高 源,孫佳彤,周晨光,姜立泉,李 偉,李 爽*

(1.林木遺傳育種全國重點實驗室(東北林業(yè)大學),黑龍江 哈爾濱 150040;2.遼寧省森林經(jīng)營研究所,遼寧 丹東 118000)

木材是重要的工業(yè)生產(chǎn)原料,是制漿造紙、房屋建造以及家具制造的關(guān)鍵原材料。因此,對木材的研究以及獲取具有優(yōu)良木材的良種刻不容緩。木材的形成是一個連續(xù)且復雜的過程,包括維管形成層分裂分化、次生細胞壁加厚、細胞壁木質(zhì)化、細胞程序化死亡,最后形成木材[1-2]。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF),是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的特殊結(jié)構(gòu)蛋白,在植物生長過程中的各個生物進程均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-5]。木材的形成離不開轉(zhuǎn)錄因子的精確調(diào)控,不同轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用構(gòu)成木材形成過程中復雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡[6-15]。已有研究報道,一些轉(zhuǎn)錄因子家族在次生細胞壁形成的過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用,如NAC、MYB、WRKY、bHLH、LBD轉(zhuǎn)錄因子家族等[16-21]。毛果楊(Populustrichocarpa)NAC家族PtrSND1轉(zhuǎn)錄因子可直接調(diào)控MYB家族轉(zhuǎn)錄因子PtrMYB074,進而影響木材的形成[6, 8]。最新的研究結(jié)果表明,PtrMYB074轉(zhuǎn)錄因子可以與PtrWRKY19轉(zhuǎn)錄因子互作,并被其招募到下游PtrbHLH186啟動子上,促進PtrbHLH186的表達[21]。在毛果楊中PtrbHLH186基因過表達后,植株出現(xiàn)木材形成異常,具體表現(xiàn)為植株生長遲緩、木質(zhì)部導管細胞小而多、木質(zhì)化程度提高、木質(zhì)素含量增加等[21]。以上結(jié)果表明,毛果楊PtrbHLH186轉(zhuǎn)錄因子作為木材形成NAC、MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的下游因子,在木材形成過程中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,是木材形成的關(guān)鍵調(diào)控因子之一,但是其調(diào)控的下游基因及其生物功能研究尚不明確。

LBD(lateral organ boundaries domain)是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,具有高度保守的LOB(lateral organ domain)結(jié)構(gòu)域[22]。有研究表明,在調(diào)控木質(zhì)部分化關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子NAC-Domain7(VND7)介導的木材形成途徑中,也有該家族轉(zhuǎn)錄因子AtLBD30的參與[23]。毛白楊(P.tomentosa)中,PtaLBD1過量表達使轉(zhuǎn)基因植株次生韌皮部增厚;此外,PtaLBD4在次生韌皮部特異表達,PtaLBD15、PtaLBD18在次生木質(zhì)部特異表達[24]。說明毛白楊LBD家族轉(zhuǎn)錄因子參與木材形成的調(diào)控過程。毛果楊中,PtrLBD39在應拉木中轉(zhuǎn)錄水平最高,PtrLBD39及其同源基因PtrLBD22功能缺失突變體的應拉木形成區(qū)域明顯減少,木質(zhì)素的含量增多且纖維素含量減少,表明PtrLBD39和PtrLBD22是應拉木形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[25]。目前,在多種植物尤其是擬南芥(Arabidopsisthaliana)中都有關(guān)于LBD轉(zhuǎn)錄因子的研究,但仍有大量LBD的功能是未知的[26]。

東北林業(yè)大學林木遺傳育種全國重點實驗室研究團隊前期獲得了木材形成關(guān)鍵調(diào)控基因PtrbHLH186的過表達植株,收集其木質(zhì)部材料進行了RNA-seq和ChIP-seq分析,篩選出了PtrbHLH186調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子PtrLBD12。但PtrLBD12是否參與木材形成的調(diào)控過程以及在木材形成過程中的生物學功能尚不清楚。因此,本研究創(chuàng)制了毛果楊PtrLBD12過表達植株,對其生長及木材形成特征進行了觀察分析,初步揭示該基因在木材形成過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為東北林業(yè)大學林木遺傳育種全國重點實驗室保存的毛果楊植株,基因型為Nisqually-1。用次氯酸鈉對野生型毛果楊側(cè)枝進行消毒,經(jīng)植物組織培養(yǎng)進行芽誘導,獲得無菌毛果楊組培苗[27]。組織培養(yǎng)條件:溫度25 ℃,光強約40 μmol/(m2·s),光周期為16 h光照/8 h黑暗。溫室培養(yǎng)條件:溫度范圍22～25 ℃,光量子強度約300 μmol/(m2·s),光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 毛果楊PtrLBD12基因的克隆與分析

