賈文瑞，聶安政

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052）

細(xì)辛來源于馬兜鈴科植物漢城細(xì)辛（Asarum sieboldiiMiq.var.seoulense Nakai）、北細(xì)辛［Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.］或華細(xì)辛（AsarumsieboldiiMiq.）的干燥根和根莖［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》細(xì)辛項(xiàng)下記載：“主咳逆上氣，頭痛腦動，百節(jié)拘攣，風(fēng)濕痹痛”［2］?！吨腥A本草》曰：“細(xì)辛祛風(fēng)散寒，通竅止痛，溫肺化飲”，可用于風(fēng)寒頭痛，牙痛，痹痛，咳喘痰稀等證［3-4］。臨床多用于治療牙痛、坐骨神經(jīng)痛、頑固性三叉神經(jīng)痛及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾?。?-7］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)辛具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，而細(xì)辛揮發(fā)油是其主要化學(xué)成分，因此本研究以醋酸刺激痛、熱刺激痛、福爾馬林刺激痛實(shí)驗(yàn)和二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)對細(xì)辛揮發(fā)油進(jìn)行鎮(zhèn)痛抗炎作用研究，初步探討細(xì)辛揮發(fā)油鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

250只昆明小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-0004，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度（23±1）℃，濕度（45±5）%，標(biāo)準(zhǔn)12 h光照/12 h黑暗節(jié)律，普通清潔劑、鼠飼料與飲水。

1.2 藥品及試劑

細(xì)辛來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)藥學(xué)部王娟教授鑒定為馬兜鈴科植物華細(xì)辛（AsarumsieboldiiMiq.）的根及根莖。

二甲苯（上海麥克林生化科技有限公司，批號：20150508）；冰醋酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號：920827）；吐溫-80（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：20211013）；阿司匹林（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：J2022021）；福爾馬林（湖南爾康制藥股份有限公司，批號：H43020198）；荷包牡丹堿（上海源葉生物科技有限公司，批號：J21HB174671）。

1.3 儀器

打孔器（上海澤雅科教儀器有限公司，型號：INS500075-5）；電子天平（上海力辰儀器科技有限公司）；酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號：MR-96A）。

2 方法

2.1 細(xì)辛揮發(fā)油及給藥溶液的制備

取適量細(xì)辛，加入10倍量的蒸餾水浸泡1 h，采用水蒸氣蒸餾法提取細(xì)辛揮發(fā)油，提取4 h，將提取出來的揮發(fā)油密封避光并冷藏保存。取適量揮發(fā)油用1%吐溫-80配制1.2、0.6 g/mL的溶液；取阿司匹林用1%吐溫-80配制15 mg/mL的溶液。

2.2 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

取昆明小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d后按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，即對照組（吐溫-80組）、阿司匹林組和細(xì)辛揮發(fā)油高、低劑量組，每組10只，雌雄各半。阿司匹林組小鼠灌胃300 mg/kg阿司匹林，細(xì)辛揮發(fā)油高、低劑量組小鼠分別灌胃24、12 g/kg（相當(dāng)于生藥量）細(xì)辛揮發(fā)油，對照組小鼠給予吐溫-80，各組給藥量均為20 mL/kg。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃3 d，末次灌胃1.5 h后小鼠腹腔注射0.6%的醋酸0.2 mL，觀察并記錄15 min內(nèi)每組小鼠扭體次數(shù)，并計(jì)算抑制率（%）。

抑制率（%）=（對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/對照組扭體次數(shù)×100%

2.3 福爾馬林實(shí)驗(yàn)

動物分組及給藥同“2.2”項(xiàng)，末次灌胃給藥后1.5 h，昆明小鼠分別右后足底注射給予2.5%的福爾馬林溶液20 μL，觀察并記錄1 h內(nèi)小鼠舔足和咬足的持續(xù)時間。Ⅰ相反應(yīng)為0～5 min舔足和咬足的持續(xù)時間；Ⅱ相反應(yīng)為10～60 min內(nèi)舔足和咬足的持續(xù)時間。

2.4 熱板實(shí)驗(yàn)

動物分組與給藥同“2.2”項(xiàng)，熱板溫度調(diào)整至55.5 ℃，于灌胃前、末次灌胃1、2、3 h后分別測量并記錄小鼠痛閾值。

2.5 耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)

動物分組與給藥同“2.2”項(xiàng)，末次灌胃1 h后將0.05 mL二甲苯均勻涂抹于小鼠右耳的兩面，左耳對應(yīng)位置涂抹等體積的生理鹽水，0.5 h后脫頸椎處死小鼠，將小鼠左右兩耳剪下，疊放對齊，用打孔器在左右耳相同部位打孔，取下稱重。

腫脹度（g）=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量

2.6 受體阻斷實(shí)驗(yàn)

