陳攀，劉龍勛，沈華建，劉豫皖，林晨潔，黃海*

（1.海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點實驗室，海南 三亞 572022；2.海南熱帶海洋學(xué)院海洋科學(xué)技術(shù)學(xué)院，海南 三亞 572022）

銀鼓魚（Selenotoca multifasciata），又名多紋錢蝶魚，隸屬于鱸形目（Perciformes）、金錢魚科（Scatophagidae）、錢蝶魚屬（Selenotoca），廣泛分布于印度尼西亞、泰國、大洋洲及我國東海南部至南海和北部灣的沿海、河口地區(qū)。其體表有多個黑色圓點，體色呈亮白色，兼具觀賞和食用價值。該魚具有生長速度快、廣鹽、廣溫、可進(jìn)行混養(yǎng)和密養(yǎng)等特點，養(yǎng)殖前景廣闊，深受養(yǎng)殖戶歡迎[1]。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的不斷提高以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化等，銀鼓魚的病害日趨頻發(fā)。車輪蟲（Trichodina）病、淀粉卵甲藻（Amyloodinium ocellatum）病、吸蟲（Trematoda）病、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）病等，均對其養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的危害[2-4]。

2021 年7 月，在海南陵水養(yǎng)殖基地發(fā)現(xiàn)銀鼓魚出現(xiàn)疑似腸道炎癥，為了解銀鼓魚的致病原因，采集了患病銀鼓魚樣本，對其進(jìn)行了病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗，旨在為該疾病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚來自海南陵水德林誠信水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。采集3 尾發(fā)病魚，平均體質(zhì)量為（75.1±2.2）g，平均體長為（21.1±0.47）cm。人工回歸感染試驗用魚共約200 尾，平均體質(zhì)量為（55.2±8.9）g，平均體長為（15.3±1.4）cm。帶回實驗室暫養(yǎng)于養(yǎng)殖桶中，水溫為24～26 ℃，持續(xù)供氧，每天換1/3 水，暫養(yǎng)2 周。

1.2 試劑和儀器

AI6058027 桌面式超凈臺（蘇凈安泰有限公司）、DYY-8C 電泳儀（北京六一儀器廠）、革蘭染色液（北京酷來搏科技有限公司）、生理生化鑒定盒（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）、牛肉浸膏（北京索萊寶科技有限公司）、胰蛋白胨（北京索萊寶科技有限公司）、瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）、藥敏紙片（上海源葉生物科技有限公司）、TCBS 培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園淄博生物技術(shù)有限公司）、酵母浸膏（北京索萊寶科技有限公司）、比濁管（比克曼生物科技有限公司）、磁珠菌種保存管（青島高科技工業(yè)園淄博生物技術(shù)有限公司）、細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、瓊脂糖（太陽馬）。

1.3 病原菌的分離和純化

將發(fā)病魚置于超凈工作臺，先對魚體消毒，然后用接種環(huán)在病灶組織中接菌，隨后劃線于普通肉湯營養(yǎng)固體培養(yǎng)基和TCBS 固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落生長情況；之后挑單菌落置于LB 液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24 h 后，吸取菌液約0.2 mL 進(jìn)行平板涂布；隨后，挑取獲得的單菌落，用固體培養(yǎng)基進(jìn)行劃線培養(yǎng)，并保存于4 ℃冰箱中，供長期試驗；其余挑取部分單菌落，使用磁珠菌種保存管，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 人工回歸感染試驗

將菌株重新活化置于人工氣候箱培養(yǎng)，然后從活化后的平板挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)24 h 后，將所獲得的菌液于5 000 r/min 離心3 min 后，倒掉培養(yǎng)基，留下菌液沉淀，再倒入無菌生理鹽水，重復(fù)以上步驟進(jìn)行第2 次離心。離心結(jié)束后，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行調(diào)整，將菌液濃度調(diào)整為1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103cfu/mL。從養(yǎng)殖桶中隨機(jī)選取180 尾健康活躍的銀鼓魚，放養(yǎng)于49 cm×34 cm×30 cm 水族箱中，每箱10 尾，持續(xù)供氧，暫養(yǎng)12 h。感染試驗共分成6 組，5 組感染和1 組對照，每組3 個重復(fù)。采用腹腔注射法，感染組每尾注射0.2 mL 菌懸液，對照組每尾注射0.2 mL 滅菌生理鹽水。在感染期間，每日換水1/3，正常投喂餌料，并進(jìn)行日常殘餌和糞便清理，隨時觀察記錄銀鼓魚發(fā)病情況，將瀕死的病魚進(jìn)行解剖，觀察其病理癥狀并記錄。隨后用接種環(huán)挑取魚體內(nèi)明顯病變組織，劃線培養(yǎng)于TCBS，并與感染菌株進(jìn)行對比，對菌株初步鑒定。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)觀察

