王樹(shù)棟，鄭 璇

（1.貴州警察學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550000；2.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011）

生物化學(xué)是研究生命科學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科，它不但是一門(mén)重要的理論學(xué)科，也是一門(mén)實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)學(xué)科.然而在教學(xué)中，由于實(shí)驗(yàn)手段的限制，傳統(tǒng)的教學(xué)手段大多只進(jìn)行理論講解，知識(shí)枯燥且學(xué)生不易理解.近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和各種軟件（如材料模擬軟件Materials Studio、量子化學(xué)計(jì)算軟件Gaussian、分子對(duì)接軟件Discovery studio 和AutoDock 等）的普及，計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)成為越來(lái)越多教師的選擇，這對(duì)突破教學(xué)難點(diǎn)、提高課堂教學(xué)效率以及激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣等方面發(fā)揮了積極的作用［1-5］.

分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬以分子或分子體系的經(jīng)典力學(xué)模型為基礎(chǔ)，通過(guò)數(shù)值求解分子體系經(jīng)典力學(xué)運(yùn)動(dòng)方程的方法得到體系的軌跡，并統(tǒng)計(jì)體系的結(jié)構(gòu)特征與性質(zhì)［6-7］.近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)的快速發(fā)展，分子動(dòng)力學(xué)模擬依靠其在微觀(guān)水平上精確的控制性以及操作性，在蛋白質(zhì)、DNA 動(dòng)態(tài)行為和生物分子發(fā)揮生理功能的作用機(jī)制、小分子與潛在靶點(diǎn)的識(shí)別、離子運(yùn)輸和酶催化反應(yīng)機(jī)理等方面的研究發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用.可以說(shuō)分子動(dòng)力學(xué)模擬已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到了生物、物理、化學(xué)和材料等領(lǐng)域［8-10］，這也給生物化學(xué)教學(xué)提供了新的思路.

本文選取生物化學(xué)課程中DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)部分內(nèi)容作為對(duì)象，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行教學(xué)探究.

1 建立模型

雙螺旋DNA 的初始結(jié)構(gòu)從蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得（PDBID：8F2W，分辨率：1.30?），放入大小為43×48×65 ? 的周期性長(zhǎng)方體盒子中，然后向水盒子中添加22 個(gè)Na+中和磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，最后向盒子添加0.15 M NaCl以模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，每個(gè)體系的原子數(shù)約12 000個(gè)左右，DNA 與水盒子邊緣之間的最小距離為10?.

2 模擬步驟

在固定溶質(zhì)分子的情況下，采用共軛梯度法首先對(duì)水分子進(jìn)行1 000 步的能量最小化，然后再對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行1 000 步的能量最小化.接下來(lái)，在溶質(zhì)固定的正則系綜（NVT）中，從0 到298 K 進(jìn)行500 ps 的加熱過(guò)程后，進(jìn)行了一系列諧波約束等溫等壓系綜（NPT）模擬，以實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)自由度的受控釋放.用于約束的標(biāo)度分別為5.0、1.0 kcal mol-1·?-2.在每個(gè)約束條件下，使用NPT系統(tǒng)進(jìn)行500 ps MD 模擬.系統(tǒng)使用Langevin thermostat 方法保持系統(tǒng)恒溫，Nosé-Hoover Langevin piston 方法保持系統(tǒng)的壓力.然后對(duì)體系進(jìn)行了10 ns 的產(chǎn)物模擬，對(duì)于非鍵相互作用，使用截?cái)喟霃綖?2? 的周期性邊界條件，Ewald（PME）算法用于處理靜電相互作用，氫原子的鍵通過(guò)shake算法進(jìn)行約束，步長(zhǎng)為2 fs.所有MD 模擬均使用NAMD 2.13 和Colvars 模塊進(jìn)行，結(jié)構(gòu)顯示使用VMD 1.9.3，整個(gè)模擬使用的是CHARMM36力場(chǎng)［11-12］.

