閆 麗, 金格雅,2, 王愷悅, 王喜良, 于月新

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,遼寧 沈陽(yáng) 110016;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生院,遼寧 沈陽(yáng) 110122

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢功能衰退,是女性不孕的主要原因之一[1]。POI患者促性腺激素水平升高(促卵泡生成素>25 U/L)、雌激素水平下降,主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常(稀發(fā)或閉經(jīng))[2],誘發(fā)更年期癥狀,如潮熱、盜汗、失眠等,增加心血管疾病和骨密度降低的風(fēng)險(xiǎn)[3]。有研究表明,POI在我國(guó)的發(fā)病率約1%[4],其受到遺傳、免疫、化療等醫(yī)源性因素、環(huán)境、心理因素的影響,發(fā)病率逐年增長(zhǎng)且患病群體年輕化[5-6]。目前,POI發(fā)病機(jī)制還不明確,缺乏有效的治療手段和藥物,因此,找到安全且有效的治療方案成為亟待解決的問(wèn)題。建立動(dòng)物模型是研究發(fā)病機(jī)制及治療效果的常用方法,根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制,POI的動(dòng)物模型制備方法主要有化學(xué)損傷藥物造模法[7-8]、半乳糖代謝造模法[9]、基因敲除造模法等[10-11]?；煋p傷藥物模型是研究POI的經(jīng)典模型?；熕幬锃h(huán)磷酰胺造價(jià)低,可用于治療惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征等[5,12-13]。環(huán)磷酰胺通過(guò)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡并對(duì)不同發(fā)育階段的卵泡造成損傷,使卵泡發(fā)育受阻,引起性激素水平變化,進(jìn)而導(dǎo)致卵巢功能障礙[14]。本研究通過(guò)比較不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)新西蘭白兔卵巢功能的影響,探究建立化療損傷性POI家兔模型的最佳給藥方案,以期為臨床研究提供一種安全、可靠的模型構(gòu)建方案?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)雌性未交配新西蘭白兔32只,5月齡,體質(zhì)量2.7～2.9 kg,由青島康大生物科技有限公司提供[ SCXK(魯)2020-0003],飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料,保持室溫在20℃～24℃,相對(duì)濕度在45%～50%,模擬正常晝夜生理節(jié)律,每天光照12 h,自由飲水和進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照本院實(shí)驗(yàn)中心的規(guī)范要求,符合動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則(倫理批號(hào)第2020-08號(hào))。

1.2 主要試劑及設(shè)備 注射用環(huán)磷酰胺購(gòu)自德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司(注冊(cè)證號(hào)H20160467),0.2 g/瓶,注射前用生理鹽水配成40 mg/ml新鮮水溶液備用;兔雌二醇酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、兔促卵泡生成素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物(貨號(hào)JL22071、JL22073);烏拉坦購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司(貨號(hào)U820333);蛋白提取試劑盒Protein Ext Mammalian Total Protein Extraction Kit購(gòu)自全式金公司(貨號(hào)DE101-01);BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自天根公司(貨號(hào)PA115);Bax、Bcl2、Tubulin蛋白抗體均購(gòu)自Proteintech公司(貨號(hào)50599-2-lg、12789-1-AP、11224-1-AP);Goat HRP anti-Mouse購(gòu)自invitrogen公司(貨號(hào)31460);BY-600A型離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司;Leica RM225切片機(jī)、Leica EG1150包埋機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Leica Biosysterms Nussloch GmbH公司;BX51顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳槽購(gòu)自日本Bio-craft(貨號(hào)BE-230);半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.3 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù) 根據(jù)臨床上環(huán)磷酰胺化療的用藥方案,分為小劑量持續(xù)治療組和大劑量沖擊治療組,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只新西蘭兔分成4組,每組各8只。A組為正常對(duì)照組;B組50 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺1 d,8 mg/kg連續(xù)注射14 d;C組50 mg/kg連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d;D組100 mg/kg連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d。模型組家兔雌二醇水平降低、促卵泡生成素升高且與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),卵巢卵泡數(shù)目顯著減少表明POI模型構(gòu)建成功。

1.4 動(dòng)物取材及處理 各組家兔造模3周后,耳緣靜脈取血,收集于5 ml采血管中。隨后經(jīng)耳緣靜脈注射過(guò)量20%烏拉坦溶液致兔安樂(lè)死,取家兔雙側(cè)卵巢,一側(cè)卵巢置于凍存管中,置于-80℃冰箱凍存,另一側(cè)卵巢放入10%中性甲醛溶液中固定至少24 h。血液標(biāo)本室溫下靜置2 h后,3 000 r/min離心10 min,將上層血清分裝至1.5 ml離心管,每管300 μl,置于-80℃冰箱保存。

