王玉巧,趙艷麗,宋夢仙,張歡,何紅,王瑩

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)為各種慢性心臟病基礎(chǔ)上逐年發(fā)展為心臟疾病的終末階段,心房顫動(atrial fibrillation,AF)是CHF患者常見的心律失常,可進(jìn)一步加劇CHF患者心功能惡化,增加主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)發(fā)生風(fēng)險[1-2]。尋找可準(zhǔn)確評估CHF合并AF患者心功能和預(yù)測MACE發(fā)生的血清標(biāo)志物對預(yù)后改善至關(guān)重要。相關(guān)報道證實(shí),炎性反應(yīng)介導(dǎo)的心肌纖維化參與了CHF合并AF過程[3]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miR)可通過調(diào)控多種機(jī)制參與AF發(fā)生發(fā)展[4]。miR-126是一種血管內(nèi)皮特異表達(dá)miR,能通過抑制血管細(xì)胞黏附分子1表達(dá)抑制心肌炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[5]。miR-126與心力衰竭和AF患者病情程度相關(guān)[6]。miR-222是一種心血管系統(tǒng)特異性表達(dá)miR,能通過調(diào)節(jié)多種靶基因抑制心肌炎性反應(yīng),miR-222與心力衰竭患者AF發(fā)生有關(guān)[7]。現(xiàn)分析CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222與心功能和MACE的關(guān)系,以期為降低CHF合并AF患者的MACE發(fā)生率提供理論依據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2022年10月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院心內(nèi)科收治的CHF合并AF患者120例為AF組,男76例、女44例,年齡36～82(55.81±9.65)歲;CHF病程1～7(4.87±1.83)年;根據(jù)紐約心臟病協(xié)會(New York Heart Association,NYHA)心功能分級[8]:Ⅰ級22例,Ⅱ級29例,Ⅲ級26例,Ⅳ級43例;合并癥:高血壓37例,糖尿病28例,高脂血癥18例;吸煙40例;飲酒18例。未合并AF的CHF患者100例為非AF組,男63例、女37例,年齡37～79(55.89±9.04)歲;CHF病程1～8(4.67±1.59)年。另選取醫(yī)院同期體檢健康者80例為健康對照組,男51例、女29例;年齡18～75(54.47±8.51)歲。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(XYFY2019-0648),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)CHF診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《慢性心力衰竭基層診療指南(2019年)》[8]:具備心力衰竭癥狀和/或體征,利鈉肽升高并符合以下任一條:①心臟舒張功能異常;②左心室肥厚和/或左心房擴(kuò)大;(2)AF診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《心房顫動基層診療指南(2019年)》[9]:經(jīng)體表心電圖或單導(dǎo)聯(lián)心電記錄裝置記錄到心房顫動心電圖且持續(xù)超過30 s;(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)退行性病變、器質(zhì)性心臟病、遺傳等非CHF導(dǎo)致的AF;(2)合并急慢性感染、自身免疫性疾病;(3)急性心力衰竭或慢性心力衰竭急性失代償;(4)妊娠及哺乳期婦女;(5)精神疾病;(6)伴有惡性腫瘤;(7)肝腎功能不全;(8)先天性、風(fēng)濕性心臟病所致心力衰竭。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-126、miR-222水平檢測:收集患者入院次日和健康對照組體檢時空腹肘靜脈血3 ml,離心留取上層血清待測。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測血清miR-126、miR-222水平。具體過程如下:使用TRIzol試劑盒[購自生工生物工程(上海)股份有限公司,貨號 B511321]提取血清總RNA。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海金畔生物科技有限公司,貨號 RR013B)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后使用RT-PCR系統(tǒng)(購自西安天隆科技有限公司,型號 Genesy 96T)并按照PCR試劑盒(購自北京百邁客生物科技有限公司,貨號 RK02006)說明書進(jìn)行擴(kuò)增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)、合成,以U6作為內(nèi)參。內(nèi)參U6上游引物5’-AGAAACACGTCTGGCTAGGAG-3’、下游引物5’-GCATGAAGGCAAGTTGGGTAG-3’;miR-126上游引物5’-TGGCAGAAAACAACCTGAACC-3’、下游引物5’-CCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG-3’;miR-222上游引物5’-TGATTGCACCCACCCTGTAG-3’、下游引物5’-GGTTCCCAGCTTTTCCGTTC-3’。反應(yīng)總體積共25 μl,cDNA 1 μl、上下游引物各1 μl、2×Hieff?PCR Master Mix 10 μl、去離子水7 μl;擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):90℃ 5 min ,90℃ 30 s、60℃ 25 s、70℃ 26 s ,共計(jì)35次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-126、miR-222相對表達(dá)量。

