徐 嫄,彭國瑞,徐小艾,吳睿智,趙啟祖,朱元源,李 翠,王團(tuán)結(jié),鄒興啟,李 琰,劉業(yè)兵

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員,病毒粒子無囊膜,呈二十面體對稱結(jié)構(gòu),基因組為閉環(huán)單股DNA,直徑20 nm左右,是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。自20世紀(jì)80年代以來,由PCV2感染引發(fā)的“豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病”(porcine circovirus-associated disease,PCVAD/PCVD)對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重威脅,是影響全球生豬生長的重要經(jīng)濟(jì)問題之一[1-2]。PCVD的臨床表現(xiàn)包括PCV2系統(tǒng)性疾病(PCV2-SD),以前稱為仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS),和PCV2亞臨床感染(PCV2-SI)[3-5]。PCV2-SD嚴(yán)重感染的豬會有高病毒血癥、組織內(nèi)高滴度的病毒、淋巴組織的衰竭和肉芽腫性炎癥等表現(xiàn),并且常出現(xiàn)和其他病原體共感染的情況[6-7]。而PCV2-SI引發(fā)的非典型的臨床癥狀,也直接導(dǎo)致了生產(chǎn)性能降低[8-9]。

隨著越來越多的PCV2毒株被分離鑒定和基因分型方法的發(fā)展,PCV2出現(xiàn)了越來越多的基因型[10],其中,PCV2a、PCV2b、PCV2d先后成為流行于我國的優(yōu)勢基因型,并且PCV2d已在我國形成較大流行[11-13]。PCV2滅活疫苗的早期應(yīng)用對于預(yù)防和控制PCVD發(fā)揮了關(guān)鍵作用。隨后,PCV2基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗相繼研發(fā)成功并應(yīng)用。根據(jù)國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫顯示,目前PCV2疫苗產(chǎn)品的批準(zhǔn)文號近70個,生產(chǎn)企業(yè)40余家,涉及生產(chǎn)用PCV2毒株10余個[14],且已有5個國外商品化PCV2疫苗在我國取得了《進(jìn)口獸藥注冊證書》。面對田間PCV2流行毒株的變化,如何科學(xué)、務(wù)實(shí)地對眾多PCV2疫苗產(chǎn)品的效力與田間流行毒株的匹配程度進(jìn)行統(tǒng)一評價是具有挑戰(zhàn)性的工作。本文旨在對各種PCV2疫苗及其效力評價方法進(jìn)行比較研究,以期為探索統(tǒng)一的PCV2效力評價方法和標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 PCV2疫苗概況

1.1 PCV2疫苗種類 PCV2疫苗作為養(yǎng)豬行業(yè)防控PCVD的有效手段受到高度重視。由法國梅里亞公司研發(fā)的PCV2全病毒滅活疫苗Circovac于2006年上市;隨后,我國多個科研團(tuán)隊(duì)研發(fā)的PCV2滅活疫苗SH株、LG株、DBN-SX07株等陸續(xù)上市[15-17]。PCV2疫苗產(chǎn)品以傳統(tǒng)的滅活疫苗數(shù)量居多,包括單苗和聯(lián)苗,此外還包括,以PCV1為骨架嵌合PCV2 ORF2基因的嵌合體疫苗,通過大腸桿菌或桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)PCV2免疫原性蛋白Cap研發(fā)而成的亞單位疫苗,和按照抗原氨基酸序列人工方法合成保護(hù)性短肽而研制的合成肽疫苗。其中,亞單位疫苗已經(jīng)成為近幾年的研究熱點(diǎn),表達(dá)衣殼蛋白Cap的亞單位疫苗有較好的免疫原性和安全性,但生產(chǎn)成本較高。PCV2弱毒疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗目前均僅在實(shí)驗(yàn)室研究階段[18-20]。在2022年,我國PCV2疫苗的批簽發(fā)數(shù)量僅次于豬瘟疫苗和偽狂犬病疫苗,位居豬病毒類疫苗批簽發(fā)第三位,國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)超過40家,其中國產(chǎn)單苗和聯(lián)苗共20個,進(jìn)口疫苗產(chǎn)品5個,詳細(xì)見表1。

表1 我國已批準(zhǔn)使用的商品化PCV2相關(guān)疫苗Tab 1 Approved commercial PCV2 vaccines in China

