胡艷艷, 秦寶麗, 周 璐, 邱 月, 椰慧楠, 張欣慰

中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院·遼寧省腫瘤醫(yī)院 1.消化內(nèi)科一病區(qū);2.胸部·食管放療病區(qū);3.中西醫(yī)結(jié)合科,遼寧 沈陽 110042

結(jié)直腸癌是在內(nèi)、外因素作用下發(fā)生的一種多基因表達(dá)失調(diào)的常見惡性腫瘤,其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)居高不下,嚴(yán)重影響人們的身體健康和社會發(fā)展[1]。隨著結(jié)直腸癌治療靶點和藥物種類逐步增加,對于其治療藥物快速篩選主要通過體外細(xì)胞培養(yǎng),但在二維(two-dimensio,2D)培養(yǎng)環(huán)境下與三維(three-dimensio,3D)體內(nèi)環(huán)境存在很大差異。2D培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞常呈單層貼壁生長,細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)接觸較少,與體內(nèi)腫瘤真實的生長微環(huán)境存在差異,不能準(zhǔn)確反映腫瘤在體內(nèi)的真實生長情況[2]。3D培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,尤其對于研究腫瘤微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及抗腫瘤藥物篩選等方面具有重要意義[3]。殼聚糖-膠原水凝膠是一種新型的3D細(xì)胞培養(yǎng)材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,在組織工程、藥物篩選和細(xì)胞研究等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[4]。OTU結(jié)構(gòu)域泛素結(jié)合蛋白2(OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein 2,OTUB2)與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)均為結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子,調(diào)控其表達(dá)可能為3D和2D培養(yǎng)差異關(guān)鍵靶點[5]。本研究旨在探討結(jié)直腸癌細(xì)胞在3D與2D培養(yǎng)環(huán)境下增殖能力的變化及機制,為體外3D細(xì)胞培養(yǎng)材料改進(jìn)提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫。將SW480結(jié)直腸癌細(xì)胞分別進(jìn)行殼聚糖-膠原水凝膠3D培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)皿2D培養(yǎng)。2D培養(yǎng)中結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,于37℃、5%CO2的增濕空氣中培養(yǎng)。3D培養(yǎng)中首先制備殼聚糖-膠原水凝膠支架,將殼聚糖原液與膠原按質(zhì)量比10∶1混合后,連續(xù)攪拌1 h,細(xì)胞培養(yǎng)基浸泡處理后形成水凝膠。在1 ml水凝膠中加入1×106個結(jié)直腸癌細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 研究方法 普通光學(xué)顯微鏡下觀察2D、3D培養(yǎng)條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞形態(tài)。采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒測定細(xì)胞增殖。在96孔板中加入100 μl細(xì)胞懸液,進(jìn)行相應(yīng)處理后每孔加入10 μl CCK-8溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。采用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。將制備編碼慢病毒顆粒的重組慢病毒質(zhì)粒和輔助包裝元件共轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,過表達(dá)OTUB2基因。提取蛋白后,將蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,于含3%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中室溫封閉1 h,采用OTUB2與PCNA抗體以4℃孵育過夜,磷酸鹽緩沖液漂洗3次。二抗室溫孵育1 h,磷酸鹽緩沖液漂洗3次,應(yīng)用Western印跡試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3D與2D培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞形態(tài)比較 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞在2D環(huán)境培養(yǎng)24 h后可圓形或卵圓形細(xì)胞貼壁,7 d后已貼壁的細(xì)胞慢慢伸展,呈短桿狀。SW480結(jié)腸癌細(xì)胞在殼聚糖-膠原水凝膠3D培養(yǎng)24 h后呈3D球狀生長,培養(yǎng)7 d后可見細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞球變大。見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)觀察(a.2D培養(yǎng)24 h細(xì)胞;b.2D培養(yǎng)7 d細(xì)胞;c.3D培養(yǎng)24 h細(xì)胞;d.3D培養(yǎng)7 d細(xì)胞)

2.2 3D與2D培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞增殖速率比較 3D培養(yǎng)環(huán)境SW480細(xì)胞增殖速率低于2D培養(yǎng)環(huán)境,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SW480在3D培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)后1、3、5、7 d的細(xì)胞增殖速率均低于2D培養(yǎng)。見圖2。

