王嘉璐 李 熠 王東杰 陳建鋒 陳洪波△

頸椎病(Cervical spondylosis)是指頸椎體及椎間盤由于多種原因?qū)е伦甸g盤突出、骨贅增生、椎管狹窄等退行性病變的一種臨床綜合征[1]。臨床癥狀較為復(fù)雜,通常多表現(xiàn)為疼痛及眩暈等癥狀,國外學(xué)者發(fā)現(xiàn),頸椎病還可能通過影響局部脊髓、咽氣道空間等間接導(dǎo)致殘疾、阻塞性睡眠呼吸暫停等嚴(yán)重情況[2]。近年來由于電子設(shè)備的廣泛使用,頸椎病患者人群年齡已逐步減小,日益受到人們的關(guān)注。目前頸椎病治療方法有很多,西醫(yī)治療大多通過服用NSAIDs藥物來緩解疼痛,但效果不明顯。中醫(yī)治療頸椎病具有辨證論治,一癥一方的優(yōu)勢。

羌活勝濕湯由羌活、獨活、藁本、防風(fēng)、甘草、川芎、蔓荊子組成。方中羌活、獨活為君,祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié);防風(fēng)、藁本為臣,祛風(fēng)止痛;佐以川芎活血;蔓荊子清利頭目,甘草調(diào)和諸藥。臨床使用羌活勝濕湯治療頸椎病具有良好效果,但具體機(jī)制尚不明確,本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā)探討羌活勝濕湯治療頸椎病的作用機(jī)制,為今后的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 羌活勝濕湯有效活性成分篩選及靶點預(yù)測在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)中以“羌活、獨活、藁本、防風(fēng)、川芎、蔓荊子、甘草”為關(guān)鍵詞檢索,根據(jù)口服利用度(OB)≥30%,類藥物參數(shù)(DL)≥0.18篩選7味中藥的有效活性成分。初步篩選后獲取各中藥成分相關(guān)作用靶點,將靶點數(shù)據(jù)錄入UniProt數(shù)據(jù)庫對其蛋白名稱規(guī)范化。

1.2 頸椎病靶點及藥物治療頸椎病潛在作用靶點預(yù)測在人類基因數(shù)據(jù)庫(Genecards)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫以“cervical myelopathy”“cervical spondylosis”“cervical spondylotic radiculopathy”作為檢索詞,獲取頸椎病相關(guān)靶點。經(jīng)Venn 2.1.0 在線平臺獲取藥物和疾病的交集靶點韋恩圖。

1.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將中藥、活性成分、靶點信息整理導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,進(jìn)行可視化分析。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建將藥物和疾病的交集靶點導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫,設(shè)定Organism為“Homosapiens”,建立交集靶點之間的PPI網(wǎng)絡(luò),并通過Cytoscape 3.9.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析將交集靶點導(dǎo)入Metascape在線數(shù)據(jù)庫,物種設(shè)置為智人(H.sapiens),選擇個性化分析,分別進(jìn)行GO與 KEGG富集分析,通過微生信平臺將結(jié)果可視化。

1.6 分子對接根據(jù)PPI分析結(jié)果選取疾病核心靶點分別與藥物關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對接:從PDB數(shù)據(jù)庫下載靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu),并使用 PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行初步處理;在TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)關(guān)鍵活性成分Chemical name獲取相應(yīng)化合物3D結(jié)構(gòu)式,通過AutoDock Vina軟件進(jìn)行對接并利用PyMOL、R軟件可視化結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 羌活勝濕湯中藥活性成分及靶點經(jīng)TCMSP查找共得到169個符合條件的活性成分,刪除無對應(yīng)靶點的成分,最終得到157個活性成分,其中羌活13個、獨活8個、藁本1個、防風(fēng)18個、川芎6個、蔓荊子23個、甘草88個。預(yù)測得到羌活勝濕湯藥物靶點205個。

2.2 頸椎病靶點及藥物治療頸椎病的潛在作用靶點通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫,去重后得到頸椎病相關(guān)疾病靶點680個。通過Venn 2.1.0平臺對2組靶點取交集,獲得羌活勝濕湯治療頸椎病的潛在作用靶點55個。見圖1。

