梁文豪 胡時開 圣忠華 魏祥進(jìn) 焦桂愛 邵高能 謝黎虹 王玲 唐紹清 胡培松

（中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點實驗室，杭州 310006；*通信作者：wangling03@caas.cn；tangshaoqing@caas.cn；peisonghu@126.com）

水稻穗腐病是由層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）為主侵染引起的一種真菌病害[1]。被病原菌感染后的稻穗籽粒灌漿受阻，導(dǎo)致產(chǎn)量降低5%～10%，嚴(yán)重時達(dá)30%以上[2]。近年來，由于秸稈還田措施的實施，水稻穗腐病蔓延迅速，在我國呈現(xiàn)逐年加重的趨勢，已經(jīng)成為水稻生育后期的主要病害之一。層出鐮刀菌不僅為害玉米、水稻和小麥等多種糧食作物[3]，而且在侵染寄主時還會產(chǎn)生有毒的次級代謝產(chǎn)物，其中伏馬毒素具有較強的毒性和致癌能力，長期誤食該毒素容易引起人食管癌[4]。伏馬毒素被認(rèn)為是層出鐮刀菌侵染水稻的毒性因子[5]。

氨基酸是含有羧基和氨基的有機化合物，參與蛋白質(zhì)合成、信號傳導(dǎo)和能量平衡等生理生化過程。已有研究證明，氨基酸代謝在植物病原真菌的生長發(fā)育、孢子形成和侵染宿主能力中發(fā)揮了重要作用[6-7]。氨基酸合成受阻的突變體會產(chǎn)生多種表型缺陷，尤其是在生活力方面。在禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）中，亮氨酸合成途徑中MoLEU1基因缺失導(dǎo)致菌體生長緩慢、產(chǎn)孢量減少、致病力下降以及合成脫氧雪腐鐮刀烯醇（deoxynivalenol，DON）能力喪失[6]。在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中，蘇氨酸合成途徑中MoIlv1基因缺失會抑制菌絲生長、孢子萌發(fā)、附著孢形成和寄主致病力[7]。為了探明層出鐮刀菌與外源氨基酸吸收利用之間的關(guān)系，本研究分析和評價了4 種L-氨基酸對層出鐮刀菌菌絲生長和伏馬毒素合成的影響，旨在為水稻穗腐病防治和毒素污染治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

層出鐮刀菌Fp9 菌株：經(jīng)田間水稻穗腐病自然感病樣品中分離純化獲得。試驗于2022 年在人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加水定容至1 L。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 L。基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）：蔗糖30 g，NaNO32 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，微量元素200 μL[每100 mL 含有Citric acid 5 g，ZnSO4·7H2O 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.75 g，F(xiàn)e (NH4)2(SO4)2·6H2O 1 g，CuSO4·5H2O 250 mg，MnSO4·H2O 50 mg，H3BO350 mg，Na2MoO4·2H2O 50 mg]，pH 6.9，加水定容至1 L。MM 固體培養(yǎng)基：在MM 液體培養(yǎng)基中加入20 g/L 瓊脂粉。

1.3 主要試劑

L-精氨酸（arginine，Arg）、L-谷氨酸（glutamate，Glu）、L-脯氨酸（proline，Pro）、L-瓜氨酸（citrulline，Cit），購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.4 菌株生長測定

將層出鐮刀菌Fp9 菌株置于PDA 培養(yǎng)基上活化，于28 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d 后，打取直徑5 mm 的新鮮菌碟備用。在PDA 和MM 的固體培養(yǎng)基中分別添加4 種L-氨基酸（L-精氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-瓜氨酸），使其終濃度為6 mmol/L 和30 mmol/L。挑取上述新鮮菌碟分別轉(zhuǎn)接到含有不同氨基酸的PDA 和MM固體培養(yǎng)基中，以不添加氨基酸為對照。于28 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)4 d，觀察菌落形態(tài)并拍照記錄。采用十字交叉法，測量菌落直徑。實驗至少重復(fù)3 次。