取昆明小鼠60只，分兩批，每批30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d后按體質(zhì)量隨機(jī)分別分為3組，即生理鹽水/1%吐溫-80組、生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組、荷包牡丹堿/細(xì)辛揮發(fā)油組，每組10只，雌雄各半。生理鹽水/1%吐溫-80組小鼠腹腔注射生理鹽水預(yù)處理，15 min后灌胃給予1%吐溫-80；生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組小鼠腹腔生理鹽水注射預(yù)處理，15 min后灌胃給予細(xì)辛揮發(fā)油（24 g/kg）；荷包牡丹堿/細(xì)辛揮發(fā)油組小鼠腹腔注射荷包牡丹堿（3 mg/kg）預(yù)處理，15 min后灌胃給予細(xì)辛揮發(fā)油（24 g/kg）。用熱板法（方法同“2.4”項(xiàng)）測定給藥后1、2、3 h小鼠潛伏期；用醋酸扭體法（方法同“2.2”項(xiàng)）觀察記錄小鼠扭體的次數(shù)。

2.7 血清NO檢測實(shí)驗(yàn)

取昆明小鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d后按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，即正常組、吐溫-80組、細(xì)辛揮發(fā)油組，每組10只，雌雄各半。末次給藥1.5 h后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸（正常組除外），每只0.2 mL，15 min后，小鼠摘眼球取血，室溫靜置1 h，4 ℃離心，3 000 r/min離心10 min，取上清，嚴(yán)格按NO試劑盒說明操作。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同分組之間進(jìn)行單因素方差分析比較組間差異；各組方差齊性條件下采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，各組方差不齊情況下采用Dunnett's T3法進(jìn)行兩兩比較。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)辛揮發(fā)油對醋酸扭體小鼠的影響

與吐溫-80組比較，阿司匹林組和細(xì)辛揮發(fā)油高、低劑量組小鼠扭體次數(shù)顯著降低（P＜ 0.01），抑制率分別為59.6%，57.8%、34.8%。見表1。

表1 各組小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.2 細(xì)辛揮發(fā)油對福爾馬林致疼痛小鼠的影響

與吐溫-80組比較，阿司匹林組、細(xì)辛揮發(fā)油低劑量組Ⅰ相舔足時間顯著降低（P＜ 0.05）；阿司匹林組、細(xì)辛揮發(fā)油高、低劑量組小鼠Ⅱ相舔足時間降低（P＜0.01），抑制率分別為51.73%、52.93%、37.33%。見表2。

表2 各組小鼠福爾馬林致疼痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.3 細(xì)辛揮發(fā)油對熱板小鼠的影響

與吐溫-80組比較，阿司匹林組1、2、3 h熱痛潛伏期顯著延長（P＜ 0.01），細(xì)辛揮發(fā)油高劑量組1 h熱痛潛伏期延長，2、3 h熱痛潛伏期顯著延長（P＜ 0.05，P＜ 0.01），細(xì)辛揮發(fā)油低劑量組2 h的熱痛潛伏期均顯著延長（P＜ 0.01）。見表3。

表3 各組小鼠熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，s）

表3 各組小鼠熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s，s）

注：與吐溫-80組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

組別吐溫-80組阿司匹林組細(xì)辛揮發(fā)油高劑量組細(xì)辛揮發(fā)油低劑量組n 劑量/（g/kg）—0.3 24 12基礎(chǔ)潛伏期12.67±3.67 12.54±4.19 12.13±2.47 12.13±0.92潛伏期3 h 11.98±3.67 16.34±1.63**16.89±4.90*14.38±3.94 10 10 10 10 1 h 12.23±3.58 20.54±1.27**15.26±2.94 13.54±3.24 2 h 12.12±2.71 18.54±1.72**21.32±6.81**17.65±2.96**

3.4 細(xì)辛揮發(fā)油對耳廓腫脹小鼠的影響

與吐溫-80組比較，阿司匹林組和細(xì)辛揮發(fā)油高、低劑量組小鼠耳廓腫脹度顯著降低（P＜ 0.01），抑制率分別為77.13%，82.09%、63.79%。見表4。

表4 各組小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3.5 荷包牡丹堿對細(xì)辛揮發(fā)油作用的影響

3.5.1 對抗醋酸刺激痛作用的影響

與生理鹽水/吐溫-80組比較，生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組小鼠1、2、3 h熱痛潛伏期顯著延長（P＜0.01）；荷包丹堿處理后給予細(xì)辛揮發(fā)油，荷包牡丹堿/細(xì)辛揮發(fā)油組小鼠較生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組1、2、3 h熱痛潛伏期顯著縮短（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。見表5。

表5 荷包牡丹堿對細(xì)辛揮發(fā)油抗醋酸刺激痛作用的影響（±s，s）

表5 荷包牡丹堿對細(xì)辛揮發(fā)油抗醋酸刺激痛作用的影響（±s，s）

注：生理鹽水/吐溫-80組比較，**P ＜ 0.01；與生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

組別生理鹽水/吐溫-80組生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組荷包牡丹堿/細(xì)辛揮發(fā)油組n 基礎(chǔ)潛伏期10.43±1.11 10.40±2.04 10.36±2.97潛伏期3 h 10.43±1.11 14.46±3.24**11.76±2.14#10 10 10 1 h 10.98±1.78 13.64±1.32**11.49±1.85##2 h 10.63±2.05 16.90±1.63**12.30±2.34##

