秦媛，林業(yè)宏，侯穎怡，王偉瑜，張凱，鄭善堅*

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.浙江省野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實驗室，浙江 金華 321004）

放逸短溝蜷（Semisulcospira libertine），又稱青螄，為軟體動物門、腹足綱、前鰓亞綱、新進(jìn)腹足超目、短溝蜷科、短溝蜷屬[1]的淡水螺類。放逸短溝蜷肉質(zhì)鮮嫩可口、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，生活于水體清澈、水溫較低的山區(qū)溪流中，喜附著于水中石塊上，以刮食藻類為生。其對水質(zhì)要求較高，是良好的環(huán)境監(jiān)測指示物種。

銅離子（Cu2+）是生物必需微量元素之一，適量的Cu2+可與蛋白質(zhì)中的巰基結(jié)合，從而干擾巰基酶活性[2]，殺滅病原體，可以保持水生動物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；而過量的Cu2+會導(dǎo)致水生動物的機(jī)體結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生異常，導(dǎo)致其產(chǎn)生各種病變和疾病[3]。分子態(tài)氨具有脂溶性和不帶電的性質(zhì)，可以很容易地通過細(xì)胞膜，擴(kuò)散到生物血液和組織中，從而會形成血氨中毒[4]。氨對水生螺的毒性大于亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，且相對于部分蝦類、水蚤類、甲殼類等水生無脊椎動物而言，螺類對氨更具有耐受性[5]。

為了解水體中氨氮和Cu2+脅迫對放逸短溝蜷的影響，現(xiàn)開展2 種環(huán)境因子對放逸短溝蜷的急性毒性試驗以及在氨氮和Cu2+脅迫下生理指標(biāo)測定，評估放逸短溝蜷的毒性響應(yīng)，以期為今后放逸短溝蜷的人工養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐，為水環(huán)境氨氮和重金屬Cu2+污染的生態(tài)風(fēng)險評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 時間與地點(diǎn)

2021 年7 月。試驗地位于浙江師范大學(xué)浙江省野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實驗室。

1.2 樣本

放逸短溝蜷采集自浙江開化，平均殼長為（18.20±2.03）cm，平均殼寬為（9.53±1.71）cm，于水槽（38 cm×28 cm×15 cm）內(nèi)暫養(yǎng)，水溫（25±1）℃，pH 值為（7.5±0.1）。

1.3 急性毒性試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定藥物質(zhì)量濃度范圍，按照等比數(shù)列間距，設(shè)置藥物的質(zhì)量濃度梯度。每種藥物設(shè)置5 個濃度梯度，ρ（Cu2+）為0，0.25，0.50，1.00和2.00 mg/L；ρ（氨氮）為0，16，32，64 和128 mg/L，0 為對照組，其他濃度為處理組。每個濃度梯度的養(yǎng)殖槽，放入20 只經(jīng)暫養(yǎng)健康的放逸短溝蜷。每個濃度設(shè)置3 個平行組。

試驗藥物分別為硫酸銅（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR）和氯化銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR）配成的1，10 g/L 母液溶液。

將放逸短溝蜷暫養(yǎng)48 h 后，在38 cm×28 cm×15 cm 的養(yǎng)殖槽中進(jìn)行試驗。試驗用水為經(jīng)沉淀、砂濾、曝氣后的自來水，水溫（25±1）℃，pH 值為（7.5±0.1），維持自然光照。試驗周期為48 h，每12 h 更換試驗藥物溶液1 次。試驗期間不投喂。試驗開始后分別于6，12，24，30，36 和48 h 記錄死亡數(shù)量，清除死亡個體并計算死亡率。

1.4 超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和丙二醛活性的測定

根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，分別設(shè)置Cu2+濃度依次為0（對照組），0.25（低濃度組）和1.00 mg/L（高濃度組）。氨氮濃度依次為0（對照組），32（低濃度組）和128 mg/L（高濃度組）；每個濃度梯度設(shè)置3 個平行，每個濃度的養(yǎng)殖槽中放置20 只放逸短溝蜷。試驗期間，水溫（25±1）℃，pH 值為（7.5±0.1）。每12 h更換對應(yīng)藥物濃度的溶液。

在試驗開始后的12，24，36 和48 h，分別從每組中隨機(jī)取3 只放逸短溝蜷，敲破螺殼，取出放逸短溝蜷的肝臟，按1∶9 的比例，加入勻漿介質(zhì)0.9%的生理鹽水，于4 000 r/min 離心10 min，取上清液用于各項酶活性及含量的測定。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT）的活性，以及丙二醛（MDA）含量的測定，均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2021 分析處理后，使用SPSS 26.0 計算半致死濃度（LC50）、絕對致死濃度（LC100）和95%置信區(qū)間。安全濃度（SC）的計算公式采用96 h LC50計算[6]：