1.5 伏馬毒素含量測定

1.5.1 樣品制備

將層出鐮刀菌Fp9 菌株置于PDB 培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min 培養(yǎng)3 d，收集分生孢子懸浮液，將其濃度調(diào)整為106個/mL。在PDB 和MM 的液體培養(yǎng)基中分別添加4 種L-氨基酸（L-精氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-瓜氨酸），使其終濃度分別為6 mmol/L 和30 mmol/L。取1 mL 的孢子懸浮液分別接種到含有不同氨基酸的PDB 和MM 的液體培養(yǎng)基中，以不添加氨基酸為對照。于28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)15 d，將菌絲過濾，收集發(fā)酵液。

1.5.2 伏馬毒素檢測

采用FD-100 型真菌毒素快速檢測儀檢測伏馬毒素含量。取1 mL 發(fā)酵液于15 mL 離心管中，加入5 mL提取液[甲醇∶水=4∶1（V/V），含2%氯化鈉]。用旋渦混合器振蕩3 min，后靜置5 min。將100 μL 上清液加入到1 mL 樣品稀釋液中，振蕩混勻，取100 μL 滴至熒光定量快速檢測卡的加樣孔中。置于37 ℃恒溫孵育器中溫育8 min，將檢測卡插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)。實驗重復(fù)3 次。

1.6 伏馬毒素生物合成基因表達(dá)量分析

1.6.1 樣品收集

將層出鐮刀菌Fp9 菌株置于PDB 培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)3 d，收集菌絲。在MM 液體培養(yǎng)基中分別添加4 種L-氨基酸（L-精氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-瓜氨酸），使其終濃度分別為6 mmol/L 和30 mmol/L。將收集菌絲分裝到含有不同氨基酸的MM液體培養(yǎng)基中，以不添加氨基酸為對照，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 h，收集菌絲。

1.6.2 基因表達(dá)分析

將菌絲于液氮中研磨至粉末，用EastepTMSuper Total RNA Extraction Kit （Promega） 提取樣品中總RNA。按照ReverTraRT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒（TOYOBO）去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以合成的cDNA 為模板，利用THUNDERBIRDMix 試劑盒（TOYOBO）進(jìn)行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)。擴增反應(yīng)體系：SYBR qPCR Mix 10 μL，正反向引物（10 μM）各1 μL，cDNA 模板50 ng，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)。根據(jù)伏馬毒素生物合成基因（fum）的cDNA 序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。選用β-tubulin為內(nèi)參基因，以對照樣品中基因的表達(dá)量為1，采用2-ΔΔCt法[8]分析靶標(biāo)基因的相對表達(dá)量。每個樣品重復(fù)3 次。

表1 熒光定量PCR 所使用的引物

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行處理，利用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Student’st檢測法（t-test）進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氨基酸對層出鐮刀菌菌絲生長的影響

從圖1 和圖2 可見，在PDA 培養(yǎng)基中，與未添加氨基酸的對照相比，不同氨基酸對菌絲生長的影響不一樣。添加Arg，菌絲生長明顯加快，氣生菌絲旺盛，在6 mmol/L 和30 mmol/L 濃度時，菌絲生長速率分別比對照顯著提高14.25%和21.37%。添加Pro 和Cit，在6 mmol/L 濃度時菌絲生長無明顯變化，在30 mmol/L 濃度時菌絲生長速率分別提高了3.82%和3.56%。而添加Glu，菌絲生長速度減慢，氣生菌絲變少，在6 mmol/L 和30 mmol/L 濃度時菌絲生長速率分別下降了8.65%和7.12%，且隨著濃度增加菌株的黃色色素分泌增多。說明在PDA 培養(yǎng)基中，L-氨基酸參與層出鐮刀菌的菌絲生長和色素積累。

圖1 添加L-氨基酸的PDA 和MM 固體培養(yǎng)基上層出鐮刀菌的菌落形態(tài)

圖2 添加L-氨基酸的PDA 培養(yǎng)基上層出鐮刀菌的菌落直徑

從圖1 和圖3 可見，在MM 培養(yǎng)基中，未添加氨基酸的對照中菌絲基本長滿培養(yǎng)基表面，外源L-氨基酸添加后菌絲生長速率明顯低于對照。添加Glu，其菌絲生長最慢，氣生菌絲稀疏，顏色變淡，有黃色色素沉積，在6 mmol/L 和30 mmol/L 濃度時菌絲生長抑制率分別為21.55%和20.39%。添加Pro，菌絲老化速度快，高濃度的生長抑制率（15.34%）明顯高于低濃度的生長抑制率（7.18%）。添加Arg，菌絲顏色較深，在6 mmol/L 和30 mmol/L 濃度時其抑制率分別為9.71%和6.60%。添加Cit，菌落中央凹陷，其對菌絲生長的抑制程度相對最弱。整體來看，在MM 培養(yǎng)基中，微量L-氨基酸對層出鐮刀菌的菌絲生長具有明顯的抑制作用。

