王 瑋

中冶長天國際工程有限責任公司

0 引言

NGS（Next-generation sequencing）下一代測序技術(shù)又稱高通量測序技術(shù)，以高輸出量和高解析度為主要特色，一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定，在提供豐富的遺傳學信息同時，還大大降低了測序費用，縮短了測序時間。PCR（Polymerase Chain Reaction）聚合酶鏈式反應(yīng)又稱多聚酶鏈式反應(yīng)，是利用模板DNA 在93 ℃高溫時變性為單鏈DNA，55 ℃低溫時引物與單鏈DNA 按堿基互補序列配對結(jié)合，72 ℃最適反應(yīng)溫度下DNA 聚合酶合成復(fù)制鏈的過程。PCR 是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)，是生物體外特殊DNA的復(fù)制，其最大特點是將微量的DNA 大幅增加。NGS、PCR 用于疾病篩查、診斷、基因突變檢測等，在臨床應(yīng)用中越來越廣泛。本文以某實驗室空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計為例，對NGS、PCR 實驗室的空氣凈化作了簡要闡述。

1 實驗室主要功能分區(qū)

1.1 NGS高通量測序功能分區(qū)

NGS高通量測序功能分區(qū)包括[1］：

1)試劑準備區(qū)

實驗過程中所需的試劑、試劑的分類和保存、一些主要反應(yīng)混合液的分裝和儲存。

2)標本與文庫制備區(qū)

血液處理、血漿制備、DNA 提取、片段化、純化及構(gòu)建樣本。

如果標本量少，標本制備區(qū)每天僅使用一次的話，可將標本制備區(qū)和文庫制備區(qū)合并，否則分開，以避免前次建庫可能存在的、已帶標簽的核酸樣本氣溶膠交叉污染。

3)文庫檢測區(qū)

濃度檢測、混合后的質(zhì)檢分析，檢查濃度、片段大小是否符合要求。

4)文庫擴增區(qū)

DNA 片段末端修復(fù)與純化、文庫混合、缺口平移。

文庫擴增會涉及PCR 過程，產(chǎn)生高濃度的擴增產(chǎn)物和氣溶膠，故需自成一區(qū)。

5)測序區(qū)

測序模板制備、上級測序、數(shù)據(jù)分析，檢查測序后下機的數(shù)據(jù)是否符合要求。

擴增和定量后的文庫在此區(qū)進行芯片加載、測序過程和數(shù)據(jù)產(chǎn)生。由于測序儀對室內(nèi)溫濕度要求較高，且受周圍環(huán)境振動影響較大，故測序區(qū)需單獨設(shè)置。

6)電泳區(qū)

DNA 制備及濃度測定、目的DNA 片段分離，是一代測序擴增產(chǎn)物電泳純化和二代測序判斷DNA提取質(zhì)量、片段分析的公共區(qū)域。

1.2 PCR功能分區(qū)

PCR功能分區(qū)包括[2］：

1)試劑儲存和準備區(qū)

試劑的制備和分裝、主反應(yīng)混合液的制備。

2)標本、文庫制備區(qū)

RNA、DNA 的提取和貯存。

3)擴增區(qū)

cDNA的合成、DNA擴增及檢測。

4)擴增產(chǎn)物分析區(qū)

擴增片段的進一步分析測定。

NGS、PCR 實驗室按上述分區(qū)分成了獨立的實驗區(qū)，每個實驗區(qū)之間設(shè)置緩沖間，實驗室與其他科室之間設(shè)置緩沖走廊，以控制空氣流向，防止實驗室內(nèi)外空氣互通。緩沖間本身是靜態(tài)的安全屏障，如在緩沖間內(nèi)部增設(shè)機械通風，便形成了靜態(tài)+動態(tài)的安全屏障[3］。試劑、標本通過傳遞窗傳遞，傳遞窗采用雙開門形式，以避免封閉不嚴或物品傳遞過程中造成交叉污染，同時，壓力梯度也使整個檢測過程中試劑、標本不受到污染。