1.2 毒株及基因型 隨著PCV2感染在全世界范圍內(nèi)的發(fā)生和流行,對各地PCV2毒株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究逐漸深入。根據(jù)對衣殼蛋白Cap基因的成對序列比較法,2008年提出PCV2基因型的定義,并且已鑒定的基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[21]。近些年的研究表明,新基因型的出現(xiàn)可能源于動物體內(nèi)感染的不同毒株間的重組,而現(xiàn)有的分類方法已不能適用所有PCV2毒株。我國流行毒株的基因型為PCV2a、PCV2b、PCV2d。目前國內(nèi)滅活疫苗PCV2毒株基因型包括PCV2a、PCV2b、PCV2d,并且疫苗毒株的數(shù)量隨著新產(chǎn)品的上市也在逐漸增加。

1.3 用法與用量 由于疫苗毒株、技術(shù)路線、抗原含量以及聯(lián)用情況的不同,各疫苗的用法與用量也存在差異,主要表現(xiàn)在以下兩方面。

1.3.1 仔豬首免日齡及是否需要加強(qiáng)免疫 首免日齡的選擇是權(quán)衡母源抗體水平與疫苗效力受其影響程度的結(jié)果,已批準(zhǔn)的疫苗中,有2/3選擇14～21日齡(2周齡)首免,其余選擇21日齡(3周齡)首免;而是否需要加強(qiáng)免疫則是權(quán)衡接種量(抗原含量)與預(yù)期效力及安全性(不良反應(yīng))的結(jié)果,已批準(zhǔn)的疫苗中,半數(shù)的國產(chǎn)疫苗接種量定為1 mL/頭的疫苗需要間隔2或3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫,接種量定為2 mL/頭的疫苗通常未作要求。進(jìn)口疫苗均是單次免疫。

1.3.2 成年豬的免疫程序 已批準(zhǔn)的疫苗中,部分疫苗明確寫明可用于成年母豬(后備、懷孕、經(jīng)產(chǎn))及種公豬,但免疫程序各有規(guī)定。對于成年母豬,通常要在配種前至分娩前的生產(chǎn)階段進(jìn)行多次免疫,目的是在保護(hù)母豬的同時為新生仔豬準(zhǔn)備充足的母源抗體;對于種公豬在內(nèi)的其他成年豬,通常要求根據(jù)疫苗免疫期定期免疫。

2 PCV2疫苗效力檢驗(yàn)方法比較分析

有效性是疫苗的一項(xiàng)重要評價指標(biāo),直接影響了疫病防控的效果。PCV2疫苗效力檢驗(yàn)方法包括體內(nèi)效力檢驗(yàn)法和體外效力檢驗(yàn)法。前者是通過免疫接種靶動物或替代靶動物的實(shí)驗(yàn)動物后,檢測其免疫攻毒保護(hù)率或誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價;后者則是不使用動物,通過生化或免疫學(xué)等方法檢測其中的抗原含量,以間接評價疫苗效力[22]。下文將對PCV2疫苗效力檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。

2.1 體內(nèi)效力檢驗(yàn)法

2.1.1 靶動物免疫攻毒法 靶動物免疫攻毒法是獸用疫苗最常用且最直觀的效力檢驗(yàn)方法。PCV2的易感動物是豬。對血清、鼻腔分泌物和糞便中的動態(tài)研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)豬在4～11周齡感染PCV2,感染母豬可通過胎盤感染胎兒,并通過呼吸道分泌物、初乳等傳染給哺乳仔豬[23-24]。受PCV2單一病原感染的豬往往僅出現(xiàn)亞臨床癥狀,早期病癥較為隱匿,較難呈現(xiàn)典型直觀的發(fā)病模型[25-26]。PCV2疫苗效力檢驗(yàn)用豬的日齡范圍最低至10日齡,最高至35日齡,不同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在檢驗(yàn)用豬日齡上的要求有所不同,最為常見的范圍是14～21日齡。免疫程序分為單次免疫和兩次免疫,免疫后2～5周進(jìn)行攻毒,攻毒前后是否有免疫刺激,依不同標(biāo)準(zhǔn)而定,目前進(jìn)口疫苗都無需該步操作。由于攻毒后發(fā)病溫和,發(fā)病的判定較為困難,因此標(biāo)準(zhǔn)中往往結(jié)合多項(xiàng)指標(biāo)綜合判定,主要包括體溫變化、相對日增重差異、免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測病毒抗原、DNA擴(kuò)增技術(shù)(polymerase chain reaction/ quantitative real-time polymerase chain reaction, PCR/qPCR)檢測血液或組織中的病毒抗原、間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)檢測組織中分離培養(yǎng)的病毒抗原等方法,進(jìn)行判定和評價。其中,病毒分離方法因操作復(fù)雜、耗時長,且受細(xì)胞敏感性的影響,可能導(dǎo)致病毒滴度降低,而影響檢測敏感度,國內(nèi)外都少有使用。國內(nèi)產(chǎn)品多以檢測病毒抗原、相對日增重和體溫變化綜合判定發(fā)病。進(jìn)口疫苗產(chǎn)品則多是在攻毒后以IHC和PCR/qPCR檢測病毒抗原,結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析進(jìn)行結(jié)果判定,各組動物數(shù)量往往不低于10只,較國內(nèi)各組動物5～6只多出至少一倍。