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

3.1 氫鍵作用

選取位于DNA 鏈中間部分的一對(duì)胸腺嘧啶-腺嘌呤（T7-A18，圖1（a））和胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤（C9-G16，圖1（b）），計(jì)算其相互作用能隨模擬時(shí)間的變化（圖2）.通過(guò)曲線(xiàn)可以看出，胸腺嘧啶-腺嘌呤Watson-Crick 氫鍵的相互作用能約為-13.1±1.2kcalmol-1，其中靜電相互作用為-12.8±1.9kcalmol-1，占總的相互作用能的97.7%，為絕對(duì)主導(dǎo).胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤Watson-Crick 氫鍵的相互作用能大約為-25.4±1.6kcalmol-1，明顯高于胸腺嘧啶-腺嘌呤相互作用，其中靜電相互作用為-25.1±2.3kcalmol-1占主導(dǎo)的同樣為靜電相互作用（約98.8%）.通過(guò)模擬，把DNA 中堿基對(duì)之間的氫鍵相互作用實(shí)現(xiàn)了量化，與已知的氫鍵對(duì)比（如O-H···O，N-H···O等），學(xué)生進(jìn)一步理解了維持DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要非共價(jià)相互作用—互補(bǔ)堿基之間的氫鍵.同時(shí)，對(duì)于兩種不同類(lèi)型的Watson-Crick 氫鍵相互作用（A-T 和C-G）從能量的角度上進(jìn)行區(qū)分：胸腺嘧啶-腺嘌呤形成雙氫鍵，而胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤形成三氫鍵，三氫鍵的相互作用明顯大于雙氫鍵，但是兩種氫鍵的性質(zhì)是完全一樣的，即都是靜電作用占絕對(duì)主導(dǎo).通過(guò)相互作用能這一量化的概念，并進(jìn)一步對(duì)相互作用能進(jìn)行能量分解，學(xué)生對(duì)DNA 中氫鍵相互作用的類(lèi)型、相互作用能的本質(zhì)有了更加直觀(guān)的認(rèn)識(shí).

圖1 氫鍵作用結(jié)構(gòu)圖(a)：胸腺嘧啶(Thy)與腺嘌呤(Ade)；(b)：胞嘧啶(Cyt)與鳥(niǎo)嘌呤(Gua)）

圖2 氫鍵相互作用能（(a)：胸腺嘧啶(Thy)與腺嘌呤(Ade)；(b)：胞嘧啶(Cyt)與鳥(niǎo)嘌呤(Gua)）

3.2 堿基堆積作用

堿基之間的堆積作用使得DNA內(nèi)部形成一個(gè)強(qiáng)大的疏水作用區(qū)，與介質(zhì)中的水分子隔開(kāi)，這使得互補(bǔ)堿基之間的氫鍵更穩(wěn)定，因此堆積作用對(duì)于維持DNA雙螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)有重要意義.為了進(jìn)一步讓學(xué)生對(duì)堿基堆積作用的理解更加深刻，選取位于DNA雙螺旋中間的胸腺嘧啶（T7）與其相鄰的5′腺嘌呤（A6）和3′胸腺嘧啶（T8），以及腺嘌呤（A6）與其相鄰的腺嘌呤（A5），計(jì)算了其相互作用能，得到相互作用能隨模擬時(shí)間變化的曲線(xiàn)如圖3.從圖中可以看到，在所有的堆積作用中Vdw占明顯主導(dǎo)，這與氫鍵相互作用明顯不同，說(shuō)明無(wú)論是嘧啶與嘧啶、嘧啶與嘌呤還是嘌呤與嘌呤，都是依靠其芳香性環(huán)與相鄰的堿基產(chǎn)生π-π相互作用.但是不同類(lèi)型的堿基之間作用也不一樣，嘧啶與嘧啶的相互作用能（-3.9±0.8 kcalmol-1，圖3（a））略低于嘧啶與嘌呤的相互作用能（-5.6±0.9 kcalmol-1，圖3（b）），而嘌呤與嘌呤的相互作用能最高（-7.5±1.1 kcalmol-1，圖3（c））.

圖3 堆積作用（(a)胸腺嘧啶(Thy)與腺嘌呤(Ade)；(b)胸腺嘧啶(Thy)與胸腺嘧啶(Thy);(c)腺嘌呤(Ade)與腺嘌呤(Ade)）

繼續(xù)讓學(xué)生觀(guān)察模擬得到的軌跡，可以看到，整個(gè)模擬過(guò)程中DNA 始終維持穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，相鄰堿基之間的距離沒(méi)有明顯變化.通過(guò)本部分的計(jì)算和展示，學(xué)生對(duì)抽象的π-π相互作用有了形象的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步理解了DNA 雙螺旋中π-π 堆積的重要意義，通過(guò)對(duì)π-π 相互作用能的量化，學(xué)生能區(qū)分嘧啶-嘧啶、嘧啶-嘌呤以及嘌呤-嘌呤之間相互作用的異同.

