付 蓉 王萬林 董細(xì)姿 程金生 董歷華

補(bǔ)陽還五湯是清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯(cuò)·癱痿論》中的經(jīng)典名方,由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、紅花、川芎、桃仁7味藥物組成,具有補(bǔ)氣活血,祛瘀通絡(luò)之功效[1],臨床主治氣虛血瘀所致的中風(fēng),癥見半身不遂、口眼歪斜、言語謇澀等[2]?，F(xiàn)代研究表明,其藥理學(xué)作用涉及促進(jìn)血管神經(jīng)再生,抑制血小板因子活性、抗纖維化及降低炎癥因子含量等[3],在治療腦卒中方面具有保護(hù)神經(jīng)功能,改善腦損傷及抗自由基氧化的作用[4]。而樂平市中醫(yī)醫(yī)院王萬林主任中醫(yī)師經(jīng)過多年大量的臨床運(yùn)用發(fā)現(xiàn),將補(bǔ)陽還五湯加減化裁成通腦康方在用于缺血性腦卒中的療效上優(yōu)于補(bǔ)陽還五湯,且不良反應(yīng)發(fā)生率低,更符合當(dāng)今中風(fēng)患者痰瘀夾雜的證型特點(diǎn)。全方共由黃芪、水蛭、法半夏、茯苓等10味中藥組成,具有益氣除濕、活血通絡(luò)的功效,用于中風(fēng)之氣虛痰瘀互阻證。

通腦康原方往往入煎劑或以飲片全粉制備水泛丸應(yīng)用,存在口服用量大、貯存攜帶不便且患者依從性低等缺點(diǎn)?？紤]到中風(fēng)患者自理能力和吞咽功能均有不同程度的下降,而顆粒劑具有液體制劑和固體制劑的雙重功效,既能保留中醫(yī)方劑配伍特點(diǎn),又能克服湯劑及丸劑服用不便[5]。因此,將其改良制成顆粒劑是一種較好的選擇,符合臨床用藥需求。

中藥制劑作為中醫(yī)藥的重要組成部分,既能發(fā)揮中醫(yī)藥原創(chuàng)優(yōu)勢,又能豐富治療疾病的醫(yī)學(xué)手段,還能為探索中藥新藥開發(fā)提高價(jià)值途徑[6]。自國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制中藥制劑實(shí)施備案管理的公告》[7]以來,傳統(tǒng)工藝制備中藥制劑是研究開發(fā)院內(nèi)制劑的主要途徑[8]。因此,課題組在原有湯劑的基礎(chǔ)上以黃芪主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷[9],桃仁主要成分苦杏仁苷[10]及得膏率為主要考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),以加水量、提取時(shí)間及提取次數(shù)作為主要影響因素,進(jìn)行正交試驗(yàn)對(duì)通腦康顆粒的傳統(tǒng)制備工藝篩選優(yōu)化,以期為今后通腦康顆粒的注冊備案與其相關(guān)制劑的研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫),PWN225DZH電子天平(常州奧豪斯),電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特),多功能粉碎機(jī)(武義海納電器),JP-030超聲波清洗器(深圳潔盟)。

1.2 材料

1.2.1 藥材通腦康方所用10味中藥飲片包括黃芪(批號(hào)210401)、當(dāng)歸(批號(hào)210801)、川芎(批號(hào)200501)、桃仁(批號(hào)210901)、紅花(批號(hào)220601)、地龍(批號(hào)220701)、蘄蛇(批號(hào)210401)、水蛭(批號(hào)220701)、茯苓(批號(hào)221001)及法半夏(批號(hào)220702),均購自安徽亳州千草制藥股份有限公司,經(jīng)樂平市中醫(yī)醫(yī)院程金生副主任中藥師鑒定均為正品,可做藥用,其中水蛭粉碎后過六號(hào)篩備用,其他藥材均入煎劑。

1.2.2 試劑毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)111920-201907,含量96.8%),苦杏仁苷對(duì)照品(批號(hào)110802-202109,含量93.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院,輔料糊精為藥用級(jí),乙腈、甲醇為色譜純,其他試劑試藥均為分析純,分析用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備取毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷對(duì)照品適量,精密稱定,加入70%甲醇定容,制成質(zhì)量濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷20 μg/ml,苦杏仁苷 80 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備精密稱定水提干膏粉5 g置于50 ml具塞錐形瓶中,加入甲醇定容,超聲處理30 min(功率180 W,頻率40 kHz),放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻后過濾,取濾液即得供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液制備按處方比例制備不含黃芪和苦杏仁的陰性樣品,再按“2.1.2”項(xiàng)下的溶液制備方法制備成缺少黃芪和苦杏仁的陰性對(duì)照品溶液。