有超過一半的PCV2疫苗產(chǎn)品的抗原檢測使用PCR/qPCR。其中有多數(shù)疫苗產(chǎn)品使用普通PCR,僅有5個產(chǎn)品使用qPCR?；赥aqman探針的PCV2 的qPCR檢測方法的靈敏度約是普通PCR的100倍。IHC是幾乎所有產(chǎn)品都用到的抗原檢測技術(shù),IHC通過標(biāo)記的抗體或抗原對細(xì)胞相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測,經(jīng)過化學(xué)呈色反應(yīng),用顯微鏡或電子顯微鏡觀察結(jié)果。PCV2感染后的病理表現(xiàn)主要見于淋巴組織,應(yīng)用該方法檢測PCV2抗原采集的病料包括:腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、支氣管淋巴結(jié)和扁桃體等。IHC在PCV2-SD的個體診斷中發(fā)揮了重要作用,同時也要求實(shí)驗(yàn)人員熟練掌握組織病理學(xué)操作技術(shù)。

靶動物免疫攻毒法有以下幾方面值得注意。第一,選用靶動物免疫攻毒法進(jìn)行效力檢驗(yàn)的PCV2疫苗,需要使用各自質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的攻毒毒株進(jìn)行攻毒,所用攻毒毒株繁多且毒力強(qiáng)弱有別,從而導(dǎo)致發(fā)病模型存在差別;第二,尚未統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用豬,因日齡和健康背景不同,產(chǎn)生的免疫應(yīng)答存在差異,也是導(dǎo)致發(fā)病模型差異的原因;第三,目前的發(fā)病判定方法較多且尚未統(tǒng)一,尚未科學(xué)地比較方法的優(yōu)劣。可見,目前評價PCV2疫苗效力的靶動物免疫攻毒法無法對眾多疫苗進(jìn)行統(tǒng)一的效力評價和比較。此外,隨著PCV2疫苗臨床接種率的逐年上升和其他感染因素的存在,篩選雙陰性仔豬的難度也隨之增大。

2.1.2 小鼠免疫攻毒法 小鼠是應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動物,研究表明,PCV2可以人工感染Balb/c小鼠、C57BL/6小鼠、C3H/HeJ小鼠、ICR小鼠等嚙齒動物,小鼠作為PCV2感染的動物模型,已用于病毒與宿主相互作用研究、疫苗效力評估、抗病毒藥物和疫苗佐劑的評估[27]。吳佳鑫[28]對6～8周齡SPF級Balb/c小鼠進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)研究,攻毒后第三天,應(yīng)用qPCR方法可在小鼠多個臟器組織中檢測出病毒,試驗(yàn)疫苗可對小鼠提供一定的保護(hù)。目前僅有一個國內(nèi)產(chǎn)品的效力檢驗(yàn)同時涉及仔豬免疫攻毒法和小鼠免疫攻毒法,通過采集組織,進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),比較免疫組和對照組的病毒分離結(jié)果來評價免疫效果。用易感的小型實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行免疫攻毒效力檢驗(yàn)?zāi)軌蚪档蜋z驗(yàn)成本和操作難度,但因物種差異,可能導(dǎo)致與靶動物免疫攻毒評價結(jié)果不一致,故需要經(jīng)過大量試驗(yàn)驗(yàn)證兩者的平行關(guān)系。

