白倩倩 林志淼

1北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科,北京市皮膚病分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京,100034;2南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東廣州,510091

神經(jīng)纖維瘤病是一類累及多系統(tǒng)的腫瘤易感性單基因遺傳病,主要分為1型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1;以下斜體NF1代表基因,NF1代表1型神經(jīng)纖維瘤病)和2型神經(jīng)纖維瘤病。其中NF1是一種相對(duì)常見(jiàn)的遺傳病,其患病率高達(dá)三千到四千分之一[1］。NF1的診斷標(biāo)準(zhǔn)最初在1987年提出[2］,強(qiáng)調(diào)臨床表現(xiàn)但未將基因檢測(cè)納入診斷標(biāo)準(zhǔn)。2021年,NF1診斷標(biāo)準(zhǔn)修訂版發(fā)布,增加了遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果作為主要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[3］。節(jié)段型NF1(segmental NF1,sNF1)是NF1在胚胎時(shí)期基因發(fā)生鑲嵌突變所致,是一種相對(duì)輕型的NF1,臨床表現(xiàn)為受累部位身體或者組織出現(xiàn)NF1疾病改變。sNF1缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),因表現(xiàn)較輕,往往不符合上述NF1診斷標(biāo)準(zhǔn),確診較為困難,因此診斷sNF1非常依賴于基因檢測(cè)結(jié)果。同時(shí),sNF1有一定遺傳性,且遺傳子代會(huì)出現(xiàn)NF1而非sNF1,因此需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷來(lái)避免疾病遺傳。而產(chǎn)前診斷同樣依賴于sNF1患者前期的基因檢測(cè)結(jié)果。我們報(bào)道兩例sNF1基因檢測(cè)過(guò)程和產(chǎn)前診斷結(jié)果,為臨床醫(yī)生診斷sNF1并進(jìn)行遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者1,女,32歲,出生后左側(cè)軀干及左上臂出現(xiàn)2處牛奶咖啡斑,之后咖啡斑及雀斑逐漸增多但主要局限于左軀干及左上肢(圖1a)?；颊咦?3歲左右開(kāi)始于左側(cè)背部出現(xiàn)粉紅色質(zhì)軟瘤體。因近期計(jì)劃備孕就診于我院。

患者1背部出現(xiàn)多發(fā)色斑,主要局限于左側(cè)(1a),方框內(nèi)標(biāo)記的神經(jīng)纖維瘤用于后續(xù)突變篩查;患者2分別在左胸部(1b)和頸部(1c)出現(xiàn)兩個(gè)孤立的神經(jīng)纖維瘤;患者2僅在右側(cè)腋窩出現(xiàn)多個(gè)牛奶咖啡斑(1d),左側(cè)未發(fā)現(xiàn)(1e)

患者2,女,28歲,患者出生后全身出現(xiàn)多處牛奶咖啡斑,隨年齡增長(zhǎng)增多,5歲左右開(kāi)始出現(xiàn)腋窩雀斑,但僅累及右側(cè)腋窩。15歲開(kāi)始軀干、四肢逐漸出現(xiàn)散在膚色至粉紅色皮膚腫物(圖1b～1e),質(zhì)軟?；颊咭蛏?就診于我院并進(jìn)行遺傳咨詢。

患者1和2均否認(rèn)疾病家族史或其他疾病史。患者1曾于外院抽血進(jìn)行基因檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)NF1或者其他咖啡斑相關(guān)基因致病性突變。

1.2 方法

1.2.1 外周靜脈血DNA提取 征得患者同意后,分別采集兩例患者外周靜脈血4 mL(2%乙二胺四乙酸抗凝),采用常規(guī)方法提取基因組DNA。

1.2.2 皮膚組織DNA提取 分別取兩例患者皮膚瘤體,每人取兩處皮膚神經(jīng)纖維瘤瘤體,置于0.25% Dispase 2中4℃消化過(guò)夜,分離其表真皮,分別提取表皮及真皮組織DNA,檢測(cè)提取DNA純度和濃度。

1.2.3 高通量基因測(cè)序 分別取兩例患者一處皮損的真皮側(cè)基因組DNA 3 μg為模板,采用覆蓋NF1、NF2、SPRED1基因全長(zhǎng)的芯片進(jìn)行二代測(cè)序,平均測(cè)序深度超過(guò)2000X。檢測(cè)在北京邁基諾基因測(cè)序公司完成,使用IlluminaHiseq2000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行突變檢測(cè)。針對(duì)測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù),我們僅挑選NF1基因中非同義突變或者剪切位點(diǎn)突變,同時(shí)突變基因型測(cè)序深度大于10,突變比例超過(guò)1%的變異位點(diǎn)。

1.2.4 一代測(cè)序驗(yàn)證 根據(jù)高通量測(cè)序所檢測(cè)到的可疑致病性變異位點(diǎn),涉及針對(duì)變異位點(diǎn)的NF1基因序列引物(用Primer-BLAST在線設(shè)計(jì)),擴(kuò)增患者兩處皮損表、真皮及外周血基因組DNA,進(jìn)行Sanger測(cè)序。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,1.5%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后于北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用Bioedit軟件分析,比對(duì)高通量測(cè)序所發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)。