水體中分子氨對放逸短溝蜷的脅迫有著重要的作用，其含量用下式表示[7]：

式中：pKa——離解常數(shù)；

pH——pH 值。

式中：T——熱力學(xué)溫度，K；T=273+t；

t——試驗水溫，℃。

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用SPSS 26.0。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），處理間若有顯著差異，再用Duncan 法比較均值間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對放逸短溝蜷的急性毒性效應(yīng)

本試驗發(fā)現(xiàn)，在氨氮脅迫下，隨著藥物濃度的增加或脅迫時間的延長，放逸短溝蜷的攝食量減少，爬壁行為減少，逐漸翻背，最后死亡。氨氮對放逸短溝蜷的致死效應(yīng)見表1。由表1 可見，ρ（氨氮）較低且在短時間內(nèi)脅迫時，各組放逸短溝蜷并未出現(xiàn)死亡。但隨著ρ（氨氮）增加和脅迫時間的延長，放逸短溝蜷的死亡率也逐漸增加。說明當(dāng)水體中含有一定濃度的氨氮時，會對放逸短溝蜷產(chǎn)生一定的致死作用。經(jīng)統(tǒng)計分析可得，氨氮脅迫對短溝蜷48 h LC50為35.51 mg/L，SC 為3.51 mg/L。

表1 氨氮對放逸短溝蜷的致死效應(yīng)

2.2 Cu2+對放逸短溝蜷的急性毒性效應(yīng)

本試驗中，與一些軟體動物類似，在Cu2+脅迫下，放逸短溝蜷先是“假死”狀態(tài)，然后緩慢移動，隨著藥物濃度增加或時間的延長，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，沉于水底，身體僵硬，最后死亡。Cu2+對放逸短溝蜷的致死效應(yīng)見表2。由表2 可見，低濃度的Cu2+脅迫的時間較短時，各組放逸短溝蜷未出現(xiàn)死亡。但隨著ρ（Cu2+）的增加，且高濃度的Cu2+作用的時間延長時，放逸短溝蜷的死亡率也逐漸上升。說明Cu2+對放逸短溝蜷的致死作用與藥物的濃度和藥物脅迫時間長短有關(guān)。

表2 Cu2+對放逸短溝蜷的致死效應(yīng)

經(jīng)統(tǒng)計分析可得，Cu2+對放逸短溝蜷48 h LC50為0.835 mg/L，SC 為0.083 5 mg/L。

2.3 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟CAT 活性

Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟CAT 活性見圖1（a）（b），由圖1 可見，在Cu2+脅迫下，各Cu2+處理組放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性均比對照組低，且隨著脅迫時間的延長，CAT 活性呈現(xiàn)先降低后升高又降低的波浪式變化。各時間低、高濃度組的CAT 活性均顯著低于對照組（P<0.05）。當(dāng)0.25 mg/L Cu2+處理組和1 mg/L Cu2+處理組脅迫到36 h 時，CAT 活性略有回升，但仍低于對照組。在氨氮脅迫下，氨氮處理組放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性均顯著低于對照組（P<0.05），在氨氮的處理濃度分別為32 和128 mg/L 時，隨時間的增加，放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性均呈現(xiàn)了先降低后升高的趨勢。當(dāng)放逸短溝蜷分別在Cu2+和氨氮處理后，其肝臟的CAT 活性均低于對照組，說明在一定程度上2 種藥物對放逸短溝蜷肝臟的CAT 活性產(chǎn)生了抑制作用。

圖1 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟CAT 活性

2.4 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟SOD 活性

Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟SOD 活性的影響見圖2（a）（b）。由圖2 可見，各Cu2+處理組放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性，均顯著低于對照組（P＜0.05）。ρ（Cu2+）為0.25 mg/L、12～24 h 時，放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性升高，隨著時間的延長，SOD 活性呈先降低后升高的趨勢，說明一定濃度的Cu2+對SOD的活性存在促進(jìn)作用。ρ（Cu2+）為1.00 mg/L 的處理組中，放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性整體呈先降低后升高的趨勢。ρ（氨氮）為32 和128 mg/L 時，放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且各處理組SOD 活性顯著低于對照組（P＜0.05）。在處理后48 h 時，ρ（氨氮）為128 mg/L 的處理組放逸短溝蜷肝臟的SOD 活性低于對照組，對SOD 活性具有抑制作用。

圖2 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟SOD 活性的影響

2.5 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟MDA 含量

Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟MDA 含量的影響見圖3（a）（b）。由圖3 可見，在Cu2+脅迫下，ρ（Cu2+）為0.25 和1.00 mg/L 處理組中，放逸短溝蜷肝臟的MDA 含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；隨著處理時間的增加，處理組放逸短溝蜷肝臟的MDA 含量均增加。在氨氮脅迫下，處理組放逸短溝蜷肝臟MDA的活性均顯著高于對照組（P＜0.05），氨氮質(zhì)量濃度為32 和128 mg/L 的處理組中，隨著時間的增加，放逸短溝蜷肝臟的MDA 含量逐漸上升。當(dāng)放逸短溝蜷在Cu2+和氨氮的脅迫下，其肝臟的MDA 含量會隨時間的增加而累積。