2.1.3 血清學(xué)檢驗(yàn)法 血清學(xué)檢驗(yàn)法屬于體內(nèi)效力檢驗(yàn)方法,國內(nèi)外PCV2疫苗產(chǎn)品多有應(yīng)用該方法評價疫苗的免疫效果,使用的動物同樣是雙陰性健康仔豬和Balb/c小鼠。接種疫苗2～3周后,產(chǎn)生針對PCV2的特異性免疫應(yīng)答,血清中的特異性抗體水平能夠反應(yīng)疫苗的保護(hù)效果。PCV2疫苗中,涉及血清學(xué)效力評價方法的產(chǎn)品占到半數(shù)以上,其中三分之一使用小鼠免疫試驗(yàn),不同產(chǎn)品的免疫程序和采血時間存在差異,判定方法和標(biāo)準(zhǔn)也不一致。

通過對免疫動物的血清抗體效價進(jìn)行檢測,評價疫苗的保護(hù)效果,使用最多的檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),其次是免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(immunoperoxidse monolayer cell assay,IPMA)和間接免疫熒光檢測,后兩種方法需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),耗時較長,對人員操作水平要求較高。ELISA是檢測血清中抗體水平的常用方法,目前國內(nèi)已有商品化豬PCV2抗體檢測試劑盒,吳華偉[29]曾對5種試劑盒進(jìn)行評價,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)品在敏感性和符合率上的差別較大。ELISA方法對試劑盒質(zhì)量提出了更高的要求。

2.2 體外效力檢驗(yàn)法

2.2.1 相對效力法 相對效力法即參考疫苗法,基于量反應(yīng)平行線測定法和ELISA原理,將被檢疫苗與已經(jīng)檢驗(yàn)合格或經(jīng)靶動物免疫攻毒試驗(yàn)證明效力合格的參考疫苗同時進(jìn)行檢測,檢驗(yàn)結(jié)果成立時,通過軟件計(jì)算被檢疫苗的相對效力值,每次檢測樣品時不需要重復(fù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[30]。該方法是一種操作簡單,省時高效的替代方法。近三分之一的PCV2疫苗使用了相對效力法。參考疫苗在其中尤為關(guān)鍵,只有制備出質(zhì)量可靠的參考疫苗才能對樣品進(jìn)行有效評價。近年來對該方法的應(yīng)用逐漸增多。參考疫苗作為標(biāo)尺必須確保其具有優(yōu)秀的保護(hù)力和穩(wěn)定性,并且與免疫攻毒法具有高度相關(guān)性。目前,不同疫苗的效力檢驗(yàn)使用的參考疫苗都由各研發(fā)單位制備,尚無通用性參考疫苗,因此該方法無法客觀統(tǒng)一地對產(chǎn)品進(jìn)行比較[31]。

2.2.2 抗原含量測定法 疫苗中抗原含量的高低直接影響到疫苗的免疫效果。目前的PCV2疫苗產(chǎn)品中分別有一個滅活疫苗和一個亞單位疫苗對抗原含量進(jìn)行測定,測定方法包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法、BCA蛋白含量檢測法和夾心ELISA法。瓊擴(kuò)法的結(jié)果受多種因素影響,對抗原的定量而言準(zhǔn)確性較差。其他兩種方法結(jié)果的準(zhǔn)確性也同樣受試劑質(zhì)量影響。隨著分離純化技術(shù)的發(fā)展,色譜技術(shù)越來越多地被用于獸用生物制品的質(zhì)量控制,應(yīng)用高效體積排阻色譜技術(shù)(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)檢測PCV2疫苗中抗原含量的方法已初步建立,但由于疫苗的研發(fā)工藝不同,疫苗中成分復(fù)雜等因素,想要建立通用的抗原含量測定方法尚需要大量的研究工作[32]。

3 討論與展望

PCV2對豬群健康造成了持續(xù)且廣泛的影響,接種疫苗是目前最有效的防控措施。隨著病毒流行趨勢的復(fù)雜多變、研發(fā)技術(shù)的革新以及使用者對疫苗效果的更高期待,新型疫苗產(chǎn)品層出不窮,從而增大了對該類產(chǎn)品的質(zhì)量評價和監(jiān)管難度。

