趙胡 沈程 郝慶萍 劉艷紅 季春艷 石瀟瀑

趙? 胡，沈? 程，郝慶萍，等. 香椿中3個(gè)水通道蛋白基因（TsAQP）的克隆和表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（8）：1635-1645.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.08.003

收稿日期：2022-11-27

基金項(xiàng)目：安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2021A0683）；阜陽(yáng)師范大學(xué)-阜陽(yáng)市2021年度市校合作科技專(zhuān)項(xiàng)（SXHZ202107）；2020年度高校優(yōu)秀拔尖人才培育資助項(xiàng)目（gxgwfx2020049）；阜陽(yáng)師范大學(xué)自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（2020FSKJ01ZD）

作者簡(jiǎn)介：趙? 胡（1977-），男，安徽六安人，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。（E-mail）zhaohu8196@sina.com

通訊作者：石瀟瀑，（E-mail）tiramisu.shi@163.com

摘要：水通道蛋白（Aquaporins，AQP）能夠促進(jìn)水分和小分子物質(zhì)在膜上的運(yùn)輸，維持細(xì)胞水分平衡。本研究利用香椿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆到3個(gè)香椿水通道蛋白基因（TsAQP），即??? TsPIP1-5??? （GenBank登錄號(hào)MT501152）、TsPIP2-5??? （GenBank登錄號(hào)MT501153）和??? TsTIP2-1??? （GenBank登錄號(hào)MT501154）。利用生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，結(jié)合生理表型分析，研究TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白性質(zhì)、表達(dá)模式和在香椿芽采后貯藏中的功能。結(jié)果表明：從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出的20個(gè)TsAQP可分為5類(lèi)；TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1是通過(guò)跨膜區(qū)定位于膜的疏水性穩(wěn)定蛋白，含磷酸化位點(diǎn)，無(wú)信號(hào)肽；? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在根、莖和葉中均有表達(dá)且有一定的器官差異性；? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在香椿芽低溫貯藏過(guò)程中表達(dá)量提高，暗示TsAQP在香椿芽采后脫水過(guò)程中有調(diào)控作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究香椿中TsAQP基因的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：香椿；水通道蛋白；基因克隆

中圖分類(lèi)號(hào)：S644.4????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????? 文章編號(hào)：1000-4440（2023）08-1635-11

Cloning and expression analysis of three aquaporin genes （TsAQP） in Toona sinensis

ZHAO Hu1，2 SHEN Cheng1，2 HAO Qing-ping1，2 LIU Yan-hong3 JI Chun-yan3 SHI Xiao-pu1

（1.Biology and Food Engineering College， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China；2.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herb， Fuyang 236037， China；3.College of Information Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236041， China）

Abstract：Aquaporins （AQP） facilitate the transport of water and small molecules across membranes and maintain water balance of cells. Three aquaporin genes in Toona sinensis （TsAQP）??? TsPIP1-5??? （GenBank accession number MT501152）??? TsPIP2-5??? （GenBank accession number MT501153）， and ????TsTIP2-1??? （GenBank accession number MT501154）， were cloned based on transcriptome sequencing. Using a combination of bioinformatics and real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）， we studied the physiological phenotypes， protein properties， expression patterns， and function of TsPIP1-5， TsPIP2-5 and TsTIP2-1 during post harvest storage of Toona sinensis buds. The results indicated that 20 TsAQP proteins identified from the transcriptome data could be classified into five subfamilies. TsPIP1-5， TsPIP2-5 and TsTIP2-1 were hydrophobic stable proteins located on the membrane through the transmembrane region， containing phosphorylation sites and no signal peptide. Different expression levels of ????TsPIP1-5， TsPIP2-5??? ， and ????TsTIP2-1??? ?were detected in the roots， stems and leaves with certain organ differences. The expression levels of ????TsPIP1-5， TsPIP2-5?? ?and ????TsTIP2-1??? ?increased during cold storage of Toona sinensis buds， suggesting that they played a regulatory role in the process of post harvest dehydration. The results of this study lay a foundation for further research on function and regulatory mechanisms of TsAQPs in Toona sinensis.