1.2.5 絨毛膜穿刺及檢測(cè) 兩例患者均于孕12周進(jìn)行胎兒絨毛膜穿刺,取1～2根絨毛膜,常規(guī)方法提取胎兒絨毛膜基因組DNA,根據(jù)1.2.4確定的NF1基因胚胎期鑲嵌突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序,確定是否遺傳患者致病性變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 高通量基因測(cè)序結(jié)果 我們?cè)趦衫颊叩恼嫫そM織高通量測(cè)序結(jié)果中各自發(fā)現(xiàn)兩個(gè)NF1基因突變位點(diǎn),即患者1的皮膚瘤體高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)NF1基因的c.1007G>A(p.Trp336*,轉(zhuǎn)錄本NM_000267,下同,突變比例為30%),以及c.7168_7169del(p.Arg2390Asnfs*10,突變比例為29%)突變;患者2的皮膚瘤體高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)NF1基因的c.1885G>A(p.Gly629Arg,突變比例為25%),以及c.7205delA(p.His2402Profs*9,突變比例為17%)突變。

2.2 一代測(cè)序檢測(cè)測(cè)序結(jié)果 根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果,分別對(duì)患者1的兩處皮損組織和血液系統(tǒng)DNA進(jìn)行NF1基因的c.1007G>A和c.7168_7169del突變位點(diǎn)一代測(cè)序檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF1基因c.1007G>A在皮損的真皮DNA中均能檢測(cè)到突變峰(圖2a),而血液和表皮未檢測(cè)出該突變峰(圖2b),提示NF1基因c.1007G>A為患者1胚胎時(shí)期發(fā)生的鑲嵌突變,也是導(dǎo)致患者1的sNF1的主要致病性突變;患者1的NF1基因c.7168_7169del僅在一處皮損真皮組織DNA中檢測(cè)到突變峰,其他組織DNA均未查到突變峰,提示該變異位點(diǎn)為神經(jīng)纖維瘤體隨機(jī)發(fā)生的“二次打擊”的體細(xì)胞突變,非胚胎時(shí)期鑲嵌突變。同樣方法我們對(duì)患者2的兩處皮損組織和血液系統(tǒng)DNA進(jìn)行NF1基因的c.1885G>A及c.7205delA一代測(cè)序檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF1基因c.1885G>A在患者2的兩處瘤體及血液DNA均檢測(cè)到突變峰(圖2c、2d),提示該變異位點(diǎn)為患者2胚胎時(shí)期發(fā)生的鑲嵌突變,是患者2的sNF1的致病性突變;而NF1基因c.7205delA僅存在于一處瘤體的真皮DNA中,因此為該瘤體隨機(jī)發(fā)生的“二次打擊”。至此,確定患者1的NF1基因c.1007G>A和患者2的NF1基因c.1885G>A為兩例患者進(jìn)行產(chǎn)前診斷需要檢測(cè)的位點(diǎn)。

患者1的兩個(gè)神經(jīng)纖維瘤體中均檢測(cè)到NF1鑲嵌突變c.1007G>A(2a),而其血液樣本中未檢測(cè)到該突變(2b);患者2的兩個(gè)獨(dú)立神經(jīng)纖維瘤組織DNA和血液DNA樣本中均可檢測(cè)到NF1鑲嵌突變c.1885G>A(2c、2d)

2.3 絨毛膜基因測(cè)序結(jié)果 分別對(duì)患者1胎兒絨毛膜基因組DNA進(jìn)行NF1基因c.1007G>A位點(diǎn)及患者2胎兒絨毛膜基因組DNA進(jìn)行NF1基因c.1885G>A位點(diǎn)一代測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎兒絨毛膜均不存在相應(yīng)致病性位點(diǎn)(圖3)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,判斷兩個(gè)胎兒均未遺傳到母親NF1基因致病性突變位點(diǎn)。分娩后隨訪至1歲,未發(fā)現(xiàn)可疑牛奶咖啡斑或者其他神經(jīng)纖維瘤病臨床表現(xiàn);同時(shí)對(duì)兩位嬰兒采集外周血進(jìn)行母親相應(yīng)NF1基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩位嬰兒均不存在母親的NF1基因突變。

患者1胎兒(3a)和患者2胎兒(3b)絨毛膜組織DNA中均不攜帶母體鑲嵌突變

3 討論

NF1最早被分為七種類型,而sNF1屬于七種的第5型,且被定義為“咖啡斑和/或多發(fā)雀斑,以及神經(jīng)纖維瘤體聚集分布于身體一側(cè),并且不跨越身體中線分布”[4］。既往認(rèn)為,sNF1的患病率較低,可能只有NF1發(fā)生率的十到二十分之一,是一種罕見(jiàn)的NF1亞型[5,6］。然而,這些傳統(tǒng)的認(rèn)識(shí)可能存在一定偏頗。根據(jù)筆者的門診經(jīng)驗(yàn)(筆者長(zhǎng)期在遺傳性皮膚病門診),sNF1的發(fā)生率可能遠(yuǎn)高于NF1;不少研究者也認(rèn)為sNF1的患病率很可能被明顯低估[7］。同時(shí),sNF1定義為不跨越中線分布并不準(zhǔn)確,正如本文中的患者2,咖啡斑、雀斑以及皮膚瘤體分布于身體兩側(cè),屬于跨身體中線分布的大面積sNF1。因此,實(shí)際上,sNF1更應(yīng)該從病因?qū)W上進(jìn)行診斷,將其命名為“鑲嵌型1型神經(jīng)纖維瘤病”可能更為妥當(dāng)[8］,這樣可以避免廣泛皮損分布的sNF1出現(xiàn)診斷困境。