2.1.4 色譜條件和專屬性色譜柱為Agilent 1260 ODS柱(4.6×250 mm,5 μm),以乙腈為流動(dòng)相A,0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按流動(dòng)相A 0～10 min,0→15%;10～20 min,15%→20%;20～40 min,20%→40%的濃度梯度洗脫,檢測波長為230 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μl,理論塔板數(shù)均不低于4000,色譜圖見圖1～圖3。

注:a苦杏仁苷;b毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖1 混合對(duì)照品溶液

注:a苦杏仁苷;b毛蕊異黃酮葡萄糖苷。圖2 供試品溶液

圖3 缺黃芪 苦杏仁陰性供試品溶液

2.1.5 線性關(guān)系精密吸取6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液,按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,結(jié)果以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)X,以峰面積為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回歸方程為Y=30.772X-1.538,r=0.9991,苦杏仁苷的回歸方程為Y=1394.279X-5542.700,r=0.9996,說明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在2.155～25.857 μg和苦杏仁苷在33.933～407.195 μg具備良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品混合溶液,在“2.1.4”色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次,測定峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分別為0.34%和0.24%,表明儀器的精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批供試品溶液,在“2.1.4”色譜條件下,分別在0、3、6、9、12、15、18、24 h進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、苦杏仁苷的RSD分別1.99%和0.76%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批水提干膏粉6份,按照“2.1.2”制備供試品溶液,在“2.1.4”色譜條件下測定峰面積并計(jì)算各成分含量。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分別為1.76%和1.22%,表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率精密稱取水提干膏粉5 g,平行6份,分別加入一定量“2.1.1”下的混合對(duì)照品溶液,按照“2.1.2”制備供試品溶液,在“2.1.4”色譜條件下測定峰面積及加樣回收率。結(jié)果顯示毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分別為3.41%和1.72%,平均加樣回收率分別為100.05%和104.42%,實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 吸水率課題組取通腦康方中入煎劑藥材五分之一的量,置于燒杯中加純化水分別記錄0.5、1、2、4、6 h的增重情況考察吸水率,結(jié)果該藥材在4 h后無明顯吸水,藥材的吸水率為161%。

2.2.2 正交試驗(yàn)本方制劑是利用傳統(tǒng)工藝制備,因此只能選擇傳統(tǒng)水提工藝,以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),正交試驗(yàn)考察加水量、提取時(shí)間及提取次數(shù)的影響,三因素三水平見表1。

表1 提取工藝因素水平

2.2.3 提取工藝稱取二分之一處方量藥材(除水蛭),按設(shè)定方案進(jìn)行煎煮,過濾,濃縮至100 ml,得到9個(gè)水提液。精密量取水提液2 ml,按“2.1.2”方法制備供試品溶液,以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量和得膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)選出最佳提取工藝。見表2。根據(jù)R值可看出,各因素對(duì)含量影響大小為C>A>B,由K值大小,可判斷最佳工藝條件為A3B2C3,考慮到藥材的吸水率為161%,第2次和第3次加水量可適當(dāng)減少。因此,優(yōu)選提取工藝為:煎煮3次,第1次加12倍水煎煮1.5 h,第2次加10倍量水煎煮1.5 h,第3次加10倍量水煎煮1.5 h。

表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果 (例,%)

得膏率測定:精密量取水提液20 ml,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻0.5 h,迅速稱重,以干燥品計(jì)算供試品中浸出物的含量。浸膏得率(%)=浸膏重量/20 ml藥液相當(dāng)于藥材重量×100%。

綜合評(píng)價(jià)法:根據(jù)處方中的君臣佐使所起的作用權(quán)衡分配不同的比例,綜合評(píng)分(%)=毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/組內(nèi)最高值×40%+苦杏仁苷含量/組內(nèi)最高值×30%+得膏率/組內(nèi)最高值×30%×100%。

2.2.4 工藝驗(yàn)證按處方量稱取飲片3份(除水蛭),按上述正交優(yōu)選工藝進(jìn)行提取,濃縮至100 ml,得到3份水提液,分別取水提液測定主要成分含量及浸膏得率。見表3。經(jīng)過3批工藝驗(yàn)證,毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在0.2 mg/g左右,苦杏仁苷在1.6 mg/g左右,得膏率在28%～30%,綜合評(píng)分96.33%,表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行,可進(jìn)一步擴(kuò)大工業(yè)化生產(chǎn)。

表3 提取工藝驗(yàn)證 (例,%)

2.3 成型工藝研究

2.3.1 樣品制備取20倍處方量稱取藥材,其中水蛭打粉過六號(hào)篩,其余藥材按上述最佳提取工藝制備至稠膏,減壓干燥后粉碎成細(xì)粉,最后將兩者混合備用。