Key words：Toona sinensis；aquaporin；gene cloning

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是在生物體膜上的具有選擇性運(yùn)輸水分子功能的通道蛋白。AQP不僅運(yùn)輸水分，在氣體、硼、硅、活性氧（ROS）和陽(yáng)離子等小分子物質(zhì)的運(yùn)輸上也發(fā)揮多種生理作用[1-3]。AQP的相對(duì)分子質(zhì)量一般為2.3×104～3.1×105。X射線(xiàn)晶體學(xué)測(cè)定結(jié)果表明，AQP具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征[4-5]。AQP有5個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)（A～E環(huán)）和6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)相互連接，其中B環(huán)和D環(huán)連接胞漿內(nèi)，A環(huán)、C環(huán)、E環(huán)連接胞漿外[5]。AQP蛋白形成的中央水通道由跨膜結(jié)構(gòu)、B環(huán)、E環(huán)共同組成，AQP的典型結(jié)構(gòu)基序Asn-Pro-Ala（NPA）位于B環(huán)和E環(huán)[6]。

AQP在植物中廣泛分布且表現(xiàn)出較高的多樣性，根據(jù)蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸線(xiàn)性排列順序和蛋白質(zhì)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的定位，AQP可劃分為7個(gè)亞類(lèi)[7-8]：（1）具有質(zhì)膜定位的PIP蛋白，進(jìn)一步又可細(xì)分為PIP1類(lèi)和PIP2類(lèi)；（2）具有液泡膜定位的TIP蛋白；（3）類(lèi)根瘤菌26膜內(nèi)在蛋白NIP；（4）小分子堿性膜蛋白SIP；（5）類(lèi)GlpF膜蛋白GIP；（6）未分類(lèi)的X蛋白XIP；（7）混合蛋白HIP。大豆中， NIP類(lèi)水通道蛋白GmNOD26定位于根系固氮菌周膜[9-10]。非豆科植物中， NIP定位于質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[11-13]。已知成員數(shù)較少的SIP主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[14]， XIP主要定位在質(zhì)膜[15]。此外，GIP和HIP亞類(lèi)只存在于苔蘚中[7-8]。從非維管植物到維管植物，所有陸生植物均存在PIP、TIP、NIP和SIP亞類(lèi)[16]，其中，大部分NIP和SIP對(duì)小分子有機(jī)物和礦物質(zhì)有良好的滲透性，而對(duì)水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)活性和專(zhuān)一性較低[17-19]，植物細(xì)胞水分的跨膜運(yùn)輸主要依賴(lài)于PIP和TIP[20-24]。

香椿[Toona sinensis（A.Juss.）Raen]可作為樹(shù)木用于園林綠化，其嫩芽（香椿芽）更多作為蔬菜用于鮮食[25]。采后失水是香椿芽采后衰老劣變的原因之一[26]。AQP是調(diào)控植物水分運(yùn)輸和維持細(xì)胞內(nèi)水分平衡的重要基因[27-29]。目前，在分子層面上對(duì)香椿的AQP還有待進(jìn)一步了解。本研究首先在香椿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上篩選出香椿AQP編碼基因（TsAQP）并進(jìn)行同源性分析；其次，在主要負(fù)責(zé)水分運(yùn)輸?shù)??? PIP1、PIP2和TIP??? 亞類(lèi)中各選取轉(zhuǎn)錄豐度較高且在香椿芽采后貯藏過(guò)程中表達(dá)量變化顯著的1個(gè)基因，通過(guò)PCR擴(kuò)增分別獲得??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 的基因序列，并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析；最后，探究??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在香椿不同器官以及香椿芽采后貯藏過(guò)程中的表達(dá)模式。本試驗(yàn)的目的是為解析水通道蛋白參與調(diào)控香椿芽采后失水和衰老的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 植物材料及培養(yǎng)條件

