李正興，徐景峨，潘 永，李 婷，吳 仙，沈如勇，李茂錦，楊 莉，韓 雪

1.貴州省畢節(jié)市納雍縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州納雍 553399；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,貴州貴陽(yáng) 550005；3.貴州錦屏生態(tài)鵝業(yè)發(fā)展有限公司,貴州錦屏 556700

為了解錦屏縣某規(guī)?；Z場(chǎng)致病菌的流行狀況和耐藥規(guī)律，采集15 只病死雛鵝的不同組織樣本，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR 檢測(cè)、藥敏試驗(yàn)和耐藥基因篩查。結(jié)果分離得到13 株大腸桿菌、6株沙門氏菌、4 株鴨疫里默氏桿菌；12 株大腸桿菌和6 株沙門氏菌為多重耐藥菌，對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑啉等14 種抗生素耐藥；鴨疫里默氏桿菌對(duì)克林霉素、紅霉素、多粘菌素B、環(huán)丙沙星的耐藥率均為100%；floR 基因檢出率，大腸桿菌為76.92%，沙門氏菌和鴨疫里默氏桿菌為100%；大腸桿菌blaCTX-M-1G 基因檢出率為61.53%，沙門氏菌blaCTX-M-9G 基因檢出率為83.33%。綜上所述，這些鵝源分離菌株大多為多重耐藥菌。

近年來，隨著養(yǎng)鵝業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，危害鵝的疾病逐漸增多。其中，鵝常見細(xì)菌病如鵝出血性敗血癥、鵝沙門氏菌病、鵝漿膜炎等對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失[1]。鵝細(xì)菌病的治療使得抗生素被大量使用，進(jìn)而導(dǎo)致許多致病菌菌株產(chǎn)生多重耐藥，常見的大腸桿菌、沙門菌等的耐藥最為嚴(yán)重[2]。本研究對(duì)錦屏縣某規(guī)?；Z場(chǎng)分離的大腸桿菌、沙門氏菌和鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行耐藥性分析和耐藥基因檢測(cè)初步研究，探明了該鵝場(chǎng)細(xì)菌的耐藥情況，并為該鵝場(chǎng)臨床合理用藥提供了科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品

2023 年4 月，來源于錦屏縣某規(guī)?；Z場(chǎng)的15 只病死雛鵝。大腸桿菌ATCC 25922 株保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑及引物

主要試劑包括藥敏紙片、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、DL2000 DNA marker、Taq DNA 聚合酶。

引物設(shè)計(jì)參照GeneBank 中相關(guān)耐藥基因序列，利用軟件設(shè)計(jì)耐藥基因引物。以大腸桿菌Pho A 基因、沙門氏菌Inv A 基因和鴨疫里氏桿菌ompA 基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)特異性鑒定引物。引物序列送至上海生工生物有限公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離純化

無菌條件下將病死鵝的肝、腦組織接種于10%犢牛血清瓊脂平板，37℃有氧和燭缸條件下培養(yǎng)16 ～24h。觀察菌落形態(tài)特征，并挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化。對(duì)疑似大腸桿菌的菌落進(jìn)行麥康凱瓊脂平板接種，并對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。

1.4 菌株的分子鑒定

提取細(xì)菌的基因組DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。分別利用大腸桿菌pho A 基因、沙門氏菌inv A 基因和鴨疫里氏桿菌ompA 基因特異性引物鑒定所分離菌株。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠顯像分析技術(shù)分析拍照，將陽(yáng)性樣品送往生工生物有限公司測(cè)序。

1.5 藥敏試驗(yàn)

以K-B 法開展菌株的藥物敏感性試驗(yàn)。將經(jīng)鑒定的大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌接種于相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行活化，以0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊募兣囵B(yǎng)物涂布于培養(yǎng)基上，等待數(shù)分鐘后將藥敏紙片貼上，經(jīng)過18h 的培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈尺寸，并以大腸桿菌ATCC25922 作質(zhì)控菌株。根據(jù)NCCLS藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對(duì)應(yīng)藥物的敏感度。

1.6 檢測(cè)耐藥基因

通過PCR 試驗(yàn)檢測(cè)分離菌株的耐藥基因。擴(kuò)增體系(25μL)為: DNA 模板1μL，上、下游引物各1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，無菌水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性3min；94℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀上觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌生長(zhǎng)情況

在10%犢牛血清瓊脂平板上共分離到來源于病死雛鵝肝和腦且形態(tài)不同的3 種菌株共23 株，其中：13 株來源于鵝肝的菌株在瓊脂平板上長(zhǎng)出圓形、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、隆起、直徑為 1 ～3mm的灰白色菌落，麥康凱瓊脂平板上呈紅色或粉紅色菌落。6 株來源于鵝肝的菌株呈乳白色、圓形、隆起且光滑，直徑達(dá)2mm。4 株來源于鵝腦的菌株在燭缸條件下培養(yǎng)獲得，平板上呈表面光滑、濕潤(rùn)、透明、露珠狀小的菌落。革蘭氏染色結(jié)果顯示，23 株分離菌株均為革蘭氏陰性桿菌。