毛果楊PtrLBD12基因的克隆。利用PtrLBD12基因序列號在毛果楊基因組網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中獲取該基因完整的序列信息。設計該基因特異性引物(表1),利用PCR擴增目的片段并連接到pENTR/TOPO載體上,測序驗證PtrLBD12序列。

表1 所用引物及序列

毛果楊PtrLBD12基因特異性表達分析。用于基因組織特異性表達分析的數(shù)據(jù)來源于Yeh等[15]發(fā)表的數(shù)據(jù)信息。

1.3 毛果楊PtrLBD12瞬時表達載體構(gòu)建及亞細胞定位

毛果楊PtrLBD12基因瞬時表達載體的構(gòu)建。以pENTR/TOPO-PtrLBD12質(zhì)粒為模板,進行目的片段的擴增和回收。利用XbaI和XhoI酶切目的基因和pUC19-35S-GFP瞬時表達載體,37 ℃水浴2 h。通過凝膠電泳驗證酶切產(chǎn)物正確后,回收進行T4連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序。獲得的載體利用氯化銫-溴化乙錠超高速梯度密度離心法提取質(zhì)粒。

亞細胞定位。本研究毛果楊木質(zhì)部原生質(zhì)體的酶解和轉(zhuǎn)化方法參照Lin等[28]建立的原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系。取4段8～9 cm毛果楊野生型莖段,扒皮后放入酶解液中室溫靜置酶解3 h。通過MMG溶液(0.5 mol/L甘露醇,4 mmol/L MES, 15 mmol/L氯化鎂)釋放并收集原生質(zhì)體,稀釋至2×105個細胞/mL。以1∶10∶11(體積比)比例依次加入pUC19-35S-PtrLBD12-GFP質(zhì)粒及細胞核定位質(zhì)粒pUC19-35S-H2A-mCherry、原生質(zhì)體、聚乙二醇(PEG)溶液,混勻后靜置10 min。終止反應后重懸,移入細胞培養(yǎng)板避光過夜培養(yǎng),利用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.4 毛果楊PtrLBD12基因過表達植株創(chuàng)制

毛果楊PtrLBD12基因過表達載體構(gòu)建。帶有BamHI和SacI酶切位點的PtrLBD12CDS序列構(gòu)建到35S啟動子介導的植物表達載體pBI121上,特異性引物序列見表1,方法同上述載體構(gòu)建方法。利用35S-F引物和pBI121-LBD12-R引物進行檢測并測序(表1),即得pBI121-35S-PtrLBD12載體。

通過農(nóng)桿菌介導的毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)制PtrLBD12過量表達轉(zhuǎn)基因植株。將測序正確的pBI121-35S-PtrLBD12質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中。選用35S-F和基因R端引物進行單克隆的檢測,挑取檢測正確克隆搖菌保存。毛果楊的遺傳轉(zhuǎn)化過程參照已經(jīng)建立的方法[8, 21, 27]。

DNA水平鑒定毛果楊PtrLBD12過表達植株。以抗性植株葉片DNA為模板,分別以載體pBI121引物35S-F及PtrLBD12基因R端引物進行PCR擴增,選擇毛果楊野生型植株DNA、水和pBI121-35S-PtrLBD12質(zhì)粒作為對照進行凝膠電泳分析。

RNA水平鑒定毛果楊PtrLBD12過表達植株。收集轉(zhuǎn)基因和野生型植株木質(zhì)部,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄,以毛果楊PtrActin7基因作為內(nèi)參,定量PCR分析PtrLBD12在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平。

1.5 毛果楊PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子的功能分析

PtrLBD12過表達毛果楊植株生長指標的測定。將組培瓶中生長至5～8 cm高的OE-PtrLBD12-L1轉(zhuǎn)基因植株和同齡的野生型毛果楊植株移栽到溫室中,觀察PtrLBD12轉(zhuǎn)基因植株的表型。對生長30、60、90 d的野生型以及PtrLBD12轉(zhuǎn)基因植株進行拍照,測定12株野生型及PtrLBD12轉(zhuǎn)基因植株的生長指標,包括樹高、地徑、莖節(jié)數(shù)以及第8莖節(jié)長度,共3次生物學重復,通過SPSS統(tǒng)計分析PtrLBD12轉(zhuǎn)基因植株的生長指標。