圖3 Cu2+、氨氮對放逸短溝蜷肝臟MDA 含量的影響

3 討論

3.1 氨氮和Cu2+對放逸短溝蜷的急性致毒效應(yīng)特征

在氨氮和Cu2+脅迫下，生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[8]，MDA 是其主要代謝產(chǎn)物。MDA 是一種細(xì)胞膜被氧化破壞的指示物，很大程度上可反映出生物受脅迫的程度[9]。MDA 與抗氧化酶可反映出放逸短溝蜷的機(jī)體受損程度。放逸短溝蜷肝臟產(chǎn)生的MDA 使脫氧核糖核酸、膜蛋白和酶產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，增加了膜的通透性，從而改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響膜的功能和代謝，損傷細(xì)胞[10]。本試驗中，由于過剩的活性氧自由基會攻擊不飽和脂肪酸雙鍵，使肝臟膜磷脂中的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而MDA 的含量上升[11]。

在抵御氧化性損傷中，SOD 是一種金屬酶[8]，具有抗氧化防御的功能，能夠催化超氧陰離子自由基歧化，使其生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中有著重要的作用。SOD 可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御功能以及機(jī)體的免疫功能[12]。CAT 是生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一，可以催化H2O2分解為水和氧，保護(hù)生物體組織免受毒害[13]。因此SOD 和CAT的活性變化會作為指示污染脅迫的重要標(biāo)志物[14]。

3.2 Cu2+對放逸短溝蜷急性毒性的效應(yīng)

在本試驗中，隨著Cu2+濃度的逐漸提高，放逸短溝蜷的死亡率隨之上升。在高濃度Cu2+的脅迫下，放逸短溝蜷肝臟的CAT 和SOD 活性要顯著低于對照組，抑制了CAT 和SOD 的活性，且其肝臟的MDA 含量也較對照組高。重金屬Cu2+是屬于劇毒型的金屬，容易被生物體吸收，并且對環(huán)境有持久性影響，從而影響水生動物的生理和行為。硫酸銅常被用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中[15]，當(dāng)硫酸銅在動物體內(nèi)富集到一定程度時，就會對生物體有毒害作用，導(dǎo)致水生動物Cu2+中毒，已經(jīng)成為重金屬污染物[16]。2014年，有研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫下，方形環(huán)棱螺移動緩慢，隨著時間的延長，大多數(shù)螺會厴緊縮且不再移動，繼而死亡[17]。

3.3 氨氮對放逸短溝蜷急性毒性的效應(yīng)

本試驗中，放逸短溝蜷肝臟的CAT 和SOD 活性受到抑制，其肝臟MDA 含量大量增加。氨氮濃度越高，其毒性越強(qiáng)，放逸短溝蜷死亡率越高。因此，在養(yǎng)殖過程中要盡量降低養(yǎng)殖水體中氨氮的濃度。當(dāng)魚受到輕度的環(huán)境脅迫時，會誘導(dǎo)SOD 活性，當(dāng)受到重度環(huán)境脅迫時，SOD 活性會被抑制[18]。氨氮由2 種不同的化學(xué)物質(zhì)組成，即離子態(tài)銨和游離的分子態(tài)氨[19]，其中離子態(tài)銨是水體中的主要營養(yǎng)鹽類，對放逸短溝蜷的影響小，游離的分子態(tài)氨則是水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中的有毒有害物質(zhì)，其平衡受pH 值、水溫、鹽度、CO2等因子的影響[20]。由于分子態(tài)氨為親脂性分子，半徑較小，容易穿透生物膜的疏水性微孔進(jìn)入生物肝臟，對魚貝類的生長繁殖帶來危害[4，21-22]，同時也使其抵抗力和免疫力降低[23-24]。分子態(tài)氨可以降低魚類的能量代謝，對其鰓、肝等組織造成損傷[25]，使其呼吸困難，最后出現(xiàn)器官衰竭等生理毒性反應(yīng)[26]。

4 結(jié)語

本試驗表明，放逸短溝蜷對高濃度的重金屬Cu2+和氨氮較為敏感。因此，在進(jìn)行放逸短溝蜷人工育苗時，應(yīng)要注意對水質(zhì)的監(jiān)測，將水體重金屬Cu2+和氨氮的含量控制在安全濃度范圍內(nèi)，防止水體中有高濃度的重金屬Cu2+和較高含量的氨氮，對放逸短溝蜷造成脅迫，甚至產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，從而降低其成活率，導(dǎo)致育苗失敗。