選用的香椿品種為黑油椿，2021年4月18日在安徽省太和縣香椿種植園采集香椿芽。為保證香椿芽材料遺傳背景一致，全部香椿芽均采自10年生的同株母樹(shù)。選取長(zhǎng)約15 cm生長(zhǎng)良好的嫩芽樣品，放入裝有冰袋的塑料箱中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。新鮮香椿芽洗凈并晾干后放入4 ℃冰箱貯藏，分別于貯藏的第0 d、3 d和5 d取樣（每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)置3組重復(fù)，每組重復(fù)由3～5個(gè)芽頭組成），液氮速凍，用于4 ℃貯藏期間TsAQP基因表達(dá)量的檢測(cè)。

選取生活力和萌發(fā)率一致的香椿種子，栽培于實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用的塑料盆中。生長(zhǎng)條件設(shè)置為溫度20 ℃，光照度800～1 000 lx，光周期為12 h光照，12 h黑夜，相對(duì)濕度控制在65%左右。待第二對(duì)葉片展開(kāi)，分別取來(lái)自3～5株小苗的根、莖和葉片組成1個(gè)生物學(xué)重復(fù)（共3組生物學(xué)重復(fù)），液氮速凍貯藏備用，用于檢測(cè)TsAQP基因在不同器官中表達(dá)量。

1.2? 香椿采后失水試驗(yàn)

將采摘后的香椿芽每組選取3～5個(gè)芽頭，將其分別放入100 μmol/L HgCl2溶液和蒸餾水（對(duì)照）中浸泡10 min后沖洗3～5遍，晾干表面水分，在4 ℃的冰箱里貯藏。分別在貯藏的第0 d、3 d和5 d的同一時(shí)間對(duì)香椿芽進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.3? 香椿水通道蛋白家族分析

對(duì)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的20個(gè)TsAQP，利用MEGA 5軟件以鄰接法（Neighbor-joining method）分析氨基酸序列和同源性[30-31]。

1.4? RNA提取和cDNA合成

用試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)DP441]提取香椿幼苗不同部位的總RNA；1 000 ng總RNA用于反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)KR103。

1.5????? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 基因克隆

從轉(zhuǎn)錄組篩選到的TsAQP中選取主要負(fù)責(zé)水分運(yùn)輸?shù)? ??PIP1、PIP2??? 和TIP亞類(lèi)中轉(zhuǎn)錄豐度較高且在香椿芽采后貯藏過(guò)程中表達(dá)量變化顯著的? ??TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? ，設(shè)計(jì)并合成基因特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物和線(xiàn)性化的克隆載體pMD18-T[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品]按一定比例（參照試劑盒說(shuō)明書(shū)）混合連接。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli DH5α）并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序后分析比對(duì)堿基序列。

1.6? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白生物信息學(xué)分析

利用相關(guān)生物信息學(xué)在線(xiàn)軟件（表2）對(duì)3個(gè)TsAQP進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.7? 基因表達(dá)量檢測(cè)

使用CFX96 Touch PCR儀（BIO-RAD伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司產(chǎn)品）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。采用熒光定量試劑盒FP205[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]中的試劑進(jìn)行試驗(yàn)?；騫RT-PCR特異性引物及內(nèi)參基因引物見(jiàn)表1。利用SPSS 18.0軟件，以ANOVA方式在P＜0.05水平下進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的差異性分析。繪圖采用Origin 9軟件。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 香椿AQP同源性分析

在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定出20個(gè)TsAQP基因，對(duì)它們所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性分析。如圖1所示，20個(gè)TsAQP可分為5類(lèi)，分別為PIP2（6個(gè)）、PIP1（4個(gè)）、TIP（5個(gè)）、NIP（2個(gè)）和SIP（3個(gè)）。

CL6884.Contig9 All：TsPIP2-5；CL674.Contig4 All：TsPIP1-5；CL7513.Contig1 All：TsTIP2-1。