3.3 π-π堆積的破壞

在整個(gè)模擬過(guò)程中，通過(guò)對(duì)軌跡的觀(guān)察，學(xué)生們注意到DNA 始終維持穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，相鄰堿基之間的距離沒(méi)有明顯變化，DNA 分子周?chē)紳M(mǎn)了水分子，但是DNA 內(nèi)部始終沒(méi)有水分子進(jìn)入，這說(shuō)明堿基之間的堆積使得DNA 內(nèi)部形成一個(gè)疏水腔.傳統(tǒng)的教科書(shū)中只能展示標(biāo)準(zhǔn)的雙螺旋DNA 的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，為了進(jìn)一步說(shuō)明這種堆積作用對(duì)于維持DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要性，通過(guò)逆向思維，借助于meta-eABF 對(duì)其中的一個(gè)堿基（T19）拉伸，使其偏離正常的Watson-Crick 氫鍵，從而實(shí)現(xiàn)破壞其與相鄰堿基的堆積作用的目的，然后再觀(guān)察DNA，如圖4（b）.可以看到當(dāng)T19翻轉(zhuǎn)出雙螺旋后，水分子逐漸進(jìn)入到DNA 雙螺旋的腔內(nèi)，并進(jìn)一步與周?chē)鷫A基形成氫鍵.其中一個(gè)H2O與T7的O2形成一個(gè)鍵長(zhǎng)為1.86?，鍵角為154°的氫鍵；與A7的N1形成一個(gè)鍵長(zhǎng)為1.94?，鍵角為140°的氫鍵；另一個(gè)H2O 與T20 的O4 形成一個(gè)鍵長(zhǎng)為1.80?，鍵角為159°的氫鍵.由于這些氫鍵相互作用都比較強(qiáng)，因此H2O 可能進(jìn)一步破壞T19 周?chē)腤atson-Crick 氫鍵相互作用（A6-T19，T7-A18），最終破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu).

圖4 堆積作用破壞前后DNA雙鏈內(nèi)部水分子的變化(a)破壞前；(b)破壞后

在本部分中，借助于meta-eABF 方法，采取破壞堿基堆積的方式，用逆向思維的方式讓學(xué)生更加深刻認(rèn)識(shí)到堿基堆積作用的重要性，相對(duì)書(shū)本上生硬的理論知識(shí)，這種教學(xué)方法給學(xué)生了留下了深刻印象，對(duì)知識(shí)點(diǎn)有了更深入的理解.

3.4 DNA雙螺旋多態(tài)性的展示

Watson 和Crick 得到的B-DNA 是依據(jù)相對(duì)濕度為92%的DNA 鈉鹽所得到的X 射線(xiàn)衍射圖提出的，在不同條件下，DNA 會(huì)呈現(xiàn)不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型，如A-DNA，Z-DNA，G-quadruplex等.DNA 的不同結(jié)構(gòu)已被證明都可以在生物體內(nèi)存在，并且有重要的意義，其中A-DNA 是當(dāng)相對(duì)濕度為75%時(shí)的DNA 結(jié)構(gòu)，越來(lái)越多的研究表明，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，DNA 更可能趨向A-DNA.A-DNA 的堿基平面傾斜了20°，每螺旋有11 對(duì)堿基，堿基間垂直距離為0.26nm，與B-DNA相比，A-DNA的結(jié)構(gòu)更緊密.但是DNA的這些復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于初學(xué)者非常抽象，僅僅通過(guò)書(shū)中靜態(tài)結(jié)構(gòu)的展示，難以完全理解不同形態(tài)DNA的區(qū)別和聯(lián)系.為此，使用可視化軟件VMD把不同形態(tài)的DNA展示給學(xué)生.如圖5是同一DNA序列（d（CGCGAATTCGCG）2），當(dāng)DNA雙螺旋分別為A型（圖5（a））和B型（圖5（b））時(shí)的結(jié)構(gòu)圖.通過(guò)Licorice形式結(jié)構(gòu)圖的展示，學(xué)生直觀(guān)清晰地看到了A-DNA 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)A-DNA 和B-DNA 的區(qū)別有了直觀(guān)的認(rèn)識(shí).學(xué)生也可以利用VMD選擇不同的繪圖形式或者旋轉(zhuǎn)等功能多形式、多角度認(rèn)識(shí)B-DNA與A-DNA的區(qū)別.

圖5 同一序列(d(CGCGAATTCGCG)2)雙螺旋DNA不同形態(tài)的結(jié)構(gòu)圖（(a)B-DNA；(b)A-DNA）

4 結(jié)語(yǔ)

分子動(dòng)力學(xué)模擬已被廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子體系的研究中.DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是《生物化學(xué)》教學(xué)中的重點(diǎn)，探索性將分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合可視化軟件應(yīng)用于DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的教學(xué)中，讓DNA 的結(jié)構(gòu)變得形象化和具體化，使學(xué)生對(duì)DNA 中堿基堆積作用、疏水作用、氫鍵相互作用和DNA 的多態(tài)性等也有了更加直觀(guān)、深入的理解，提高了生物化學(xué)的教學(xué)質(zhì)量.同時(shí)，還為感興趣的學(xué)生提供了一種探索、認(rèn)識(shí)和研究DNA的方法，激勵(lì)學(xué)生進(jìn)一步在相關(guān)領(lǐng)域深造.