通過石蠟切片觀察PtrLBD12過表達植株莖干細胞。選取同齡轉(zhuǎn)基因及野生型溫室植株第2、4、6、8莖節(jié)的中間區(qū)域,將每個莖段切成厚度為0.8～1.0 cm小段,放入預冷的固定液西林瓶中。置于冰上真空固定,并進行脫水、透明、浸蠟,浸蠟后包埋莖段并切片,利用番紅、固綠和甲苯胺藍水溶液染色,染色后用樹脂封片,使用軟件萊卡LAS V4.8和LAS X V2.0對組織染色后的石蠟切片橫切面進行圖像采集并統(tǒng)計分析,隨機取3個野生型和轉(zhuǎn)基因植株的第8莖節(jié)的橫切面,每個橫切面隨機選3個等比例的區(qū)域,統(tǒng)計單位面積(mm2)導管、纖維細胞的數(shù)量及導管細胞平均孔徑大小(μm2)。

木質(zhì)素單體合成酶基因表達水平分析。提取培養(yǎng)4個月的毛果楊野生型及PtrLBD12過表達植株的木質(zhì)部總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,設計木質(zhì)素單體合成酶基因的特異性定量引物(表2),通過定量PCR及2△△Ct計算法分析PtrLBD12基因的過表達植株中木質(zhì)素單體合成酶基因的表達情況。

表2 木質(zhì)素單體合成酶基因定量引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrLBD12基因的獲得

前期研究中獲得了毛果楊木材形成關(guān)鍵調(diào)控基因PtrbHLH186過表達植株的木質(zhì)部組織RNA-seq以及ChIP-seq數(shù)據(jù),通過對RNA-seq以及ChIP-seq數(shù)據(jù)的整合分析,篩選出了PtrbHLH186結(jié)合并調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子PtrLBD12。

利用毛果楊木質(zhì)部、韌皮部、頂芽和葉片不同組織對PtrLBD12基因的表達模式進行分析,結(jié)果顯示PtrLBD12基因在木質(zhì)部和韌皮部中表達明顯高于其他組織(圖1)。推測PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子在木質(zhì)部和韌皮部中發(fā)揮一定的調(diào)控作用,參與木材形成過程的調(diào)控。為了進一步分析其功能,本研究通過基因克隆和測序驗證,獲得了PtrLBD12基因894 bp的CDS序列。

誤差線代表3個生物學重復的SE值。Error bars represent SE values of three independent experiments. *.P<0.05. 圖1 PtrLBD12基因在毛果楊4種組織中的表達水平Fig. 1 The transcript abundance of PtrLBD12 in four tissues of Populus trichocarpa

2.2 毛果楊PtrLBD12的亞細胞定位

為了進一步揭示PtrLBD12蛋白的表達特征,將PtrLBD12融合綠色熒光蛋白(GFP)構(gòu)建到由組成型啟動子35S驅(qū)動的瞬時表達載體pUC19上,獲得pUC19-35S-PtrLBD12-GFP載體。選用融合櫻桃紅熒光蛋白(mCherry)的組蛋白H2A作為細胞核定位標記蛋白。提取質(zhì)粒后,通過PEG介導的毛果楊木質(zhì)部原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化法[28],將pUC19-35S-PtrLBD12-GFP和pUC19-35S-H2A-mCherry共同轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體中。結(jié)果顯示,代表PtrLBD12蛋白的綠色熒光信號與組蛋白H2A-mCherry紅色熒光信號完全重合。說明毛果楊PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中表達,具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特征(圖2)。

