孟耀文，黃國強*，吳若寧，陸潔，蘇興，鐘聲平

（1.廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院，廣西 南寧 530200；2.防城港市金沙科技有限責任公司，廣西 防城港 538000；3.廣西海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，廣西 北海 536000）

文獻[1]研究表明，無特定病原（SPF）或特定抗病性（SPR）蝦苗有利于養(yǎng)殖成功，但仍不能完全避免疾病的流行。對蝦病害的病原種類較多，傳播途徑復雜且易于引入和繁殖，而SPF 或SPR針對的病原數(shù)量較少。對蝦病毒性疾病無法治療，只能預防。近年來，對蝦養(yǎng)殖技術系統(tǒng)的開發(fā)設計主要圍繞其病害預防。但這些系統(tǒng)一般只是殺滅蝦池水體中的病原，較難實現(xiàn)對病原的全面殺滅。同時，由于對蝦病害病原的復雜性，很多細菌如弧菌（Vibrion），也易引起暴發(fā)性疾病。隨著食品安全要求的提高，很多藥物已經(jīng)被禁止用于水產養(yǎng)殖動物疾病防治。因此，迫切需要開發(fā)無公害水產藥物。

納米銀（AgNPs），是采用納米技術合成的粒徑在l～100 nm 的金屬銀單質。經(jīng)納米化處理的抑菌材料，較大的比表面積和小尺寸效應，極大提高了對細菌表面的吸附性和滲透性，殺菌作用比普通銀提高了數(shù)百倍[2]。納米材料廣泛用于預防水產養(yǎng)殖動物的病害。如馬尾藻多糖脂質體納米制劑，對南美白對蝦（Litopenaeus Vannamei）有免疫促進作用，可提高其對白斑病毒和桃拉病毒的抗病力[3]。用山楂提取物合成的納米銀，對鰻弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及點狀氣單胞菌等4 種典型的水產病原菌，有顯著的抑制和殺滅作用[2]，采用銀杏葉綠色合成納米銀，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、水產病原菌遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均有很好的抑菌作用[4]，納米銀對哈維氏弧菌有很好的抑制作用[5]。因此，納米銀具有抗菌譜廣、抗菌性強、生物安全性高、不易產生耐藥性等優(yōu)點，作為水產動物疾病防控的藥物，具有明顯優(yōu)勢，并已經(jīng)有商業(yè)產品供應。

目前，關于納米銀在對蝦養(yǎng)殖中的生物安全性和環(huán)境安全性，尚未見系統(tǒng)報道。現(xiàn)對商業(yè)納米銀產品在南美白對蝦養(yǎng)殖中的急性毒性、對弧菌類的殺滅和抑制作用，以及可能導致的水環(huán)境和養(yǎng)殖產品銀累積進行研究。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2022 年8 月至12 月。試驗地位于廣西海洋研究所有限公司。

1.2 材料

預試驗采用容積為2 L 的6 個塑料小桶，正式試驗采用18 個容積為10 L 的塑料養(yǎng)殖箱。試驗使用的納米銀是由廣西防城港市金沙海洋科技有限公司生產的“金沙納米銀”商業(yè)納米銀產品（液態(tài)）。

1.3 毒性試驗

1.3.1 預試驗

6 個塑料小桶均加入海水1 L，然后每個桶依次加入濃度為0，0.5，5.0，50.0，500.0 和5 000.0 mL/m3的納米銀，持續(xù)充氣10 min，使納米銀和水體混合均勻，每個桶放入10 尾全長0.7～0.8 cm 的蝦苗后開始計時，在24，48 和96 h 時，檢查各桶蝦苗的存活情況。試驗水溫28 ℃，鹽度2.5%。96 h 時，ρ（納米銀）＜50.0 mL/m3的桶沒有蝦苗死亡，＞500.0 mL/m3的桶有蝦苗死亡。由此判斷，納米銀對蝦苗的急性毒性可能較低，引起蝦苗死亡的最低濃度為50.0～500.0 mL/m3，要設置較大的濃度范圍，才能使蝦苗的死亡率從較低水平達到90%以上。

1.3.2 正式試驗

在預試驗的基礎上，設置推薦濃度（0.5 mL/m3）0，500，1 000，2 000，4 000 和8 000 倍6 個濃度，每個濃度3 個重復。其余試驗條件與預試驗一致。18 個養(yǎng)殖箱均加滿海水，每3 個箱加1 種濃度的納米銀充氣10 min 混勻后，各箱均放入100 尾活力好的蝦苗，開始計時，在24，48 和96 h 時檢查對蝦死亡情況。對死亡率與納米銀藥物濃度進行回歸分析，并根據(jù)回歸關系計算半致死濃度（LC50）。