圖3 添加L-氨基酸的MM 培養(yǎng)基上層出鐮刀菌的菌落直徑

2.2 不同氨基酸對層出鐮刀菌伏馬毒素合成的影響

由表2 可見，在PDB 發(fā)酵培養(yǎng)液中，添加6 mmol/L和30 mmol/L 的L-氨基酸對伏馬毒素積累具有明顯的促進(jìn)作用，且與對照間差異達(dá)到顯著水平。以添加Arg的處理毒素積累最為明顯，與對照相比分別提高8.08倍和7.39 倍；其次為添加Pro 的處理，分別提高8.55倍和5.38 倍；添加Cit 的處理分別提高7.07 倍和5.86倍，而添加Glu 的處理僅提高3.17 倍和0.30 倍。

表2 添加L-氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液中層出鐮刀菌的伏馬毒素含量（單位：μg/L）

由表2 可見，在MM 發(fā)酵培養(yǎng)液中，外源添加不同濃度的L-氨基酸均顯著增強了層出鐮刀菌伏馬毒素的合成能力。其中，添加Arg 后毒素含量分別增加2.63倍和4.03 倍，添加Glu 后分別增加3.50 倍和11.35 倍，添加Pro 后分別增加3.64 倍和5.58 倍，添加Cit 后分別增加6.72 倍和3.72 倍。

2.3 不同氨基酸對層出鐮刀菌伏馬毒素合成基因表達(dá)的影響

伏馬毒素的合成主要依賴于伏馬毒素生物合成途徑中fum基因的轉(zhuǎn)錄水平，本研究進(jìn)一步分析了添加L-氨基酸后層出鐮刀菌的fum基因表達(dá)模式。由圖4可知，添加Arg 后，大多數(shù)fum基因被誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)Arg濃度為6 mmol/L 時，除fum18基因表達(dá)量顯著下調(diào)，其余fum基因的表達(dá)水平相對于對照均顯著提高0.61～5.60 倍，其中fum17基因的表達(dá)水平上調(diào)最為明顯；當(dāng)濃度達(dá)到30 mmol/L 時，fum基因的相對表達(dá)量明顯增加，除fum18基因表達(dá)量下調(diào)，其余fum基因的表達(dá)量比對照顯著提高3.09～80.58 倍，其中fum1基因的表達(dá)水平上調(diào)最高。

圖4 添加Arg 后伏馬毒素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄豐度

由圖5 可知，添加Glu 后，層出鐮刀菌fum基因的轉(zhuǎn)錄在很大程度上受到抑制，其相對表達(dá)量明顯低于對照。當(dāng)Glu 濃度為6 mmol/L 時，fum基因表達(dá)水平較對照顯著下降50%～97%；當(dāng)濃度為30 mmol/L 時，fum基因相對表達(dá)量下降43%～92%。其中，fum7基因表達(dá)水平最低，在6 mmol/L 和30 mmol/L 濃度處理中表達(dá)量較對照分別降低97%和92%。

圖5 添加Glu 后伏馬毒素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄豐度

由圖6 可知，添加Pro 后，層出鐮刀菌fum基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。當(dāng)Pro 濃度為6 mmol/L 時，所有fum基因的相對表達(dá)量都明顯低于對照，顯著下調(diào)61%～97%，其中fum1、fum6、fum8、fum12和fum16基因的表達(dá)水平較低；而當(dāng)濃度為30 mmol/L 時，僅fum7基因和fum15基因表達(dá)量下調(diào)，fum18基因表達(dá)水平變化不明顯，其余fum基因均比對照顯著上調(diào)1.54～3.30倍，其中fum8、fum16和fum17基因的表達(dá)量分別比對照提高3.05、3.30 和3.27 倍。