2.2? 香椿??? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 基因克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在??? PIP1、PIP2??? 和TIP亞類(lèi)中各選取1條轉(zhuǎn)錄豐度較高且在香椿芽采后貯藏過(guò)程中表達(dá)量變化顯著的基因??? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? ，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物（表1），以香椿嫩芽cDNA為模板，PCR擴(kuò)增后電泳，分別得到??? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 的擴(kuò)增條帶（圖2）。經(jīng)DNA測(cè)序后，明確了3個(gè)基因完整的編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS），并登錄NCBI比對(duì)（??? TsPIP1-5??? ?GenBank登錄號(hào)MT501152；? TsPIP2-5 ????GenBank登錄號(hào)MT501153；? TsTIP2-1??? ?GenBank登錄號(hào)MT501154）。TsPIP1-5蛋白是由867對(duì)堿基編碼的288個(gè)氨基酸構(gòu)成，TsPIP2-5蛋白是由858對(duì)堿基編碼的285個(gè)氨基酸構(gòu)成，TsTIP2-1蛋白是由744對(duì)堿基編碼的247個(gè)氨基酸構(gòu)成（圖3）。

M：DL2000的DNA標(biāo)記物；A：TsPIP1-5;B：TsPIP2-5;C：TsTIP2-1。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，3個(gè)TsAQP均有1個(gè)內(nèi)在蛋白（Major intrinsic proteins，MIP）的特征基序SGXHXNPAVTFG（圖3），表明TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1可參與小分子被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)水分子等在膜上的進(jìn)出。其中，TsPIP1-5的MIP結(jié)構(gòu)域位于氨基酸第46位至276位，TsPIP2-5的MIP結(jié)構(gòu)域位于氨基酸第31位至264位，TsTIP2-1的MIP結(jié)構(gòu)域位于氨基酸第15位至231位氨基酸（圖3）。除此之外，TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1各含有兩個(gè)非常保守的NPA（Asn-Pro-Ala）基序（圖3）；TsPIP1-5、TsPIP2-5具有高等植物PIP所特有的兩個(gè)保守基序GGGANXXXXGY和TGTGINPARSLGAA（圖3A，圖3B）；TsTIP2-1具有TIP特有的NPARS基序（圖3C）。

下劃線(xiàn)（實(shí)線(xiàn)）：MIP基序；下劃線(xiàn)（虛線(xiàn)）：PIP保守結(jié)構(gòu)域；方框：TIP特有基序；陰影：NPA。

2.3? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白理化性質(zhì)分析

如表3所示，TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1的不穩(wěn)定系數(shù)分別為28.14、31.86和27.19，不穩(wěn)定系數(shù)均小于50，是穩(wěn)定蛋白。TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1親水系數(shù)平均值均大于0，屬于疏水蛋白，符合膜蛋白的特征。TsTIP2-1蛋白親水性系數(shù)平均值為0.931，疏水性高于PIP類(lèi)蛋白（TsPIP1-5蛋白親水性系數(shù)為0.385，TsPIP2-5蛋白親水性系數(shù)為0.518）。通過(guò)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，TsPIP1-5和TsPIP2-5定位于細(xì)胞膜，TsTIP2-1定位于液泡。

2.4? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白結(jié)構(gòu)分析

無(wú)規(guī)則卷曲是TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白多肽主鏈形成的最主要的結(jié)構(gòu)，分別占比高達(dá)48.61%、40.35%和37.25%，其次含量較高的多肽主鏈結(jié)構(gòu)是α-螺旋和延伸鏈，β-折疊占比較少（圖4A～圖4C）。其中，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量達(dá)到30%左右（TsPIP1-5為28.4%，TsPIP2-5為36.49%，TsTIP2-1為34.01%），延伸鏈結(jié)構(gòu)含量達(dá)20%左右（TsPIP1-5為20.49%，TsPIP2-5為20.00%，TsTIP2-1為23.89%）（圖4A～圖4C）。TsPIP1-5、TsPIP2-5和TIP2-1蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖4D～圖4F所示。

2.5? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白的跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)和信號(hào)肽分析

跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TsPIP1-5和TsPIP2-5存在6個(gè)跨膜區(qū)，TsTIP2-1存在7個(gè)跨膜區(qū)（圖5A～圖5C）。? 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，保守的絲氨酸位點(diǎn)在3個(gè)TsAQPs中大量存在，其次為蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)（圖5D～圖5F），說(shuō)明TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1具有磷酸化的修飾機(jī)制。多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)為蛋白質(zhì)在膜上提供結(jié)構(gòu)和功能的保障。分別對(duì)TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白多肽鏈的前60位氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，每一位點(diǎn)的得分（原始剪切位點(diǎn)C、信號(hào)肽S和綜合剪切位點(diǎn)Y）均較低，最高值不超過(guò)0.5（圖5G～圖5I），說(shuō)明3個(gè)蛋白質(zhì)均無(wú)信號(hào)肽。結(jié)合跨膜區(qū)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位結(jié)果，說(shuō)明TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1為定位于膜的非分泌蛋白質(zhì)。

2.6????? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 基因在香椿幼苗中的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)了3個(gè)TsAQP在香椿幼苗的根、莖和葉中的轉(zhuǎn)錄水平。? ??TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在根、莖、葉中均有表達(dá)。??? TsPIP1-5??? 在莖中的表達(dá)量是根和葉片的3倍左右（圖6A）；? TsPIP2-5??? 的相對(duì)表達(dá)量由植物地下部分向地上部分逐漸升高，在葉中的表達(dá)量顯著高于根中（圖6B）；? TsTIP2-1??? 則與??? TsPIP2-5??? 相反，在葉中表達(dá)量最低，在根和莖中的表達(dá)量相近，在根和莖中的表達(dá)量是葉中的5倍左右（圖6C）。

不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。

2.7????? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 基因在香椿芽貯藏過(guò)程中的作用

HgCl2可抑制水通道蛋白活性[20]，本研究以100 μmol/L HgCl2處理香椿芽抑制水通道蛋白活性，研究TsAQP在香椿芽貯藏過(guò)程中的作用。在香椿芽低溫貯藏過(guò)程中，葉片逐漸萎蔫，在第3 d和5 d時(shí)，對(duì)照組的葉片比100 μmol/L HgCl2處理組萎蔫程度更嚴(yán)重（圖7A），說(shuō)明水通道蛋白活性受抑制可延緩香椿芽采后失水。利用qRT-PCR檢測(cè)香椿芽采后低溫（4 ℃）貯藏過(guò)程中??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 的表達(dá)情況。總體來(lái)說(shuō)，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，3個(gè)TsAQP表達(dá)量上升，在采后0～3 d的時(shí)間內(nèi)，表達(dá)量上升緩慢，采后3～5 d表達(dá)量上升迅速（圖7B）。??? TsPIP1-5??? 表達(dá)量在采后3 d是0 d的1.6倍，在采后5 d時(shí)是0 d的2.34倍（圖7B）。??? TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 的表達(dá)量變化更為劇烈，在采后3 d時(shí)分別是0 d的8.07倍和4.63倍，在采后5 d時(shí)分別是0 d的30.79倍和16.13倍（圖7B）。以上結(jié)果表明，水通道蛋白受抑制時(shí)，香椿芽采后失水速率降低，香椿芽采后失水與TsAQP活性有關(guān)；? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 基因在采后高量表達(dá)，表明??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 可能在香椿芽采后失水及衰老過(guò)程中有重要調(diào)控作用。

A：香椿芽表型； B：TsAQP基因相對(duì)表達(dá)量。不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平差異顯著。

3? 討? 論

3.1? 香椿TsAQP基因及分類(lèi)