1.5 家兔體質(zhì)量及卵巢指數(shù) 造模開(kāi)始后,觀察家兔的活動(dòng)情況、進(jìn)食量及兔毛脫落情況。每周對(duì)家兔進(jìn)行稱(chēng)重并記錄,造模結(jié)束后,取兩側(cè)卵巢,小心剝離多余脂肪組織,測(cè)量卵巢長(zhǎng)徑并用電子天平稱(chēng)濕重,計(jì)算卵巢指數(shù)。

卵巢指數(shù)=(卵巢濕重/體質(zhì)量)×100%

1.6 卵巢組織學(xué)形態(tài)及卵泡數(shù)目 卵巢組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后,進(jìn)行石蠟包埋,切成4 μm切片,HE染色后,在光鏡下觀察卵巢組織形態(tài),計(jì)數(shù)各級(jí)卵泡[4],計(jì)算閉鎖卵泡/卵泡總數(shù)的比值(閉鎖卵泡占比)。原始卵泡定義為卵母細(xì)胞被一層鱗狀顆粒細(xì)胞包圍;初級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞被一層立方顆粒細(xì)胞包圍;次級(jí)卵泡由一層以上的立方顆粒細(xì)胞包圍,尚未形成囊腔;早期的竇卵泡開(kāi)始出現(xiàn)囊腔,排卵前的竇卵泡出現(xiàn)明顯的層級(jí)云顆粒細(xì)胞層;閉鎖卵泡的卵母細(xì)胞萎縮,形態(tài)不規(guī)則,透明帶深染。各級(jí)卵泡分類(lèi)見(jiàn)圖1。

圖1 各級(jí)卵泡分類(lèi)(a.原始卵泡;b.初級(jí)卵泡;c.次級(jí)卵泡;d.竇卵泡;e.閉鎖卵泡)

1.7 血清激素水平檢測(cè) 血清樣本采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)促卵泡生成素、雌二醇的水平,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋。(2)加樣:分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。加樣體積為50 μl,樣品使用樣品稀釋液稀釋5倍加樣。(3)每孔加入50 μl Biotin-抗體工作液。(4)37℃溫浴1 h后洗滌。(5)加酶:每孔加入100 μl酶結(jié)合物工作液,37℃溫浴30 min后洗滌。(6)顯色:加入底物(TMB)90 μl,37℃避光溫浴30 min。(7)終止:每孔加入50 μl終止液。(8)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光度值。

1.8 卵巢組織蛋白檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū),提取卵巢組織中的Bax和Bcl2蛋白[5]并進(jìn)行免疫印跡分析。具體步驟如下:凍存組織取出后,加入1 ml組織裂解液,使用勻漿器快速研磨使其裂解,隨后進(jìn)行蛋白定量,通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%牛奶室溫封閉1 h,孵育一抗4℃過(guò)夜,TBST洗滌3次,每次10 min,孵育二抗室溫1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 4組家兔狀態(tài)比較 除A組外,給藥3 d后,剩余3組家兔均出現(xiàn)不同程度脫毛;B組兔毛枯燥暗淡,少量脫落,進(jìn)食未受影響;C組和D組家兔精神萎靡,進(jìn)食減少,面部毛發(fā)脫落嚴(yán)重,C組在建模2周后有所恢復(fù),D組內(nèi)有2只家兔在給藥5 d后死亡。

2.2 4組家兔體質(zhì)量比較 造模前,A、B、C、D組家兔體質(zhì)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺造模3周后,C組和D組家兔體質(zhì)量均低于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組家兔體質(zhì)量比較

2.3 4組家兔卵巢長(zhǎng)徑及卵巢指數(shù)比較 經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺造模3周后,C組和D組家兔卵巢長(zhǎng)徑均短于A組,卵巢指數(shù)均小于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組家兔卵巢長(zhǎng)徑和卵巢指數(shù)比較