圖1 羌活勝濕湯-頸椎病靶點韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖分析通過Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。圖中共有353個節(jié)點、1850條邊。其中節(jié)點代表中藥及其活性成分和靶點,度(Degree)值越高,節(jié)點越大,根據(jù)Degree值排序可見:化合物中槲皮素(quercetin)連接度最高,預(yù)測槲皮素為羌活勝濕湯治療頸椎病的最主要成分;其次為山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)。靶點中PTGS2連接度最高,預(yù)測其發(fā)揮主要作用;其次為AR、NCOA2、SCN5A、GSK3B、 ESR2、PTGS1等。

注:菱形為靶點,方形為藥物,六邊形為活性成分,圓形為藥物共同活性成分;QH:羌活;DH:獨活;CX:川芎;FF:防風(fēng);MJZ:蔓荊子;GC:甘草;GB:藁本。圖2 羌活勝濕湯中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取羌活勝濕湯治療頸椎病潛在作用靶點的互相作用關(guān)系,通過Cytoscape 3.9.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。圖中共有55個節(jié)點、717條邊。根據(jù)Degree值排序依次為:蛋白激酶1 (AKT1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤抑制因子P53(TP53)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9),缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1A)、過氧化氫酶(CAT)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、表皮生長因子受體(EGFR),預(yù)測其為羌活勝濕湯治療頸椎病的關(guān)鍵靶點。

圖3 羌活勝濕湯治療頸椎病PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO與KEGG富集分析結(jié)果GO分析得到生物過程(Biological Process,BP)相關(guān)條目1041條,主要包括:細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)等生物學(xué)過程。細(xì)胞組成(Cell Component,CC)相關(guān)條目37條,主要與膜筏、膜微區(qū)、黏著斑等有關(guān)。分子功能(MolecularFunction,MF)相關(guān)條目81條,主要涉及細(xì)胞因子活性、信號受體激活劑活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。見圖4。

圖4 羌活勝濕湯治療頸椎病的GO分析結(jié)果

KEGG分析結(jié)果顯示,羌活勝濕湯治療頸椎病涉及的信號通路147條,主要信號通路有:癌癥通路、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)通路、白細(xì)胞介素17(Interleukin 17,IL-17) 通路、磷酯酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(Phosphoinositide-3-kinase-serine / threonine kinase,PI3K-Akt)通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路等。見圖5。

圖5 羌活勝濕湯治療頸椎病的KEGG分析結(jié)果

2.6 分子對接結(jié)果經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫得到槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、柚皮素3D結(jié)構(gòu)式,PDB數(shù)據(jù)庫得到AKT1(編號6HHF)、IL-6(編號1ALU) 、TNF(編號5M2J)、TP53(編號2G3R)、IL-1β(編號1L2H) 3D結(jié)構(gòu)式,處理后進(jìn)行對接,結(jié)果顯示結(jié)合能均<-5 kcal·mol-1。見圖6。表明以上活性成分與靶點間具有較強(qiáng)結(jié)合活性,初步證實了研究預(yù)測結(jié)果。

圖6 羌活勝濕湯治療頸椎病主要活性成分與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能(kcal·mol-1)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為頸椎病屬“項痹”范疇,其筋骨、肌肉損傷等發(fā)病過程與中醫(yī)理論中肝主筋、腎主骨、脾主肌肉的思想不謀而合[3]。由于肝腎氣血不足、脾氣虛弱,致使筋骨失其濡養(yǎng),肌肉失其所充,加之外感風(fēng)寒濕邪乘虛侵襲,導(dǎo)致頸部經(jīng)脈痹阻不通,從而引起頸部強(qiáng)直、冷痛麻木等癥狀。