植物AQP主要?jiǎng)澐譃?個(gè)亞類(lèi)，其中PIP、TIP、NIP和SIP在所有植物中較為保守[32]。AQP基因家族表現(xiàn)出快速進(jìn)化的跡象，因此不同物種的AQP多樣性較高且不能必然區(qū)分物種之間的同源性[32]。在擬南芥、玉米、水稻、天山雪蓮、香石竹中分別鑒定出35、36、33、33、10個(gè)AQP基因[22-23，32-34]。香椿芽是中國(guó)特色蔬菜，但其采后訊速失水劣變，保鮮期短成為制約香椿作為鮮食蔬菜發(fā)展的重要因素。植物中AQP是調(diào)控細(xì)胞水分平衡的重要蛋白質(zhì)，而香椿中AQP的基本信息尚未明確。本研究在分析香椿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)之上共篩選出20個(gè)香椿TsAQP基因，分屬于??? PIP2、PIP1、TIP、NIP和SIP??? ?5個(gè)亞類(lèi)。利用分子克隆，獲得??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 的完整CDS序列，為深入研究TsAQP功能和香椿芽采后失水機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

3.2? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白可能通過(guò)磷酸化執(zhí)行不同功能

蛋白質(zhì)磷酸化是水通道蛋白執(zhí)行功能的重要保證。絲氨酸磷酸化對(duì)水通道蛋白的水轉(zhuǎn)運(yùn)活性有促進(jìn)作用[35]。對(duì)香椿TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)TsAQP均含有較多的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。此外，在分析中發(fā)現(xiàn)，同一磷酸化位點(diǎn)可能被多個(gè)不同激酶結(jié)合。例如，TsPIP1-5蛋白絲氨酸磷酸化位點(diǎn)S27被預(yù)測(cè)有DNAPK、ATM、CK-Ⅱ、cdc2等激酶可結(jié)合，相似的情況也見(jiàn)于TsPIP2-5和TsTIP2-1磷酸化位點(diǎn)。由此推測(cè)，TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1具有靈活的調(diào)控機(jī)制，不僅在水轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要功能，也可能通過(guò)不同的磷酸化途徑調(diào)控其他生命過(guò)程。

3.3?? ???TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 的組織特異性表達(dá)及其作用

基因在不同器官和組織中的表達(dá)與它們的功能相關(guān)，具有不同水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性的水通道蛋白在調(diào)節(jié)不同組織和細(xì)胞的水通量和維持水勢(shì)方面可能發(fā)揮著不同作用[28，36-39]。例如，PIP和TIP在根中的高水平表達(dá)，與它們控制水的徑向運(yùn)輸、調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān)[6，15，28，40-44]。PIP在葉肉細(xì)胞中的表達(dá)可維持細(xì)胞高水勢(shì)，調(diào)控氣孔開(kāi)閉，促進(jìn)CO2擴(kuò)散，促進(jìn)葉肉細(xì)胞生長(zhǎng)[38，45-47]。不同植物的AQP基因在組織器官中的表達(dá)模式有所不同。例如，洋桔梗??? EgPIP1；3??? 在莖中表達(dá)量最高[48]，龍眼??? DLPIP1??? 在根中的表達(dá)量明顯高于其他組織器官[49]，香石竹??? DcaAQP4??? 在萼片和莖中有較高表達(dá)量?? DcaAQP7??? 特異表達(dá)于莖和葉組織[34]。本試驗(yàn)中?? TsPIP1-5??? 相對(duì)表達(dá)量最高的器官為莖；? TsPIP2-5??? 在莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于根；? TsTIP2-1??? 則是在葉片中表達(dá)量最低。說(shuō)明??? TsPIP2-5??? 可能與葉片細(xì)胞水勢(shì)維持、氣孔運(yùn)動(dòng)、CO2同化等過(guò)程有關(guān)；? TsTIP2-1??? 可能主要控制徑向跨細(xì)胞水的運(yùn)輸和滲透調(diào)節(jié)。

3.4????? TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1??? 可能通過(guò)控制失水參與香椿芽采后衰老調(diào)控