1.3.2 心功能檢測:所有患者入院次日使用美國GE公司生產(chǎn)的Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀行超聲心動圖檢測,通過Simpson法測量左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD);并于入院次日采集空腹肘靜脈血3 ml使用武漢明德生物科技股份有限公司提供的免疫層析法試劑盒檢測N末端前體B型鈉尿肽(N-terminal pro B type natriuretic peptide,NT-proBNP)水平。

1.3.3 預(yù)后及分組:CHF并發(fā)AF患者出院后通過門診復(fù)查或電話回訪的方式隨訪3個月,隨訪起始于患者出院當(dāng)天,隨訪終止事件為隨訪至2023年1月或發(fā)生MACE;MACE包括再發(fā)心力衰竭入院、嚴(yán)重心律失常、心絞痛、心源性死亡、缺血性腦卒中、急性心肌梗死等[9]。根據(jù)是否發(fā)生MACE分為MACE亞組和非MACE亞組。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR-126、miR-222水平比較 血清miR-126、miR-222水平AF組<非AF組<健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組、非AF組、AF組血清miR-126、miR-222水平比較Tab.1 Comparison of serum miR-126 and miR-222 levels among healthy control group, non AF group, and AF group

2.2 不同NYHA心功能分級CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平比較 血清miR-126、miR-222水平Ⅰ級>Ⅱ級>Ⅲ級>Ⅳ級,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

表2 不同NYHA心功能分級CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平比較Tab.2 Comparison of serum miR-126 and miR-222 levels in CHF patients with AF and different NYHA heart function grades

2.3 AF組與非AF組心功能指標(biāo)比較 AF組LVEF低于非AF組,LVEDD、NT-proBNP高于非AF組(P<0.01),見表3。

表3 AF組與非AF組心功能指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of cardiac function indicators between AF group and non AF group

2.4 CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平與NYHA心功能分級的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222與NYHA心功能分級呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.501、-0.496,P均<0.001 )。

2.5 2亞組患者臨床資料比較 隨訪3個月,120例CHF合并AF患者發(fā)生MACE 38例(31.67%)。 2亞組患者的性別、年齡、吸煙、飲酒、合并癥、用藥情況、WBC、Hb、ALT、AST、SCr、BUN、血鈣、血鈉、APTT、LVEF、LVEDD比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而MACE亞組患者CHF病程、NYHA分級Ⅲ～Ⅳ級、血鉀、PT、NT-proBNP高于非MACE亞組,miR-126、miR-222水平低于非MACE亞組(P<0.05),見表4。

表4 非MACE亞組及MACE亞組患者臨床資料比較Tab.4 Comparison of clinical data between non MACE subgroup and MACE subgroup patients

2.6 CHF合并AF患者發(fā)生MACE的多因素Logistic回歸分析 以CHF合并AF患者發(fā)生MACE為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:NYHA心功能分級Ⅲ～Ⅳ級、NT-proBNP升高為CHF合并AF患者發(fā)生MACE的獨(dú)立危險因素,血清miR-126升高、miR-222升高則為獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05),見表5。

表5 CHF合并AF患者發(fā)生MACE的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of MACE occurrence in patients with CHF combined with AF

2.7 血清miR-126、miR-222水平預(yù)測CHF合并AF患者發(fā)生MACE的效能 繪制血清miR-126、miR-222水平預(yù)測CHF合并AF患者發(fā)生MACE的效能ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示:血清miR-126、miR-222及二者聯(lián)合預(yù)測CHF合并AF患者發(fā)生MACE的AUC分別為0.734、0.741、0.839,二者聯(lián)合優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測效能(用DeLong法對其差異進(jìn)行比較)(Z=4.235,4.136,P=0.013,P=0.014),見表6、圖1。

圖1 血清miR-126、miR-222水平預(yù)測CHF合并AF患者發(fā)生MACE的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-126 and miR-222 levels predicting MACE in patients with CHF and AF

表6 血清miR-126、miR-222水平預(yù)測CHF合并AF患者發(fā)生MACE的效能分析Tab.6 Efficacy analysis of serum miR-126 and miR-222 levels in predicting MACE in patients with CHF and AF

3 討 論

CHF主要通過促進(jìn)心肌纖維化、自主神經(jīng)興奮、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)等導(dǎo)致心房動作電位和自律性異常,從而誘發(fā)AF,AF會通過不規(guī)則心室節(jié)律、心房收縮喪失、心動過速、彌漫性纖維化等過程進(jìn)一步降低CHF患者心功能,二者相互促進(jìn)形成惡性循環(huán)加速疾病進(jìn)展[1]。CHF合并AF不僅能加劇心功能惡化,同時還能降低心臟泵血功能引起心房內(nèi)血流淤積形成血栓,增加急性心肌梗死、缺血性腦卒中等栓塞疾病風(fēng)險,導(dǎo)致MACE發(fā)生率增加,導(dǎo)致不良預(yù)后[10]。因此,尋找與CHF合并AF患者心功能以及與MACE發(fā)生有關(guān)的血清標(biāo)志物,對指導(dǎo)臨床預(yù)防MACE發(fā)生和改善患者預(yù)后具有重大意義。