2.3.2 流動(dòng)性課題組采取固定漏斗法測量混合干膏粉休止角,平行測量3次,休止角的平均值為42.76°,流動(dòng)性較差,不能直接制粒,因此還需要加入一定量的輔料。

2.3.3 潤濕劑濃度課題組前期通過以75%、85%、95%乙醇進(jìn)行潤濕劑考察實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)75%乙醇制軟材起團(tuán),容易黏附篩孔,而95%乙醇會(huì)使軟材粘性差,細(xì)粉較多,因此本實(shí)驗(yàn)采用85%乙醇做潤濕劑。

2.3.4 輔料比例顆粒劑傳統(tǒng)輔料中常見的有糊精、蔗糖等,由于在臨床實(shí)踐中,蔗糖對(duì)合并糖尿病患者的血糖影響較大,而糊精的市場價(jià)格最為實(shí)惠,在顆粒制劑中應(yīng)用非常安全廣泛[11]。因此,課題組選擇全部采用糊精作為顆粒劑輔料并進(jìn)行藥輔比例考察。將干膏粉與一定量糊精混勻,制粒,以制粒難易程度、休止角、24 h吸濕率及成型率對(duì)糊精的用量進(jìn)行優(yōu)選,綜合評(píng)價(jià)法=(成型率/組內(nèi)最高值×40%+組內(nèi)最小值/休止角×30%+組內(nèi)最小值/吸濕率×30%)×100%。見表4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終確定最佳的藥輔比例為1∶1.2,考慮到生產(chǎn)批量不同,實(shí)際生產(chǎn)中可適當(dāng)微調(diào)。

表4 輔料用量選擇 (例,%)

2.3.5 干燥條件為防止干燥過程對(duì)顆粒造成影響,因此選用真空干燥箱進(jìn)行干燥,在70 ℃條件下干燥至水分6%,考慮到生產(chǎn)批量不同,可適當(dāng)微調(diào)。

2.3.6 工藝驗(yàn)證以上述優(yōu)選成型工藝制備3批通腦康顆粒,進(jìn)行工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示3次實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)分平均為97.85%,與考察實(shí)驗(yàn)99.01%接近,證明該實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。見表5。

表5 成型工藝驗(yàn)證 (例,%)

3 討論

通腦康方由經(jīng)典方劑補(bǔ)陽還五湯裁化而來,方中黃芪補(bǔ)氣行血為君藥,當(dāng)歸活血補(bǔ)血為臣藥,桃仁、紅花、川芎、水蛭、地龍、蘄蛇活血化瘀,通經(jīng)活絡(luò)為佐藥,半夏、茯苓祛痰除濕亦為佐藥,全方中藥合用共奏補(bǔ)氣除濕、活血通絡(luò)之效,用于氣虛痰瘀互阻型中風(fēng)。

該方以湯劑形式在東平市中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用多年,其中水蛭打粉以湯劑沖服,且有多項(xiàng)研究表明水蛭以散劑服用的抗凝血及抗血栓作用均優(yōu)于煎劑[12-14],因此,課題組在制備工藝上仍然選擇采用水蛭單獨(dú)粉碎后再與其他藥材干膏粉混合制備顆粒劑,最大程度上保持與原方一致。

課題組前期參考2020版《中華人民共和國藥典》[15]及相關(guān)文獻(xiàn)[16-18],考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸及甲醇-0.1%磷酸4種流動(dòng)相下毛蕊異黃酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的色譜峰分離情況,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸雜峰較少,故最終定為實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。同時(shí)根據(jù)混合對(duì)照品全波長掃描結(jié)果,毛蕊異黃酮葡萄糖苷及苦杏仁苷在230 nm處均吸收較大且分離度好,定為實(shí)驗(yàn)檢測波長。制備工藝優(yōu)化過程中,雖然正交試驗(yàn)及綜合評(píng)分顯示加水12倍,提取3次,每次提取1.5 h為最佳工藝,但是實(shí)際上考慮到藥材的吸水率,第2次和第3次加水量可以適當(dāng)減少,另外成型工藝中包括潤濕劑的濃度以及輔料的用量,考慮到生產(chǎn)批次的不同也可以根據(jù)實(shí)際質(zhì)量檢測情況進(jìn)行微調(diào)。

本研究采用正交試驗(yàn)結(jié)合多指標(biāo)評(píng)價(jià)法,將兩類主要功效藥味中的有效成分與得膏率,休止角、成型率與制粒情況等綜合考察工藝參數(shù),相比單一成分及其指標(biāo)更能有效地進(jìn)行制劑質(zhì)量控制。通過以上論述,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的制備工藝穩(wěn)定可行,可以為后期通腦康顆粒注冊備案及其相關(guān)的中藥制劑研究開發(fā)提供依據(jù)。