1.4 樣品采集

1.4.1 水體

以純凈水為對照，采集周邊天然海水、周邊養(yǎng)殖蝦池水樣和試驗養(yǎng)殖蝦池水樣，每類樣品都采集15 份，分別根據(jù)弧菌培養(yǎng)和銀含量測定要求，進行處理和保存。

1.4.2 南美白對蝦

養(yǎng)殖試驗為分段式養(yǎng)殖，于2022 年8—11 月，在廣西精工海洋科技有限竹林鹽場基地進行。設置5 個初始養(yǎng)殖密度，分別為D1（100 ind/m2）、D2（400 ind/m2）、D3（900 ind/m2）、D4（1 600 ind/m2）、D5（2 500 ind/m2）。養(yǎng)殖期間，每隔10 d，將0.5 mL/m3納米銀加水混勻后潑灑到養(yǎng)殖池。試驗結束時，采集蝦樣品，每個處理各15 尾；養(yǎng)殖期間，收集基地周邊養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖蝦樣品6 份（每份15 尾），竹林鹽場臨近海區(qū)捕撈的長毛對蝦（Penaeus penicillatus, P.P）、寬溝對蝦（Penaeus latisulcatus, P.L）、周氏新對蝦（Metapenaeus joyneri, M.J）、墨吉對蝦（Fenneropenaeus merguiensis, F.M）樣品各30 尾，以及超市出售的蝦皮—中國毛蝦（Acetes chinensis,A.C）500 g，按弧菌培養(yǎng)和銀含量測定要求進行處理和保存。

1.5 弧菌密度檢測

弧菌檢測，使用常德比克曼生物科技有限公司生產的水產弧菌檢測試劑盒培養(yǎng)計數(shù)?；静僮黜樞蛉缦拢河靡埔簶屓? mL 水體，涂布到每個平板上，36 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h 后，用放大鏡對菌落進行計數(shù)。將對蝦稱質量后，按體質量1∶9 比例加入生理鹽水，勻漿后靜置10 min，取1 mL 上清液涂布到每個平板上，36 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h 后，用放大鏡對菌落進行計數(shù)。計數(shù)的弧菌為副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis），4 種弧菌數(shù)相加得到總弧菌數(shù)。

1.6 銀濃度檢測

水樣和蝦體的銀濃度，用單四極桿電感耦合等離子體質譜儀（SQ-ICP-MS）（賽默飛世爾）測定。水樣直接測定；將對蝦樣品烘干、粉碎后，過孔徑為0.178 mm 篩網(wǎng)，經(jīng)消解后取消解液測定。

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0 進行統(tǒng)計分析，對結果進行單因素方差分析，采用Duncan’S 多重比較分析不同處理間的差異，以P＜0.05 作為差異顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 納米銀對蝦苗的急性毒性

蝦苗死亡率與納米銀推薦使用濃度（0.5 mL/m3）倍數(shù)的關系見圖1（a）（b）。由圖1 可見，納米銀對蝦苗的96 h LC50為推薦使用濃度的2 241.54倍，48 h LC50為推薦使用濃度的5 421.70 倍。96 h和48 h 的安全濃度（SC）（按0.05 的應用系數(shù)）分別為56.04 和135.54 mL/m3，均遠高于推薦使用濃度。由此可見，在推薦使用濃度范圍內，金沙納米銀對對蝦不會產生毒副作用。文獻[6]中，5～11 nm 的納米銀對南美白對蝦苗的24h LC50為91 mg/L；而250 mg/L、20 nm 納米銀，28 d 對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的致死率為43%[7]；5 d 內10 000 mg/L 的10～55 nm 納米銀，對淡水蟹（Potamanautes perlatus）成體的致死率為70%[8]；而60～120 nm 的納米銀，對淡水蟹（Paratelphusa jacquemontii）成體96 h LC50為0.77 mg/L[9]。由此可見，納米銀對水生甲殼動物的毒性，與納米銀粒徑、生物種類等相關。由于本試驗采用的商業(yè)產品濃度，不是納米銀的直接濃度，因而得到產品的LC50和SC 較高。

圖1 蝦苗死亡率與納米銀推薦使用濃度倍數(shù)的關系

2.2 納米銀處理對水體弧菌數(shù)量的影響

納米銀對大腸桿菌（Escherichia coli）等多種病原菌的最小抑制濃度為12.5～140.0 mg/L，隨納米銀粒徑和病原種類而變化[10]。弧菌是對蝦的重要病原菌群，已有研究[2，4，11]表明，不同類型的納米銀材料對多種弧菌在內的水產病原菌，有顯著的殺滅、抑制作用。本試驗中，純凈水（CJS）培養(yǎng)未見弧菌，天然海水（TRHS）有少量弧菌，添加了納米銀的養(yǎng)殖水（NMYYZS）比天然海水弧菌數(shù)量多，周邊蝦池水（ZBXCS）的各類弧菌數(shù)量明顯比天然海水和試驗養(yǎng)殖水多（圖2）。由此可見，金沙納米銀對南美白對蝦養(yǎng)殖水體中的弧菌，具有明顯的殺滅和抑制作用。