將1.3 中分離純化的菌株置于29 ℃人工氣候箱恒溫培養(yǎng)，待長成菌落后，觀察記錄菌落形態(tài)、干濕度、透明度、顏色、邊緣、直徑以及液體培養(yǎng)基生長情況等。隨后在超凈工作臺上挑取些許菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察病原菌染色結(jié)果及菌體形態(tài)特征。

1.5.2 病原菌生理生化試驗

將固體培養(yǎng)基上的菌株接種進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后根據(jù)生化反應(yīng)管操作說明書，分別接種至細(xì)菌生理生化微量鑒定管中進(jìn)行測定，隨后放置于29 ℃人工氣候箱中，培養(yǎng)24 h，按照生化反應(yīng)管說明書及《第八版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》比對結(jié)果，并記錄。

1.5.3 16SrRNA 片段擴(kuò)增及序列分析

在超凈工作臺中，從活化后的平板上挑取單菌落，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，提取菌株基因組DNA，提取步驟按照說明書。隨后以細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物作為引物（表1），以1 μL DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)如下：95 ℃5 min；96 ℃20 s；62 ℃20 s；72 ℃30 s，循環(huán)35 次；72 ℃再延伸10 min。隨后將3 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶大小。產(chǎn)物純化根據(jù)磁珠純化標(biāo)準(zhǔn)步驟，然后將純化后的產(chǎn)物送至六合華大基因科技有限公司測序，將所獲得序列結(jié)果于NCBI進(jìn)行blast 比較，利用Mega7.0 采用鄰接法進(jìn)行菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

表1 引物信息

1.6 病原菌生長

用接種環(huán)挑取活化后的單菌落置于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。采用紫外分光光度計，測量菌液各時間段的吸光度值（OD），同時設(shè)置空白對照，最后以吸光度值作為縱坐標(biāo)，生長時間作為橫坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線。

1.7 藥敏試驗

將菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng)12 h，然后再從平板中取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌株生長對數(shù)期，隨后，取樣制備菌懸液，用移液槍吸取0.2 mL 置于平板中央，用涂布器將菌液以逆時針方向進(jìn)行涂布展開，然后將選擇好的藥敏片黏貼在含菌液的培養(yǎng)基表面，倒置培養(yǎng)1～2 d，隨后取出測量其形成的抑菌圈的直徑，并根據(jù)抑菌范圍判斷菌株對各類藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚癥狀

患病魚體色正常，體表零星分布出血點，主要集中在背鰭、臀鰭和尾鰭基部。腹腔積水呈黃色；肝臟腫大，部分糜爛；膽囊顏色加深且腫脹；脾臟紅腫；腎臟暗紅；腸壁充血、彈性差，具有明顯炎癥且?guī)в邪妆?，見圖1（a）（b）。

2.2 病原菌分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

從病魚腸道中分離出1 種優(yōu)勢病原菌株。劃線培養(yǎng)1 d 后觀察菌落，結(jié)果顯示，菌落呈黃白色，卵圓、濕潤、不透明，菌落邊緣鋸齒狀，直徑約1～2 mm，具一定運動性，在液體培養(yǎng)基上呈渾濁生長。菌體似桿狀，革蘭染色陰性，TCBS 顯黃色，見圖2（a）（b）（c）（d）。