圖2 毛果楊PtrLBD12亞細胞定位Fig. 2 Subcellular localization of PtrLBD12 in P. trichocarpa

2.3 毛果楊PtrLBD12過表達植株的創(chuàng)制

毛果楊PtrLBD12過表達植株見圖3。其過程為將PtrLBD12基因的CDS序列連接到35S啟動子介導的pBI121植物表達載體中,成功獲得植物表達載體pBI121-35S-PtrLBD12。將pBI121-35S-PtrLBD12載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中,通過農(nóng)桿菌介導的毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化方法創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因植株。將侵染并共培養(yǎng)后的外植體使用頭孢霉素溶液和清水清洗脫去農(nóng)桿菌(圖3a),置于含抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月左右誘導抗性芽的發(fā)生(圖3b),將莖段兩端生長出的抗性芽放入抗性生根培養(yǎng)基進行初步篩選。將可在抗性培養(yǎng)基中生根的抗性芽再次移入新的抗性生根培養(yǎng)基中,2次生根后進行后續(xù)的DNA和RNA水平鑒定(圖3c)。提取抗性植株葉片的DNA,以載體引物35S-F和PtrLBD12的R端引物PCR擴增,凝膠電泳檢測。結(jié)果表明以抗性植株葉片DNA為模板的樣品擴增出與pBI121-35S-PtrLBD12質(zhì)粒為模板大小一致的目的條帶,而以水及野生型葉片為模板的陰性對照泳道無條帶,表明PtrLBD12基因已成功整合到抗性植株的基因組中(圖3d)。分別收集轉(zhuǎn)基因和野生型毛果楊溫室植株的木質(zhì)部,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,通過相對定量在轉(zhuǎn)錄水平上分析PtrLBD12基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平。與野生型相比,OE-PtrLBD12-L1的相對表達量為40.91,L2為79.51,L3為102.19,表明這些轉(zhuǎn)基因植株中PtrLBD12基因的表達水平均明顯上調(diào)(圖3e)。

a.愈傷組織分化誘導callus induction;b. 抗性芽誘導shoot induction;c. 抗性植株篩選the screening of the kanamycin-resistant plants;d. 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定identification of transgenic plants by PCR(M. DNA marker DL2000;1. ddH2O為模板的陰性對照 negative control with ddH2O as PCR template;2. PBI121-35S-PtrLBD12質(zhì)粒為模板的陽性對照positive control with plasmid PBI121-35S-PtrLBD12 as PCR template;3. 野生型毛果楊葉片DNA為模板的陰性對照negative control with leaf DNA of wild-type plant as PCR template;4—6. 抗性植株葉片DNA為模板的樣品sample with leaf DNA of kanamycin-resistant plant as PCR template);e. 過量表達植株中PtrLBD12基因的相對表達水平relative expression levels of PtrLBD12 gene in overexpression plants。*.P<0.05,**.P<0.01。下同。The same below.圖3 毛果楊轉(zhuǎn)基因植株的獲得Fig. 3 Generation of P. trichocarpa transgenic plant

2.4 毛果楊PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子的功能分析

為了初步了解PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能,對已獲得的過表達PtrLBD12-L1植株和野生型對照同時移栽到溫室中,觀察其生長情況。對生長至30、60、90 d的植株生長指標進行測定。與野生型毛果楊相比,PtrLBD12過表達植株高度較矮(圖4a、4b),植株地徑、莖節(jié)數(shù)、第8莖節(jié)長度均明顯降低(圖4b)。說明PtrLBD12基因過表達影響了毛果楊的正常生長發(fā)育。

a. 生長30、60、90 d的毛果楊野生型與PtrLBD12過表達植株的表型觀察 phenotypic observations of P. trichocarpa wild-type and PtrLBD12 overexpression plants at 30, 60 and 90 days;b. 不同生長時期的毛果楊野生型與過表達PtrLBD12植株的生長指標測定 growth indicators determination of wild-type and PtrLBD12 overexpression plants at different growth periods。圖4 毛果楊野生型和過量表達植株生長表型分析Fig. 4 Growth phenotype analysis of P. trichocarpa wild-type and OE-PtrLBD12 plants

為了進一步分析PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子是否影響木材形成過程,對溫室培養(yǎng)4個月的過表達和野生型植株的第2、4、6、8莖節(jié)進行石蠟切片,利用番紅固綠對染法對莖干橫切面進行染色觀察(圖5a)。木質(zhì)部細胞壁中的木質(zhì)素在番紅染料的染色下呈現(xiàn)紫紅色,纖維素在固綠染料的染色下呈現(xiàn)藍綠色,且染色深淺與木質(zhì)素、纖維素含量成正相關(guān)。切片分析發(fā)現(xiàn),毛果楊中PtrLBD12過表達后,第2莖節(jié)開始出現(xiàn)少量的導管細胞,未分化出纖維細胞,而野生型植株的第2莖節(jié)并未出現(xiàn)導管和纖維細胞;轉(zhuǎn)基因植株第4莖節(jié)分化出4～5層均勻排列的導管細胞,而野生型則剛開始分化出1～2層導管細胞;轉(zhuǎn)基因植株第6莖節(jié)出現(xiàn)明顯的纖維細胞,而野生型僅有少量纖維細胞出現(xiàn),且轉(zhuǎn)基因植株紫紅色的木質(zhì)化區(qū)域明顯寬于野生型,PtrLBD12過表達植株莖干木質(zhì)化程度增強;轉(zhuǎn)基因植株第8莖節(jié)導管細胞和纖維細胞均發(fā)育完全,與野生型無明顯差異。通過對染料著色程度的對比觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株第6和8莖節(jié)中紅色著色明顯比野生型植株深,說明PtrLBD12過表達后木質(zhì)素沉積被增強。