2 實驗室壓力梯度要求

實驗室空氣流向為試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)，禁止反向流動[4］。實驗室各區(qū)域，物理上都應(yīng)永久分隔，各區(qū)域間不能有空氣直接流通。試劑儲存和準備區(qū)為最潔凈的區(qū)域，從標本制備到測序反應(yīng)需要的試劑都在此配置和儲存，若該區(qū)域被污染，整個流程乃至最終測序結(jié)果都將受到影響，因此，維持各區(qū)間的壓力梯度非常重要。實驗室壓力梯度是通過控制該區(qū)域內(nèi)的送風量和排風量來實現(xiàn)的，送、排風機均為變頻風機，送風系統(tǒng)與排風系統(tǒng)互為聯(lián)鎖，根據(jù)各區(qū)域壓力梯度要求進行控制。通過調(diào)節(jié)風機頻率及送風、排風管道上的文丘里變風量閥實時匹配送風及排風量，排風風機先于送風機啟動，后于送風機停止。該項目實驗室平面布置及壓力梯度設(shè)置見圖1。

圖1 實驗室平面布置及壓力梯度示意圖

3 空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計

3.1 室內(nèi)參數(shù)要求

實驗室設(shè)備均有溫濕度要求，溫濕度過高會影響設(shè)備的使用壽命。此外，溫濕度還應(yīng)滿足工作人員舒適性要求，如樣本制備區(qū)工作人員需穿實驗服、戴口罩、戴護目鏡等不利散熱設(shè)備，室內(nèi)溫度應(yīng)控制在22～24 ℃，而放置測序儀的房間濕度應(yīng)在20%～60%之間，以便儀器獲得最佳性能。

3.2 送風系統(tǒng)

NGS、PCR 實驗室沒有嚴格的凈化要求，但為避免交叉污染，該項目采用了全新風系統(tǒng)，潔凈級別按十萬級考慮，氣流組織采用上送側(cè)下回形式。NGS、PCR 分別設(shè)置一套無級變量新風機組對實驗室各區(qū)域進行送風，承擔室內(nèi)熱濕負荷。新風機組功能段包括初中效段、加熱段、表冷段、加濕段、風機段等，其冷熱水由大樓四管制風冷熱泵提供，各區(qū)域末端送風口均設(shè)置高效過濾器。各實驗區(qū)域及緩沖間送風支管上均設(shè)置文丘里變風量閥，調(diào)節(jié)室內(nèi)壓力。各房間設(shè)有送風和排風進行通風換氣，稀釋有害物濃度。送風具體布置見圖2。

3.3 排風系統(tǒng)

實驗室各區(qū)域內(nèi)的通風換氣對減少實驗室前一次檢測過程中遺留或擴增產(chǎn)物的污染非常重要，各區(qū)域通風換氣大于10 次/h。樣本制備間、擴增區(qū)內(nèi)設(shè)生物安全柜，該項目由于空間受限，生物安全柜與房間排風共用一套系統(tǒng)。排風支管上設(shè)文丘里變風量閥，廢氣高空排放至屋頂，經(jīng)初效、活性炭吸附、高效過濾后排至大氣。排風量根據(jù)各區(qū)域壓力要求、設(shè)備要求、送風量等匹配設(shè)置。排風機組變頻運行，調(diào)節(jié)室內(nèi)風量及壓力。排風具體布置見圖3。

4 結(jié)語

NGS、PCR 實驗室是目前臨床檢測的重要手段，其空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計重點是根據(jù)建筑功能的分區(qū)設(shè)置壓力梯度。標本制備區(qū)由于靈敏性高，極其微量的氣溶膠污染也會造成假陽性的檢測結(jié)果，因此相對于鄰室區(qū)域，房間需維持正壓；分析區(qū)可能會用到一些有毒物質(zhì)，因此廢氣排風系統(tǒng)必須經(jīng)過吸附、過濾處理后方可高空排至室外。結(jié)合建筑平面、工藝流程，通過設(shè)置緩沖走廊、緩沖間、傳遞窗，及配置合理的空調(diào)、通風系統(tǒng)，才能保證實驗室可靠、安全地運行。