圖2 菌株形態(tài)觀察

2.3 人工回歸感染試驗

試驗組注射后，在1～2 d，個別魚出現(xiàn)游泳遲鈍、偶爾沉底、有明顯溜邊現(xiàn)象，與對照組相比，魚體色明顯暗淡；3～4 d，試驗魚變得更加不活躍，身體翻轉(zhuǎn)、動作遲鈍，喜趴于氣石附近不動，進(jìn)食緩慢，無食欲，個別魚出現(xiàn)亢奮不安，不停探頭；5～8 d，試驗魚大都出現(xiàn)沉底、翻邊等異常行為，有些魚出現(xiàn)脹腹現(xiàn)象，瀕死的魚除了鰭部有少量充血，其余無明顯變化；9～11 d，出現(xiàn)上下游動頻繁、上下打圈游動、食欲較差現(xiàn)象；12～14 d，多數(shù)魚出現(xiàn)不游的情況，偶爾出現(xiàn)魚體側(cè)面與缸底平行游動倒翻沉底的現(xiàn)象，至14 d 累計死亡率為30.0%～66.6%。對照組無死亡。采用寇氏法計算出病原菌的半致死濃度為2.18×106cfu/mL，見圖3。

圖3 分離菌株感染銀鼓魚的試驗結(jié)果

通過對每日瀕死魚體進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)其癥狀基本一致，主要集中表現(xiàn)為鰓呈暗紅色，肝、腎臟紅腫，有部分糜爛，脾臟發(fā)腫，腸道擴(kuò)張且腸道內(nèi)有淡黃色液體，腸壁上略微充血，膽囊腫大且顏色加深，見圖4（a）（b）（c）（d）。這些發(fā)病癥狀與原發(fā)病癥基本一致。從病灶部位處接菌劃線培養(yǎng)于TCBS，其與初次分離的菌株在形態(tài)和特征方面基本一致。

圖4 回歸感染銀鼓魚癥狀

2.4 病原菌的鑒定

2.4.1 生理生化試驗

對照細(xì)菌生理生化試劑盒中的參考標(biāo)準(zhǔn)，分離菌對水楊素、蔗糖、精氨酸脫羧酶呈陽性且液化明膠，而對于蛋白胨水、賴氨酸脫羧酶和葡萄糖呈陰性（表2）。查閱《第八版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，發(fā)現(xiàn)分離菌與腸弧菌屬的生理生化特性類似，初步認(rèn)定該菌株為腸弧菌屬。

表2 生理生化的反應(yīng)結(jié)果①

2.4.2 16SrRNA 片段擴(kuò)增及序列分析

提取分離菌株DNA，進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果顯示，菌株條帶清晰明亮，表明了試驗過程中所提取菌株質(zhì)量較好（圖5）。對經(jīng)PCR 擴(kuò)增后的序列進(jìn)行測序，得到基因序列片段長度為1 405 bp，隨后采用NCBI網(wǎng)站中的blast 程序，對序列進(jìn)行親緣關(guān)系進(jìn)行比對，結(jié)果表明，分離菌與黑腸弧菌（Enterovibrio nigricans）HG326496.1 的16S rRNA 基因序列相似性為99.0%，菌株序列同源性＞99%的都是黑腸弧菌，序列號為JEMV1X63013。利用Mega7.0 軟件擴(kuò)增序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，分離菌與黑腸弧菌HG326496.1 聚類處于同一進(jìn)化分支，并且與黑腸弧菌（MZ474660.1、MN785681.1、MN7856741.1、MN7856771.1）親緣關(guān)系較近（圖6），因此可確認(rèn)此次分離菌株為黑腸弧菌。

圖5 分離菌瓊脂糖電泳圖

圖6 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 分離菌生長

將分離菌株連續(xù)培養(yǎng)9 h，結(jié)果表明，菌株自1 h就開始對數(shù)生長，2.5 h 對數(shù)期結(jié)束，并于3～6 h 內(nèi)處于穩(wěn)定期，6～9 h 內(nèi)菌株則處在衰亡期（圖7）。

圖7 分離菌生長曲線

2.6 藥敏試驗

21 種抗生素對分離病菌藥敏試驗結(jié)果表明（表3），菌珠對派啦西林、頭孢派酮、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、萬古霉素、慶大霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、米諾環(huán)素、卡那霉素、四環(huán)素高度敏感，而對于諾氟沙星、羧芐西林、苯唑西林、復(fù)方新諾明、頭孢克肟、頭孢吡肟、氨芐西林、青霉素、頭孢呋辛和甲氧芐氨嘧啶表現(xiàn)為不敏感。