AF的發(fā)生和持續(xù)發(fā)展受到多種因素的共同影響,心肌纖維化導(dǎo)致的心房重構(gòu)被認(rèn)為是AF發(fā)生中重要病理生理機(jī)制之一,炎性反應(yīng)能通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡引起心肌纖維化,再通過心房重構(gòu)導(dǎo)致AF發(fā)生[11]。近年研究表明,miR作為一類短鏈非編碼RNA,能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)激素、炎性反應(yīng)、心房重構(gòu)、電重構(gòu)等機(jī)制參與AF發(fā)生發(fā)展[12]。miR-126是位于人染色體9q34.3上的一個miR,因其特異性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,并能通過抑制血管細(xì)胞黏附分子1表達(dá)發(fā)揮抗炎作用,通過保護(hù)血管功能發(fā)揮心腦血管保護(hù)作用,因此在心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病中得以廣泛研究[5]。既往實(shí)驗(yàn)指出[13],上調(diào)miR-126表達(dá)能抑制心臟肥大和心肌梗死大鼠的心肌纖維化,反之會促進(jìn)心肌纖維化發(fā)展。同時有研究報道,內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-126表達(dá)能預(yù)測CHF患者心血管疾病死亡風(fēng)險[14]。miR-222是位于人染色體Xp11.3上的一個miR,特異性表達(dá)于心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等心血管系統(tǒng),具有重要的心血管系統(tǒng)保護(hù)作用[7]。近年研究表明[15],miR-222不僅能通過抑制單核細(xì)胞趨化蛋白1、血管細(xì)胞黏附分子1等促炎因子生成發(fā)揮抗炎作用,同時還能通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β/母親抗肢癱同系物信號通路活化,抑制糖尿病和心力衰竭引起的心肌纖維化。Lu等[16]通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn),心力衰竭合并AF患者血漿miR-222低于心力衰竭患者。同時有學(xué)者通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn),miR-222有助于心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病的預(yù)測[17]。然而關(guān)于miR-126、miR-222與CHF合并AF患者心功能和MACE的關(guān)系尚未可知。

本結(jié)果顯示,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平降低,這與既往研究報道結(jié)果相符[6];血清miR-126、miR-222水平隨著NYHA心功能分級增加而降低,且血清miR-126、miR-222水平升高是近期MACE發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素。這說明血清miR-126、miR-222水平降低與CHF合并AF患者心功能降低密切相關(guān),并且會增加CHF合并AF患者近期MACE的發(fā)生風(fēng)險。分析原因可能是血清miR-126、miR-222均具有抗纖維化作用有關(guān)。血清miR-126、miR-222水平降低可使血管細(xì)胞黏附分子1等促炎因子活化,激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、Wnt/β-連環(huán)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β/母親抗肢癱同系物信號通路,促進(jìn)心肌纖維化導(dǎo)致AF加重,進(jìn)一步減少心排血量和加重心房內(nèi)血流淤積,導(dǎo)致心功能持續(xù)降低并增加MACE發(fā)生風(fēng)險[18]。本研究結(jié)果還顯示,NYHA心功能分級Ⅲ～Ⅳ級和NT-proBNP升高為CHF合并AF患者發(fā)生MACE的獨(dú)立危險因素,其原因可能是NYHA心功能分級和NT-proBNP越高表示患者心功能越差,因此MACE發(fā)生風(fēng)險更高。目前臨床主要依靠B型利鈉肽或NT-proBNP預(yù)測CHF合并AF患者預(yù)后,但其受影響因素較多,預(yù)測效能存在一定局限性。 血清miR-126、miR-222水平在0.65、0.45時預(yù)測CHF合并AF患者發(fā)生MACE的AUC為0.734、0.741,聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.839,提示聯(lián)合預(yù)測較單一指標(biāo)預(yù)測效能更佳。說明血清miR-126、miR-222水平可能成為CHF合并AF患者發(fā)生MACE的輔助預(yù)測指標(biāo),且聯(lián)合檢測血清miR-126、miR-222水平能提升預(yù)測價值。

綜上所述,CHF合并AF患者血清miR-126、miR-222水平下降,是MACE發(fā)生的獨(dú)立影響因子,血清miR-126、miR-222水平聯(lián)合預(yù)測CHF合并AF患者M(jìn)ACE的效能較高。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王玉巧:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫,論文修改;趙艷麗、宋夢仙:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;張歡、何紅:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;王瑩:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核