3.5.2 對醋酸扭體作用的影響

與生理鹽水/吐溫-80組比較，生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油組小鼠扭體次數(shù)顯著減少（P＜ 0.01）；荷包丹堿處理后給予細(xì)辛揮發(fā)油，荷包牡丹堿/細(xì)辛揮發(fā)油組小鼠較生理鹽水/細(xì)辛揮發(fā)油扭體次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。見表6。

表6 荷包牡丹堿對細(xì)辛揮發(fā)油抗醋酸扭體作用的影響

3.6 細(xì)辛揮發(fā)油對醋酸致痛小鼠血清NO的影響

與正常組比較，吐溫-80組小鼠血清NO水平顯著升高（P＜ 0.01）；細(xì)辛揮發(fā)油劑量組NO水平較吐溫80組顯著降低（P＜ 0.01），見表7。

表7 細(xì)辛揮發(fā)油對醋酸致痛小鼠血清NO的影響（±s）

表7 細(xì)辛揮發(fā)油對醋酸致痛小鼠血清NO的影響（±s）

注：正常組比較，**P ＜ 0.01；與吐溫-80組比較，##P ＜ 0.01。

組別正常組吐溫-80組細(xì)辛揮發(fā)油組NO水平10.77±0.99 18.07±0.79**12.47±0.70##n 劑量/（g/kg）10 10 10——24

4 討論

細(xì)辛效專力宏、臨床優(yōu)勢明確，以其強(qiáng)烈的辛溫走竄之性改善沉疴痼冷，用于多種頑癥、難治之癥，至今已應(yīng)用于臨床2000余年［8］。細(xì)辛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，東漢《傷寒雜病論》記載含有細(xì)辛的方劑16首［9-10］；隋唐《備急千金要方》收載細(xì)辛內(nèi)服湯劑6首；清代發(fā)現(xiàn)373首含細(xì)辛方劑［11］；而現(xiàn)行《國家醫(yī)保目錄》《中華人民共和國藥典》《中醫(yī)方劑大辭典》共收載含細(xì)辛方劑1 061種［12］。細(xì)辛的活性成分集中在揮發(fā)油中，如甲基丁香酚、細(xì)辛脂素等［7］。

醋酸扭體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陽性藥阿司匹林可顯著抑制小鼠扭體次數(shù)，抑制率為59.6%，高、低劑量的細(xì)辛揮發(fā)油均可顯著抑制醋酸致扭體疼痛，高劑量細(xì)辛揮發(fā)油抑制率為57.8%，與陽性藥阿司匹林作用相當(dāng)，提示細(xì)辛揮發(fā)油具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。福爾馬林疼痛實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可明顯縮短小鼠舔足時間（抑制率51.73%），高、低劑量細(xì)辛揮發(fā)油均可明顯縮短小鼠舔足時間，且高劑量細(xì)辛揮發(fā)油（抑制率52.93%）作用略強(qiáng)于阿司匹林，表明細(xì)辛揮發(fā)油鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)。熱板實(shí)驗(yàn)顯示，阿司匹林與高、低劑量細(xì)辛揮發(fā)油均可顯著延長小鼠1、2、3 h熱痛潛伏期，且給予細(xì)辛揮發(fā)油在2 h時小鼠的熱痛潛伏期最長，提示細(xì)辛揮發(fā)油在2 h時鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)。小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可顯著抑制小鼠耳廓腫脹度，抑制率77.13%；高、低劑量細(xì)辛揮發(fā)油可顯著降低小鼠耳廓腫脹度，抑制率分別為82.09%、63.79%，提示細(xì)辛揮發(fā)油抗炎作用顯著，作用強(qiáng)于阿司匹林。

GABAA受體是氯離子通道成員之一，在外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有廣泛的分布，介導(dǎo)了多種生理功能的發(fā)揮，在控制神經(jīng)元興奮性方面發(fā)揮了重要的作用，與調(diào)節(jié)痛覺調(diào)制等密切相關(guān)［13-14］。NO是氣體信號分子家族中重要的一員，作為第二信使參與許多生物效應(yīng)和生理、病理過程，經(jīng)典信號通路NO/cGMP的激活參與了不同水平神經(jīng)系統(tǒng)對痛覺信號傳遞、加工過程，對疼痛的發(fā)展和維持有著重要的影響［15-16］。激活GABAA受體則可抑制NO/cGMP信號通路，荷包牡丹堿阻斷GABAA受體后又可激活NO/cGMP信號通路［17］。在熱刺激痛和醋酸刺激痛實(shí)驗(yàn)中，GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿能明顯阻斷細(xì)辛揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用，表明細(xì)辛揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用與激動GABAA受體相關(guān)。腹腔注射醋酸致使小鼠血清NO升高，細(xì)辛揮發(fā)油可抑制致痛小鼠血清NO水平，表明細(xì)辛揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用與抑制NO釋放有關(guān)。

綜上，細(xì)辛揮發(fā)油成分有明顯鎮(zhèn)痛抗炎作用，其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與激動GABA受體，抑制NO水平相關(guān)。