植物遭遇水分脅迫時(shí)，水通道蛋白的表達(dá)及活性都受到精細(xì)復(fù)雜調(diào)控，確保細(xì)胞內(nèi)外的水分平衡[50]，主要表現(xiàn)在不同水通道蛋白對(duì)水分脅迫的反應(yīng)有所差異[51-52]。水通道蛋白編碼基因? ??GhPIP2；7??? 和??? GhTIP2；1??? 可正向調(diào)節(jié)陸地棉對(duì)鹽和滲透脅迫的耐受性[29]；整合有鹽生植物海蓬子（Salicornia bigelovii）水通道蛋白編碼基因??? SbPIP1??? 的轉(zhuǎn)基因煙草更能耐受干旱脅迫[53]；過(guò)表達(dá)? ??MusaPIP2；6??? 的香蕉更能適應(yīng)鹽生環(huán)境[54]。高鹽堿的強(qiáng)滲透壓條件下，海刀豆水通道蛋白編碼基因??? CrPIP1；1、CrPIP2；4和CrPIP2；6??? 表達(dá)量上調(diào)響應(yīng)低水勢(shì)脅迫[55]。然而也有結(jié)果顯示，水通道蛋白編碼基因的高表達(dá)不能直接提高植物對(duì)水分脅迫的抗性[56]。例如，將擬南芥水通道蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化進(jìn)煙草植株，可提高轉(zhuǎn)基因植株在適宜條件下的生活力但無(wú)法提高植株對(duì)鹽脅迫和生理脫水的耐受性[56]。由此看出，不同植物和不同類(lèi)型的水通道蛋白對(duì)水分脅迫響應(yīng)機(jī)制不同，這也體現(xiàn)了植物水通道蛋白的功能多樣性。從水通道蛋白表達(dá)與植株吸水能力關(guān)系來(lái)看，正常水分條件下水稻水通道蛋白對(duì)水力傳導(dǎo)度的貢獻(xiàn)為79%，而水分脅迫條件下水通道蛋白對(duì)水力傳導(dǎo)度的貢獻(xiàn)增加至85%[57]。水分脅迫條件下，根系水通道蛋白活性與水力傳導(dǎo)度、細(xì)胞膜水分通透能力同步下降[58]或同步增加[39]。由此可見(jiàn)，植株在水分脅迫發(fā)生時(shí)可能通過(guò)協(xié)同調(diào)節(jié)水通道蛋白活性和表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)一定時(shí)間內(nèi)或一定程度上對(duì)植株水分狀況的調(diào)節(jié)。香椿芽采后品質(zhì)劣變是生物學(xué)研究急需解決的問(wèn)題之一[59-60]。

一直以來(lái)，人們從活性氧代謝、酶活系統(tǒng)、次生代謝物調(diào)節(jié)等角度對(duì)香椿芽采后衰老生理機(jī)制進(jìn)行了大量研究。然而，果蔬在采后衰老過(guò)程中面臨的另一個(gè)重要問(wèn)題就是因脫水而導(dǎo)致離體器官水分平衡失調(diào)[26]。抑制水通道蛋白活性后香椿芽采后失水現(xiàn)象明顯緩解，并且??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在采后貯藏過(guò)程中表達(dá)量逐漸提高，說(shuō)明TsAQP在香椿芽采后失水過(guò)程中可能發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。

4? 結(jié)? 論

香椿嫩芽采后易失水萎蔫，品質(zhì)下降。本研究明確了??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 基因序列及其編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；明確了??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在香椿幼苗不同器官中的表達(dá)情況。??? TsPIP1-5??? 在莖中的表達(dá)量較高?? TsPIP2-5??? 主要在莖和葉中表達(dá)量較高?? TsTIP2-1??? 在葉中表達(dá)最低；? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 的表達(dá)量在采后貯藏過(guò)程中逐漸提高，表明??? TsPIP1-5、TsPIP2-5??? 和??? TsTIP2-1??? 在香椿嫩芽采后失水過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。本研究從3個(gè)TsAQP基因入手，探討香椿嫩芽采后失水及其調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究香椿水通道蛋白的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)可為生產(chǎn)上改進(jìn)香椿嫩芽采后貯藏保鮮技術(shù)提供新思路。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）