sNF1的臨床表現(xiàn)差異較大,有學(xué)者根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為四種亞型,即：1型,僅有色素改變;2型,色素改變伴神經(jīng)纖維瘤;3型,僅有神經(jīng)纖維瘤;4型,僅有叢狀神經(jīng)纖維瘤[5］。盡管該分類方式不能涵蓋所有sNF1的類型,但是該分類提示sNF1臨床表現(xiàn)差異較大,現(xiàn)有的NF1的診斷標(biāo)準(zhǔn)可能無(wú)法用于sNF1的診斷。有學(xué)者總結(jié)了17例鑲嵌型NF1患者的臨床表現(xiàn),發(fā)現(xiàn)這些患者普遍被確診的年齡較晚(平均37歲),并且有不少患者出現(xiàn)NF1的嚴(yán)重臨床表現(xiàn),比如叢狀神經(jīng)纖維瘤、脊柱側(cè)彎、高血壓、自閉癥等[9］。sNF1的平均診斷年齡較晚,推測(cè)可能是由于sNF1的疾病表現(xiàn)通常較輕,晚發(fā),或者不典型,致使許多sNF1患者表現(xiàn)達(dá)不到神經(jīng)纖維瘤病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此,sNF1的早期診斷十分依賴于基因檢測(cè)。由于sNF1的發(fā)病原因是胚胎時(shí)期NF1基因合子后突變(postzygotic mutation)導(dǎo)致的,不同于胚系突變(germline mutation),因此抽血有可能無(wú)法查到NF1基因突變。因此,若要進(jìn)行sNF1基因診斷,首先需要確定患者基因組DNA的標(biāo)本來(lái)源。從皮膚科角度出發(fā),最適合的取樣標(biāo)本應(yīng)該是神經(jīng)纖維瘤病兩種常見(jiàn)臨床表現(xiàn),即牛奶咖啡斑和皮膚神經(jīng)纖維瘤體。值得注意的是,根據(jù)腫瘤發(fā)生的“二次打擊”理論[10］,皮膚神經(jīng)纖維瘤作為良性腫瘤,是存在NF1基因的二次打擊突變的,即每個(gè)皮膚神經(jīng)纖維瘤體存在一個(gè)胚胎時(shí)期的合子后的NF1基因突變,以及一個(gè)隨機(jī)發(fā)生的“二次打擊”的NF1基因突變[11］。有意思的是,有研究證明,神經(jīng)纖維瘤病的牛奶咖啡斑的黑素細(xì)胞同樣存在NF1基因的二次打擊突變[12］。然而,如果sNF1患者已經(jīng)出現(xiàn)瘤體,選擇皮膚神經(jīng)纖維瘤體可能比選擇咖啡斑更佳,因?yàn)槠つw神經(jīng)纖維瘤體病變組織富集,NF1基因突變檢出率很可能遠(yuǎn)高于只有黑素細(xì)胞受累的牛奶咖啡斑。

由于sNF1患者的NF1突變有可能會(huì)累及性腺[13］。一旦性腺被NF1基因突變累及,就有可能遺傳給子代。這種情況下,sNF1患者的子代將出現(xiàn)NF1基因的胚系突變,導(dǎo)致比親本更嚴(yán)重的全身型NF1。因此,sNF1患者在孕期需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷避免疾病遺傳。由于技術(shù)上而言,女性患者無(wú)法取生殖細(xì)胞進(jìn)行NF1基因鑲嵌突變?cè)u(píng)估遺傳風(fēng)險(xiǎn),因此建議sNF1女性患者常規(guī)對(duì)每個(gè)子代進(jìn)行產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷需要先確定sNF1患者的胚胎時(shí)期NF1基因合子后突變(鑲嵌突變)方能進(jìn)行精確產(chǎn)前診斷。由于二次打擊原因,取sNF1患者單一神經(jīng)纖維瘤體可能檢測(cè)出兩個(gè)NF1基因突變位點(diǎn),因此應(yīng)該取兩處不同瘤體進(jìn)行檢測(cè),確保檢測(cè)到的NF1基因鑲嵌突變是同時(shí)存在于兩處瘤體的,方能采用該NF1基因突變位點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本文中所報(bào)道的兩位sNF1女性患者均采用該方法進(jìn)行變異檢測(cè),確定了患者胚胎時(shí)期唯一的NF1基因鑲嵌突變后,采用該位點(diǎn)成功進(jìn)行產(chǎn)前診斷,確保了患者子代未遺傳該變異位點(diǎn)。