圖2 不同水體弧菌密度

2.3 納米銀對水體弧菌的殺滅效果

金沙納米銀對水體弧菌殺滅效果見表1。由表1可見，周邊蝦池水體中有很多的各類弧菌，總弧菌密度達到1 407 cells/mL，副溶血弧菌密度為37.89 cells/mL，創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、河弧菌密度分別為351.58，154.21 和864.21 cells/mL。在用0.5 mL/m3的金沙納米銀消毒劑處理24 h 后，各類弧菌的數(shù)量都顯著減少，其中副溶血弧菌完全被殺滅。因此，使用納米銀藥物來殺滅養(yǎng)殖水體中的病原微生物，能夠起到較好的作用。

表1 金沙納米銀對水體弧菌殺滅效果①cells/mL

2.4 納米銀對對蝦體內弧菌數(shù)量的影響

不同環(huán)境對蝦體內弧菌數(shù)量見圖3。由圖3 可見，在按推薦方法（每10 d 添加0.5 mL/m3）使用金沙納米銀產品的養(yǎng)殖池中，試驗養(yǎng)殖蝦（TS）體內的總弧菌數(shù)和各類弧菌數(shù)比較少，而周邊未使用納米銀產品的養(yǎng)殖蝦（CS）體內的各類弧菌和總弧菌數(shù)都較多，周邊海區(qū)捕獲的野生蝦類長毛對蝦（P.P）、寬溝對蝦（P.L）、周氏新對蝦（M.J）的弧菌數(shù)量比試驗養(yǎng)殖蝦多，比周邊蝦池的養(yǎng)殖蝦少。由于檢測的弧菌對對蝦來說是致病菌，因此，試驗結果表明，使用金沙納米銀作為疾病預防的藥物，能夠提高養(yǎng)殖生物的安全性。

圖3 不同環(huán)境對蝦體內弧菌數(shù)量

2.5 納米銀對水體銀濃度的影響

金沙納米銀對水體銀濃度的影響見表2。由表2 可見，周邊天然海水的銀濃度較低，僅為0.02～0.04 μg/L；用金沙納米銀處理后的天然海水銀濃度，隨使用后時間的延長而降低，由120.91 降低至98.90 μg/L；試驗養(yǎng)殖水體的銀含量為91.73 μg/L，而周邊蝦池水體未檢出銀濃度。

表2 金沙納米銀對水體銀濃度的影響

納米銀優(yōu)良的抗菌特性，為人類的多領域應用提供了便利，但同時也對不同類群的水生生物具有不同程度的毒性[12-22]。作為一種貴重的重金屬，銀一般不作為環(huán)境中污染物的指標，但在工業(yè)領域的廢水排放中有限制標準，如文獻[23-25]等規(guī)定，總銀的排放標準為0.3 或0.5 mg/L。而海洋環(huán)境相關質量標準，如文獻[26-27]未對其含量做出規(guī)定。本試驗結果表明，納米銀藥物會將少量的銀排放到環(huán)境中。

2.6 納米銀對蝦體銀含量的影響

Griffitt 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚鰓和身體的納米銀累積量與暴露的濃度正相關。虹鱒（Oncorhynchus mykiss）經(jīng)10 d 的納米銀暴露后，鰓和肝臟中的納米銀含量可達到＜2 μg/g 的水平[29]。本試驗養(yǎng)殖蝦每100 g 銀含量為20～35 μg，并隨養(yǎng)殖密度的增加而升高。周邊的養(yǎng)殖蝦銀含量極低，周邊野生的蝦類墨吉對蝦（F.M）、寬溝對蝦（P.L）、中國毛蝦（A.C）每100 g 銀含量低于10 μg（圖4）。因此，使用了納米銀產品的養(yǎng)殖蝦的銀累積量相對較低。作為一種貴金屬，銀在食品[30]或食品添加劑[31]中的含量未做出限量規(guī)定，但過高的銀含量是否會對養(yǎng)殖對蝦的生理活動產生不良影響，以及對其食品安全性產生影響，需要進一步研究。

圖4 試驗養(yǎng)殖蝦與野生蝦每100 g 銀含量

3 結語

納米銀類藥物由于具有良好的吸附性和滲透性，可作為抑菌和殺菌藥物。本試驗表明，金沙納米銀藥物對蝦苗具有較高的安全濃度，并對水體和蝦體的副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、河弧菌都有明顯的殺滅和抑制作用，可作為一種極有潛力的對蝦養(yǎng)殖病害預防藥物。但金沙納米銀藥物會引起養(yǎng)殖水體和養(yǎng)殖對蝦銀含量的增加，其可能存在的環(huán)境和食品安全風險，需要加強關注。