2.2 菌株的分子鑒定結(jié)果

分離的23 株菌株經(jīng)基因特異性PCR 擴(kuò)增及測(cè)序后，擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果中，13 株菌的目的條帶大小及測(cè)序結(jié)果與大腸桿菌Pho A 基因相符，6 株菌的目的條帶大小及測(cè)序結(jié)果與沙門氏菌Inv A 基因相符，4 株菌的目的條帶大小及測(cè)序結(jié)果與鴨疫里氏桿菌ompA 基因基因相符。結(jié)果共分離鑒定大腸桿菌13 株，沙門氏菌6 株，鴨疫里氏桿菌4 株。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表1 所示，13 株大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、克林霉素、多黏菌素B、紅霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素的耐藥率均達(dá)到了100%。6 株沙門氏菌除頭孢西丁和四環(huán)素外，對(duì)其余13 種抗生素耐藥率均達(dá)100%。4 株鴨疫里默氏桿菌對(duì)克林霉素、多黏菌素B、紅霉素的耐藥率均達(dá)到了100%。該規(guī)?；Z場(chǎng)分離出的23 株菌對(duì)所檢測(cè)15 種抗生素?zé)o一株完全敏感，其中大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類具有普遍的耐藥性，臨床上應(yīng)減少使用，僅對(duì)頭孢西丁具有較強(qiáng)敏感性。此次分離的大腸桿菌和沙門氏菌菌株的多重耐藥性較高，應(yīng)引起養(yǎng)殖場(chǎng)的重視。

表1 23 株雛鵝細(xì)菌分離株對(duì)不同藥物的敏感性比例

2.4 耐藥基因的PCR 擴(kuò)增

通過普通PCR 試驗(yàn)檢測(cè)23 株臨床分離菌株所攜帶的耐藥基因。如表2 所示，13 株大腸桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(76.92%)，其次是β-內(nèi)酰胺酶類的blaCTX-M-1G 基因（61.53%）。6 株沙門氏菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是β-內(nèi)酰胺酶類的blaCTX-M-9G 基因，氨基糖苷類的aadA1 基因和氯霉素類的cmlA、cmlB 基因，檢出率均為83.33%。4 株鴨疫里默氏桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是氨基糖苷類的aadA11 基因和喹諾酮類的qnrS基因，檢出率均為25%。與藥敏試驗(yàn)表型對(duì)比發(fā)現(xiàn)，攜帶floR 基因的10 株大腸桿菌全部對(duì)氯霉素具有耐藥性；攜帶blaCTX-M-1G 基因的8 株大腸桿菌對(duì)頭孢菌素類藥物具有耐藥性。攜帶floR基因的6 株沙門菌全部對(duì)氯霉素具有耐藥性；攜帶blaCTX-M-9G 基因的5 株沙門菌全部對(duì)頭孢菌素類藥物具有耐藥性；攜帶aadA1 基因的5 株沙門菌全部對(duì)氨基糖苷類藥物具有耐藥性；攜帶cmlA、cmlB 基因的5 株沙門菌全部對(duì)氯霉素類藥物具有耐藥性。攜帶floR 基因的4 株鴨疫里默氏桿菌僅有1 株對(duì)氯霉素具有耐藥性；攜帶aadA1基因和qnrS 基因的1 株鴨疫里默氏桿菌對(duì)氨基糖苷類和喹諾酮類藥物無耐藥性。以上結(jié)果表明，這些耐藥基因與菌株抗生素耐藥表型相關(guān)，但值得注意的是鴨疫里默氏桿菌中出現(xiàn)攜帶耐藥基因與耐藥表型不一致的現(xiàn)象，鴨疫里默氏桿菌中的這些耐藥基因是否存在獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制，需要進(jìn)一步探究。

表2 23 株雛鵝細(xì)菌分離株耐藥基因檢出率

3 討論

當(dāng)前，超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)威脅著全球公共衛(wèi)生安全，每年因細(xì)菌耐藥而死亡的人數(shù)均很高。而抗生素濫用是造成這一問題的主要原因。有相關(guān)報(bào)道表明，過去養(yǎng)殖業(yè)普遍在飼料當(dāng)中添加抗生素，目的是促進(jìn)生長(zhǎng)并抵御細(xì)菌病的侵襲，盡管目前國(guó)內(nèi)外均出臺(tái)了減抗替抗相關(guān)政策，但細(xì)菌耐藥的問題在短時(shí)間內(nèi)可能難以解決，解析耐藥機(jī)制對(duì)未來耐藥菌的防治策略的制定具有積極意義。細(xì)菌有多種不同的耐藥機(jī)制，其攜帶的耐藥基因發(fā)揮重要作用。因此，本試驗(yàn)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)了部分耐藥基因，結(jié)果顯示，13 株大腸桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(76.92%)，其次是β-內(nèi)酰胺酶類的blaCTX-M-1G 基因（61.53%）。6 株沙門氏菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是β-內(nèi)酰胺酶類的blaCTX-M-9G 基因，氨基糖苷類的aadA1 基因和氯霉素類的cmlA、cmlB 基因，檢出率均為83.33%。4 株鴨疫里默氏桿菌中檢出率最高的為氯霉素類的floR 基因(100%)，其次是氨基糖苷類的aadA11 基因和喹諾酮類的qnrS 基因，檢出率均為25%。另外，鴨疫里默氏桿菌中耐藥基因陽(yáng)性菌株與藥敏試驗(yàn)表型不一致，提示可能存在未知的鴨疫里默氏桿菌中耐藥基因調(diào)控機(jī)制。

本研究揭示了該鵝場(chǎng)大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌抗生素耐藥情況，分離菌對(duì)常用藥物耐藥突出，呈現(xiàn)多重耐藥性特點(diǎn)，為鵝場(chǎng)細(xì)菌病的預(yù)防與治療用藥提供了參考依據(jù)。