羌活勝濕湯具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效。臨床研究證實羌活勝濕湯治療各類型頸椎病均具有較好療效,如李新偉等[4]發(fā)現(xiàn)其能有效緩解頸型頸椎病患者肌肉緊張;張楊立[5]發(fā)現(xiàn)其能減緩神經(jīng)根型頸椎病患者疼痛。此外,藥理學(xué)表明方中含有甘草酸、蛇床子素、阿魏酸等生物成分[6],能夠降低軟骨細(xì)胞中炎癥因子的水平、抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收,達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛以及保護(hù)骨質(zhì)的作用[7]。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出發(fā),探討羌活勝濕湯治療頸椎病的作用機(jī)制。根據(jù)中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示羌活勝濕湯主要活性成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素、漢黃芩素、柚皮素等,說明其在防治頸椎病的活動中起到了很大作用。研究表明槲皮素能夠調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡進(jìn)程,減少炎癥因子表達(dá),保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),防止椎間盤變性[8]。山奈酚、木犀草素均具有抗炎作用,能夠減緩頸椎病引起的神經(jīng)根性疼痛,并且可通過激活成骨細(xì)胞自噬作用來保護(hù)骨骼[9]。漢黃芩素能夠影響破骨細(xì)胞分化,抑制炎性通路,上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)減輕椎間盤病變。柚皮素可通過巨噬細(xì)胞調(diào)控炎癥因子表達(dá),進(jìn)而修復(fù)骨骼肌和椎間盤損傷[10]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示羌活勝濕湯治療頸椎病關(guān)鍵靶點為AKT1、IL-6、TNF、TP53、IL-1β等。研究表明AKT1參與細(xì)胞生長、代謝調(diào)節(jié)和癌癥等反應(yīng),可通過降解ECM影響椎間盤[11]。IL-6、TNF、IL-1β是一類炎癥介質(zhì),在基質(zhì)破壞、細(xì)胞增殖與凋亡過程中起重要作用,可通過釋放促炎因子誘導(dǎo)ECM降解,加劇椎間盤退變;還可通過炎癥因子,激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)造成機(jī)體神經(jīng)性疼痛[12]。TP53屬于人體抑癌基因的一種,在退化的椎間盤組織中作用于新生血管,加速椎間盤組織退化。

根據(jù)GO分析結(jié)果推測羌活勝濕湯活性成分主要作用于靶點蛋白的膜筏、膜微區(qū)、黏著斑等部位,通過細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞對脂質(zhì)、脂多糖、細(xì)菌來源的反應(yīng)影響細(xì)胞因子活性、受體結(jié)合等過程。KEGG富集分析可推測羌活勝濕湯主要通過TNF、IL-17、PI3K-Akt、MAPK等信號通路治療頸椎病。TNF是引起椎間盤退變的主要炎癥物質(zhì),能夠引起椎間盤內(nèi)分解代謝和合成代謝之間的不平衡,進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤變性、引起頸椎疼痛[13]。IL-17通路可通過激活轉(zhuǎn)錄因子-κB,誘導(dǎo)相關(guān)因子傳導(dǎo),促進(jìn)IL-17-NF-κB驅(qū)動的促炎和抗微生物基因的表達(dá),引發(fā)頸椎病。PI3K-Akt通路能夠影響頸后伸肌細(xì)胞自噬、凋亡平衡[14],MAPK通路可介導(dǎo)血清疼痛介質(zhì)釋放,減輕疼痛反應(yīng),二者可通過抑制炎癥反應(yīng)、影響頸椎間盤軟骨細(xì)胞的凋亡水平,抑制髓核細(xì)胞凋亡,延緩頸椎間盤退變[15]。由此可見,羌活勝濕湯主要通過影響炎性反應(yīng)、軟骨細(xì)胞與髓核細(xì)胞凋亡進(jìn)程,調(diào)控頸椎病的發(fā)展。根據(jù)分子對接結(jié)果表明主要活性成分與關(guān)鍵靶點間均具有較強(qiáng)結(jié)合活性,初步驗證了研究結(jié)果。

綜上所述,羌活勝濕湯通過多成分、多靶點、多通路作用于頸椎病,這為羌活勝濕湯治療頸椎病的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新方向,但本研究還存在一定局限性,今后還需深入挖掘和實驗驗證。