2.4 4組家兔各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)及閉鎖卵泡占比比較 A組卵巢卵泡數(shù)量多,各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞排列規(guī)則,多為生長(zhǎng)卵泡,閉鎖卵泡數(shù)量少;B組原始和初級(jí)卵泡數(shù)量少于A組(P<0.05),竇卵泡形態(tài)不規(guī)則,閉鎖卵泡數(shù)量多于A組(P<0.05);C組、D組卵泡總數(shù)減少,原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡數(shù)量少于A組(P<0.05),次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞排列雜亂,竇卵泡形態(tài)不規(guī)則,異常卵泡增多,閉鎖卵泡數(shù)量多于A組(P<0.05)。C組和D組閉鎖卵泡占比高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 4組家兔各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)和閉鎖卵泡占比比較

2.5 4組家兔血清雌二醇及促卵泡生成素水平比較 經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺造模3周后,C組和D組雌二醇水平低于A組,促卵泡生成素水平高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 4組家兔血清雌二醇和促卵泡生成素水平比較

2.6 4組家兔卵巢組織Bax及Bcl2蛋白表達(dá)水平比較 與A組比較,B、C、D組Bax蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),Bcl2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 4組家兔卵巢組織Bax和Bcl2蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

卵巢功能衰退是一種常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病,常引起原發(fā)或繼發(fā)不孕、低雌激素癥狀,如潮熱、多汗、性欲減退等,不僅會(huì)引起女性生殖內(nèi)分泌功能障礙,還嚴(yán)重影響育齡婦女的身心健康和生活質(zhì)量[15]。POI是卵巢早衰的早期階段,如果在卵巢損傷更嚴(yán)重之前實(shí)施有效的治療措施,能夠避免或延緩卵巢早衰的發(fā)生。

建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型是治療研究的重要前提,目前,實(shí)驗(yàn)研究采用各種方法造模。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),切除新生小鼠的胸腺后,絕大多數(shù)的小鼠出現(xiàn)自身免疫性卵巢炎癥及卵巢早衰[16]。在使用D-半乳糖建立卵巢早衰模型時(shí),小鼠動(dòng)情周期出現(xiàn)紊亂,卵泡減少,與臨床患者卵泡丟失、閉鎖、不排卵癥狀相符[9]。有研究表明,敲除小鼠PTEN基因后,小鼠原始卵泡減少,促卵泡生成素激素水平升高[10]。有研究通過(guò)腹腔注射環(huán)磷酰胺建立POI大鼠模型,單次注射50 mg/kg后、每天8 mg/kg連續(xù)注射8 d得到了理想模型,大鼠卵巢功能明顯衰退,卵巢組織學(xué)及內(nèi)分泌變化均最接近臨床卵巢早衰患者[17]。

大多數(shù)研究選用大鼠或小鼠建立動(dòng)物模型,本研究使用新西蘭白兔模擬化療藥物損傷卵巢模型,因?yàn)榧彝寐殉步M織更大,各級(jí)卵泡數(shù)量更多,卵母細(xì)胞更接近人類(lèi)的大小。耳緣靜脈采血方便,對(duì)動(dòng)物損傷小,符合動(dòng)物倫理學(xué)要求,還可進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)激素水平的監(jiān)測(cè)。本研究通過(guò)3種不同的給藥劑量建立POI模型,相較于A組,B組家兔原始和初級(jí)卵泡數(shù)量減少,閉鎖卵泡數(shù)量增多,但體質(zhì)量、卵巢長(zhǎng)徑、卵巢指數(shù)、激素水平、各級(jí)卵泡數(shù)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明這種給藥劑量對(duì)家兔整體影響較小,對(duì)卵巢的破壞較輕,無(wú)法用于建模。C組兔毛部分脫落,體質(zhì)量下降較為平穩(wěn),卵巢受損嚴(yán)重,卵巢指數(shù)、卵泡數(shù)量、雌二醇和促卵泡生成素激素水平與A組比較差異明顯,更加符合POI的自然變化情況,更適宜建立POI模型。D組家兔卵巢受損情況嚴(yán)重,雖然激素水平、卵泡數(shù)量與A組具有顯著差異,但家兔狀態(tài)較差,進(jìn)食量少,兔毛脫落嚴(yán)重,耐受性差,不適合用于造模進(jìn)行后續(xù)研究。

綜上所述,50 mg/kg連續(xù)腹腔注射環(huán)磷酰胺3 d是建立化療損傷性POI家兔模型的最佳濃度,該方法簡(jiǎn)便易行,卵巢損傷較穩(wěn)定,動(dòng)物耐受性好,能夠用于評(píng)估POI不同治療方案的預(yù)后效果,為臨床研究提供理論支持。