圖6 添加Pro 后伏馬毒素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄豐度

由圖7 可知，添加Cit 后，層出鐮刀菌的大多數(shù)fum基因都具有較強表達(dá)水平，且在高濃度中的表達(dá)水平高于低濃度的表達(dá)水平。當(dāng)Cit 濃度為6 mmol/L時，除fum7基因和fum18基因表達(dá)量明顯降低外，其余fum基因表達(dá)量均比對照顯著提高0.68～4.0 倍。在30 mmol/L 濃度處理中所有fum基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，比對照顯著提高2.30～44.27 倍，其中fum17基因的表達(dá)水平上調(diào)最為明顯。

圖7 添加Cit 后伏馬毒素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄豐度

3 討論與結(jié)論

在植物病原菌中，氨基酸不僅是營養(yǎng)吸收必不可少的，而且在其生長發(fā)育、逆境應(yīng)答和致病過程中起到重要作用。如L-半胱氨酸對稻曲病菌（Villosiclava virens）[9]、葡萄鏈格孢菌（Alternaria alternata）[10]和李果實褐腐菌（Monilinia fructicola）[11]的菌絲生長均具有明顯的抑制作用。添加甘氨酸可抑制尖孢鐮孢菌古巴?；停‵usarium oxysporumf. sp.cubense）厚垣孢子的誘導(dǎo)形成[12]。本研究通過L-氨基酸添加試驗，綜合分析其對層出鐮刀菌菌絲生長的作用，發(fā)現(xiàn)不同氨基酸的組間存在較為明顯的差異。在PDA 培養(yǎng)基中Arg、Pro 和Cit 作為營養(yǎng)物質(zhì)，對層出鐮刀菌菌絲生長有顯著促進(jìn)作用，而Glu 及MM 培養(yǎng)基中4 種氨基酸則不同程度抑制菌絲生長。不同氨基酸對菌絲生長分化差異的原因，一方面可能是由于細(xì)胞的生長代謝需要一定的碳氮比，而氨基酸和培養(yǎng)基成分作為有機氮源影響了這一比值。另一方面可能是由于氨基酸是許多代謝途徑的中間產(chǎn)物或供體，其可能會對某些代謝途徑產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用，造成代謝通路流向的改變，從而影響菌絲生長。

真菌毒素的生物合成除了受到產(chǎn)毒菌自身遺傳因素的調(diào)控外，還受到多種環(huán)境因素的影響，如營養(yǎng)成分、溫度、水活度和pH 值等[13]。其中，氮源物質(zhì)的吸收與利用對真菌產(chǎn)毒影響較大。谷氨酰胺、天冬氨酰和丙氨酸等會促進(jìn)黃曲霉毒素產(chǎn)生，而硝酸鹽和亞硝酸鹽則抑制黃曲霉毒素合成[14]。氨基酸性氮對真菌毒素合成的影響也有差別。與谷氨酸、硝酸鈉、纈氨酸和蛋氨酸相比，酪氨酸更能促進(jìn)DON 毒素產(chǎn)生[15]。本研究表明，氨基酸作為氮源，對層出鐮刀菌的伏馬毒素合成具有明顯的促進(jìn)作用。比如，在MM 培養(yǎng)基中添加30 mmol/L的Arg，伏馬毒素含量比對照顯著提高4.03 倍，fum合成基因簇整體上調(diào)表達(dá)3.09～80.58 倍，其中fum1基因表達(dá)水平提高80.58 倍。fum1基因編碼一個聚酮合酶，在伏馬毒素的生物合成途徑中起關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)生成19 個碳原子的直鏈碳骨架。因此，本研究認(rèn)為外源氨基酸可能是通過控制菌體的形態(tài)發(fā)育，介導(dǎo)fum基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而決定伏馬毒素的產(chǎn)量。但是，fum基因的表達(dá)量因氨基酸種類不同而有所差異，與氨基酸濃度的高低也并非呈正相關(guān)性，不同氨基酸的具體功能尚需進(jìn)一步探究。伏馬毒素含量的提高，增強了層出鐮刀菌的致病性，從而加重水稻穗腐病的發(fā)生。鑒于氨基酸在層出鐮刀菌的菌絲生長和伏馬毒素合成中的作用，其生物合成途徑中一些酶有望作為殺菌劑靶標(biāo)，對于有效控制水稻穗腐病具有重要意義。