a. 培養(yǎng)4個月的毛果楊野生型(WT)與(OE-PtrLBD12-L1)過表達植株番紅固綠染色(紅色線條代表木質(zhì)部寬度,比例尺為100 μm) stem cross sections and magnified images of 4-month old OE-PtrLBD12-L1 and wild-type plants (The cross sections were stained with safranin O and fast green, the red lines represent the width of the xylem, bar is 100 μm);b. 野生型(WT)和過表達(OE-PtrLBD12-L1)毛果楊各莖節(jié)形成層細胞形態(tài)觀察(比例尺為50 μm) morphological observation of cambium cells in WT and OE-PtrLBD12-L1(Bar is 50 μm);c. 野生型和過表達植株導管和纖維細胞數(shù)量統(tǒng)計(黑色點所示部分為導管細胞,比例尺為50 μm) statistics on the number of vessel and fiber cells in wild and overexpressed plants (The part shown in the black dots are vessel cells, bar is 50 μm);d. 單位面積細胞數(shù)目統(tǒng)計 statistics analysis of cell number in per unit area;e. 導管孔徑大小統(tǒng)計 statistics analysis of vessel lumen area。圖5 毛果楊野生型與OE-PtrLBD12過表達植株組織切片表型觀察Fig. 5 Paraffin section observation of WT and OE-PtrLBD 12plants

為了方便清晰地觀察轉(zhuǎn)基因植株形成層及木質(zhì)部細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),用甲苯胺藍水溶液對OE-PtrLBD1過表達和野生型植株的第2、4、6、8莖節(jié)進行染色,觀察各莖節(jié)形成層細胞狀態(tài)(圖5b)。結(jié)果顯示,PtrLBD12過表達植株的形成層細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與野生型植株并沒有顯著變化。進一步對莖干橫截面單位面積內(nèi)導管細胞和纖維細胞數(shù)量、單個導管細胞的孔徑大小進行了統(tǒng)計分析(圖5c),結(jié)果顯示,過表達植株莖干橫切面單位面積內(nèi)導管和纖維細胞數(shù)量顯著增加(圖5d),導管孔徑明顯減小(圖5e)。這個結(jié)果表明,PtrLBD12基因的過表達影響了木質(zhì)部中導管和纖維細胞的數(shù)量及導管細胞孔徑的大小。

由于木材形成過程中,木質(zhì)素沉積的早晚及強弱直接影響木質(zhì)部細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),且根據(jù)切片結(jié)果得知,PtrLBD12基因的過量表達造成了木質(zhì)部細胞木質(zhì)素沉積模式發(fā)生改變。而毛果楊木質(zhì)素的生物合成依賴于22個木質(zhì)素單體合成相關(guān)酶基因的表達[29]。因此,本研究利用RT-qPCR檢測了PtrLBD12過表達植株木質(zhì)部中22個木質(zhì)素單體合成酶基因的相對表達水平(圖6)。結(jié)果顯示,PtrLBD12過表達使植株木質(zhì)部中PtrPAL1、PtrHCT6、PtrCSE2、PtrCCoAOMT1、PtrCCoAOMT2、PtrCCoAOMT3、PtrCCR2、PtrCAld5H1的表達水平顯著或極顯著升高,PtrC4H1、PtrC4H2、PtrCSE1基因的表達水平也有上調(diào)趨勢。因此,PtrLBD12可以促進木質(zhì)素合成酶基因的上調(diào)表達,增加植株木質(zhì)素的沉積。

圖6 PtrLBD12過表達植株中木質(zhì)素單體合成酶基因的相對表達水平Fig. 6 The relative expression levels of monolignol genes in OE-PtrLBD12 plants

3 討 論

木材是十分重要的工業(yè)原料,優(yōu)良材性林木新品種的選育是保證木材供應的重要策略。木材的形成受到眾多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,木材形成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及功能解析可為優(yōu)良木材材性良種的創(chuàng)制提供重要的理論依據(jù)及候選基因資源。LBD轉(zhuǎn)錄因子家族在高等植物中廣泛存在,它們在植物的生長發(fā)育、脅迫響應、次生生長等方面起著重要的作用。已有研究表明,LBD家族轉(zhuǎn)錄因子在木材形成方面發(fā)揮著廣泛的調(diào)控作用。如白楊中的PtaLBD1和PtaLBD4調(diào)控次生韌皮部的發(fā)育,而PtaLBD15、PtaLBD18參與木質(zhì)部的發(fā)育調(diào)控[24]。毛果楊中的PtrLBD39是應拉木形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[25]。