表3 菌株對藥物的敏感性①

3 討論

魚類腸炎病是養(yǎng)殖過程中發(fā)生頻率及死亡率均較高的疾病，伴有發(fā)病速度快、病程短等特點，時常對養(yǎng)殖企業(yè)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前，較多文獻(xiàn)報道顯示，導(dǎo)致魚類患腸炎病的致病病原主要為腸型點狀氣單胞菌、發(fā)光致病桿菌、霍亂弧菌、鯊魚弧菌、哈維氏弧菌，副溶血弧菌、腸道黏孢子等[6-11]。主要表現(xiàn)為食欲不振或不進(jìn)食、精神萎靡不振、活動異常、體質(zhì)減弱。解剖后發(fā)現(xiàn)，各臟器均有不同程度出血和充血，腸管出血較為明顯并伴有明顯的炎癥，后腸充滿黃色黏液，肝臟出現(xiàn)明顯病變。本試驗從患病銀鼓魚腸道內(nèi)分離出致病菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化和16SrRNA 序列分析方法，確認(rèn)該菌為黑腸弧菌。人工回感試驗表明，黑腸弧菌可導(dǎo)致健康銀鼓魚發(fā)病死亡。病理解剖發(fā)現(xiàn)，其感染癥狀與原發(fā)病癥極為相似，表現(xiàn)為肝、腎臟紅腫，腸壁上充血等癥狀，與劉德建等[12]和楊移斌[13]所描述的魚體腸道炎癥相似，確認(rèn)該菌可導(dǎo)致魚體腸道發(fā)炎。且其他的病理癥狀除了與原發(fā)病癥相似外，也與陳翠珍等[14]從牙鲆腸道中分離出弧菌感染病癥類似。至14 d 累積死亡率為30.0%～66.6%，初步判斷其具有一定致病力。

黑腸弧菌（E. nigricans），隸屬于腸弧菌屬，目前關(guān)于該菌的國內(nèi)外報道較少，主要集中在該菌分類地位[15-18]。Pascual 等[15]指出，黑腸弧菌在系統(tǒng)發(fā)育上與卡爾文弧菌屬有親緣關(guān)系。目前國內(nèi)外未見黑腸弧菌在魚類感染致病方面的報道。本試驗首次發(fā)現(xiàn)黑腸弧菌可引發(fā)銀鼓魚腸炎病，初步確認(rèn)其為導(dǎo)致原發(fā)病癥的主要致病菌。

為篩選黑腸弧菌的敏感藥物，方便相應(yīng)養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行施藥治療。本試驗采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對派啦西林、頭孢派酮等11 種抗生素高度敏感，而對諾氟沙星等10 種抗生素不敏感。根據(jù)藥物敏感程度和養(yǎng)殖企業(yè)的使用成本，建議使用氟苯尼考和派啦西林對銀鼓魚腸炎進(jìn)行治療。此外中草藥在治療腸炎病方面應(yīng)用普遍且效果較好，如黃柏、黃芩、黃連、五倍子、槐花、穿心蓮、大蒜素、松枝葉、菖蒲、板藍(lán)根和大黃等[19-22]。中草藥具有低毒、無害、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[23]，并且施用方便，深受廣大養(yǎng)殖戶的喜愛。在治療時，也需注意給藥劑量。一般魚類在出現(xiàn)腸道發(fā)炎時，其攝食量會大大降低，如果按照單位餌料質(zhì)量計算用藥量，極易導(dǎo)致內(nèi)服藥投喂量不足，造成治療效果較差[24]。因而需根據(jù)發(fā)病魚的體質(zhì)量來確定給藥量，再依據(jù)其日攝食量多少，制成藥餌投喂?？傊诩膊〉姆乐芜^程中，對于藥物的選擇和施用量方面，要依據(jù)“三效”（高效、速效、長效）、“三小”（毒性小、副作用小、劑量?。┖汀盁o三致“（無致畸、無致癌、無致突變）的原則，保證藥物的使用綠色高效，促進(jìn)健康養(yǎng)殖。