圖2 3D與2D培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞增殖率比較

2.3 3D與2D培養(yǎng)環(huán)境蛋白表達(dá)比較 Western blot法檢測結(jié)果顯示,與2D培養(yǎng)比較,3D培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)后結(jié)直腸癌細(xì)胞系中OTUB2、PCNA蛋白表達(dá)均低于2D培養(yǎng)環(huán)境,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 3D與2D培養(yǎng)環(huán)境蛋白表達(dá)比較

2.4 3D與2D培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞轉(zhuǎn)染比較 轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖速率均高于轉(zhuǎn)染前,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后基因、蛋白與增殖率檢測比較(a.Western blot結(jié)果;b～c.轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞蛋白檢測;d～e.轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞基因檢測;f.轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖率檢測)

3 討論

癌癥預(yù)后差與腸癌細(xì)胞某些基因的表達(dá)水平相關(guān),經(jīng)過早期篩查和治療的腸癌患者預(yù)后更佳[6-8]。體外培養(yǎng)細(xì)胞篩查藥物方法主要包括依賴傳統(tǒng)的塑料培養(yǎng)板、異種培養(yǎng)基的2D培養(yǎng)方法與新興的3D培養(yǎng)方法[9]。2D培養(yǎng)作為標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)能夠使細(xì)胞感受和應(yīng)對微環(huán)境信息,方便且高效擴增。但采用2D培養(yǎng)擴增方法培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)微環(huán)境相差甚遠(yuǎn)[10-11]。3D培養(yǎng)是指利用各種方法和材料,使細(xì)胞更接近于體內(nèi)生長狀況。與傳統(tǒng)2D單層培養(yǎng)比較,3D培養(yǎng)為腫瘤細(xì)胞在體外的生長提供類似于體內(nèi)生長環(huán)境的生物支撐或基質(zhì)。此外,在3D培養(yǎng)條件下,細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間充分接觸并建立相互聯(lián)系[12-14]。水凝膠能夠模擬細(xì)胞的體內(nèi)微環(huán)境,為其生長提供基質(zhì),更有利于開展結(jié)直腸癌細(xì)胞系3D培養(yǎng)和生物學(xué)調(diào)控機制研究。通過殼聚糖與膠原共混制備成水凝膠支架材料,殼聚糖的引入適當(dāng)增加體系中的正電荷利于細(xì)胞有效粘附,而膠原是細(xì)胞外基質(zhì)成分利于細(xì)胞功能表達(dá)[15-18]。

本研究結(jié)果顯示,SW480在細(xì)胞培養(yǎng)皿2D培養(yǎng)24 h后貼壁伸展,在殼聚糖-膠原水凝膠中3D培養(yǎng)24 h后呈3D球狀生長。這提示,在殼聚糖-膠原水凝膠支架中SW480細(xì)胞能夠進(jìn)行類似于人體環(huán)境的生長,可進(jìn)一步研究其增殖特點。本研究結(jié)果顯示,3D培養(yǎng)環(huán)境SW480細(xì)胞增殖速率低于2D培養(yǎng)環(huán)境,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示,3D與2D培養(yǎng)環(huán)境下腫瘤細(xì)胞增殖速度存在差異,進(jìn)一步探索其差異機制能夠為3D細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化和調(diào)控腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長特點提供參考。OTUB2能夠通過去泛素化酶的作用調(diào)控PCNA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[19-20]。本研究中Western blot法檢測結(jié)果顯示,與2D培養(yǎng)比較,3D培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)后結(jié)直腸癌細(xì)胞系中OTUB2、PCNA蛋白表達(dá)均低于2D培養(yǎng)環(huán)境,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示,3D與2D細(xì)胞增殖速率差異與OTUB2、PCNA蛋白表達(dá)有關(guān)。此外,轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖速率均高于轉(zhuǎn)染前,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示,3D環(huán)境能夠影響OTUB2基因,進(jìn)而調(diào)控其蛋白表達(dá)水平,影響腫瘤細(xì)胞生長速度。

綜上所述,殼聚糖-膠原水凝膠3D培養(yǎng)條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖速率減慢,其機制與調(diào)控OTUB2、PCNA表達(dá)有關(guān)。