問題

當(dāng)采用常規(guī)試劑和常規(guī)配制方法即可完成細菌內(nèi)毒素檢查時,相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)按照《中國獸藥典》格式表述,即“取本品,依法檢查(附錄1143),每1 mL(mg)**中含內(nèi)毒素的量不得過**”。但如果使用了特殊的溶劑、緩沖液或酸堿調(diào)節(jié)劑,或采用了特殊的供試品前處理方法,如萃取、離心等,則應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中注明。

評審中最常見的問題是方法驗證中所用試劑或前處理方法與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不一致。例如,某企業(yè)申報泰拉霉素注射液,方法驗證資料表明采用了特定配方的堿性調(diào)節(jié)劑方可消除干擾,但最終的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅按《中國獸藥典》常規(guī)格式表述。這種情況極易導(dǎo)致產(chǎn)品的注冊檢驗無法復(fù)現(xiàn)申報企業(yè)的檢驗結(jié)果,進而導(dǎo)致產(chǎn)品的退審。

第二個常見問題是在標(biāo)準(zhǔn)中僅注明所用試劑的廠家來源,但未注明試劑配制方法。這種情況在進口獸藥產(chǎn)品中最為常見。產(chǎn)品首次申報時,由申報企業(yè)提供相應(yīng)試劑,并不影響注冊檢驗。但在后續(xù)的監(jiān)督檢驗中,限制了試劑的采購來源,尤其是有些進口試劑難以采購,又沒有相應(yīng)配制方法,不利于對產(chǎn)品的質(zhì)量控制和監(jiān)督。

6 小 結(jié)

新獸藥細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立,應(yīng)從限值制定、試驗設(shè)計、試驗過程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂等多個環(huán)節(jié)進行規(guī)范。注冊資料中,限值制定應(yīng)詳細闡述計算過程或參考的標(biāo)準(zhǔn); MVD或MVC的計算,應(yīng)注意根據(jù)品種及限值的單位選擇適宜的計算公式;干擾試驗應(yīng)注意選擇法定的工作標(biāo)準(zhǔn)品和適宜靈敏度的鱟試劑,并排除樣品本身對測定的干擾;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂應(yīng)與驗證試驗內(nèi)容一致,涉及特殊試劑或處理方法應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)中加以說明。細菌內(nèi)毒素檢查全過程的規(guī)范與控制,為獸藥注射劑的安全可控奠定了基礎(chǔ)。