從廣義上講,效力評價是伴隨疫苗全生命周期的、重復(fù)而漸進(jìn)的、最為關(guān)鍵的事件之一,包括研發(fā)早期探索階段的概念驗(yàn)證(proof-of-concept,POC)效力評價、以申報(bào)注冊為目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)室和臨床效力評價、申報(bào)注冊過程中必要的第三方或官方效力評價(臨床驗(yàn)證或復(fù)核檢驗(yàn))、完成上市許可之后的出廠檢驗(yàn)效力評價以及客戶或官方要求的準(zhǔn)入或監(jiān)督效力評價。就單一產(chǎn)品而言,其效力評價方法在上述演變過程中,應(yīng)當(dāng)遵從化繁為簡、深入淺出的原則;尤其是完成上市許可之后的效力評價,應(yīng)以穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝和符合良好生產(chǎn)管理規(guī)范(good manufacturing practice, GMP)的生產(chǎn)過程為基石,科學(xué)、客觀、精準(zhǔn)地反映產(chǎn)品的預(yù)期保護(hù)力,而這正是本文所關(guān)注的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的效力評價方法。由于病原及疫病的特殊性,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用健康靶動物進(jìn)行“攻毒造病”難免會因?yàn)樯镌匆蛩?實(shí)驗(yàn)動物個體及批次差異)、攻毒材料因素(來源、毒力差異)以及人源因素(操作、判定差異)等,而極易出現(xiàn)偏差、甚至不可重復(fù)。就PCV2及其造成的PCVD而言,病原在不同年齡段靶動物中展現(xiàn)的毒力差異明顯,各強(qiáng)毒力毒株在同一年齡段靶動物中展現(xiàn)的毒力也難言一致,且在臨床環(huán)境變化及高強(qiáng)度免疫壓力下,流行毒株也隨之演變,所帶來的是更多的亞臨床感染和癥狀,給疫病防控帶來壓力的同時,也提升了效力評價的難度。

實(shí)現(xiàn)對眾多PCV2疫苗產(chǎn)品進(jìn)行統(tǒng)一的效力評價,是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的工作。體內(nèi)效力檢驗(yàn)靶動物免疫攻毒法是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的方法,但在靶動物篩選標(biāo)準(zhǔn)、發(fā)病指標(biāo)、保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)、攻毒毒株及免疫攻毒程序等關(guān)鍵方面,各疫苗廠家均制定了“專屬”標(biāo)準(zhǔn),若要統(tǒng)一建立通用于所有疫苗的體內(nèi)效力檢驗(yàn)方法,需開展包括通用靶動物篩選及供應(yīng)保障,通用攻毒毒株流調(diào)、篩選、建庫及更新判定,通用免疫攻毒程序、發(fā)病及保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)探索性實(shí)驗(yàn),以及方法學(xué)驗(yàn)證等大量研究工作,要求巨大的人力、物力、財(cái)力投入,但預(yù)期結(jié)果的不確定性極高。相對而言,體外效力檢驗(yàn)方法不涉及標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)苛的檢驗(yàn)用動物以及繁冗復(fù)雜的免疫和/或攻毒操作、觀察、取樣及檢測,影響變量更少、可控性更高、檢驗(yàn)成本更低且符合3R原則。在眾多PCV2疫苗中,體外效力檢驗(yàn)相對效力法通常作為效力檢驗(yàn)的“二選其一”之方法,但各產(chǎn)品的“專屬”方法仍然各異,若能夠開發(fā)研制通用參考疫苗及配套檢驗(yàn)用抗體和試劑,統(tǒng)一“度量用尺”,進(jìn)而制定各個疫苗的相對效力合格限值,可有望間接實(shí)現(xiàn)疫苗效力的統(tǒng)一評價;而體外效力檢驗(yàn)抗原含量測定法也有望成為直接實(shí)現(xiàn)疫苗效力統(tǒng)一評價的潛在方法,通過制備標(biāo)準(zhǔn)抗原,不論使用ELISA還是色譜技術(shù),均可以實(shí)現(xiàn)抗原含量的精準(zhǔn)測定,但是,如何通過科學(xué)合理的前處理,最大程度保留不同成品疫苗中的抗原,以滿足體外效力檢驗(yàn)上樣要求,需開展大量的交叉學(xué)科探索研究,這是監(jiān)管機(jī)構(gòu)與生產(chǎn)企業(yè)攜手共進(jìn)、雙向奔赴之方向。