毛果楊PtrLBD12基因是木材形成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PtrbHLH186所結(jié)合并調(diào)控的下游基因。對其表達模式分析發(fā)現(xiàn),該基因在毛果楊的木質(zhì)部、韌皮部的表達水平顯著高于在根、葉組織的表達水平,推測轉(zhuǎn)錄因子PtrLBD12可能參與木材形成的調(diào)控過程。為了探究PtrLBD12的生物功能,本研究構(gòu)建了PtrLBD12的過量表達載體,并利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法創(chuàng)制了過量表達植株。生長表型分析發(fā)現(xiàn),PtrLBD12過表達導致毛果楊生長緩慢,株高、地徑、莖節(jié)數(shù)等生長指標與野生型相比均表現(xiàn)出明顯降低。結(jié)合組織切片和化學染色結(jié)果進一步分析,PtrLBD12過表達植株的木質(zhì)素沉積水平增加,木質(zhì)化程度增強。在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面,過表達植株莖干橫截面的單位面積內(nèi),纖維細胞和導管細胞的數(shù)量顯著增多,而導管的孔徑減小,形成層細胞則沒有明顯變化。

木質(zhì)素的沉積依賴于木質(zhì)素單體合成酶基因的表達,毛果楊中木質(zhì)素的生物合成由22個木質(zhì)素單體合成酶基因控制[29]。PtrLBD12過表達植株中木質(zhì)素單體合成酶基因PtrPAL1、PtrC4H1、PtrC4H2、PtrHCT6、PtrCSE1、PtrCSE2、PtrCCoAOMT1、PtrCCoAOMT2、PtrCCoAOMT3、PtrCCR2、PtrCAld5H1的轉(zhuǎn)錄水平被明顯促進。因此,毛果楊PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成酶相關(guān)基因的表達,改變植株木質(zhì)素的沉積。

根據(jù)Liu等[21]的研究,PtrLBD12基因上游的調(diào)控因子PtrbHLH186在毛果楊中作為MYB轉(zhuǎn)錄因子的下游因子參與木材形成的調(diào)控過程。PtrbHLH186基因的上調(diào)表達造成植株生長遲緩,木質(zhì)部導管細胞孔徑減少、數(shù)量增多,莖干木質(zhì)化程度增加,總木質(zhì)素含量增加[21]。本研究中PtrLBD12轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出的生長特征及木材細胞結(jié)構(gòu)特性與其上游調(diào)控基因PtrbHLH186轉(zhuǎn)基因植株一致。本研究雖然沒有對PtrLBD12轉(zhuǎn)基因植株的木材組分進行精確測定,但根據(jù)組織切片化學染色及木質(zhì)素單體合成酶基因的表達情況進行推測,轉(zhuǎn)錄因子PtrLBD12與PtrbHLH186可能具有相似的促進木質(zhì)素沉積的功能。因此,毛果楊PtrLBD12轉(zhuǎn)錄因子作為PtrbHLH186的下游靶基因在木材形成中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。

在干旱條件下,樹木莖干中的木質(zhì)部往往有著更多、更小的導管,這樣可以承受較低的水勢,防止木質(zhì)部導管的空化,從而更有效地傳輸水分[21,30]。Kasuga等[31]的研究證明,PtrbHLH186基因的上調(diào)表達使植株形成更多、更小的導管細胞,這樣的細胞特性增強了植株的耐旱能力。而PtrLBD12過表達毛果楊植株的導管細胞同樣具有這種特征,因此這種細胞特性的改變很有可能使轉(zhuǎn)基因植株具有更強的抵御干旱脅迫能力。此外,降低植株的生長量也是植物度過水分匱乏時期的重要應對策略。植株也會通過促進木質(zhì)素的合成從而抵御脅迫[32]。本研究中的過表達植株也表現(xiàn)出生長量降低、木質(zhì)素沉積受到促進的表型,這進一步說明了PtrLBD12過表達可能增強植物耐旱性。但PtrLBD12基因響應干旱脅迫的功能和機制等問題還需要進一步探究。

選育產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、抗性強、適應性廣的林木品種并應用于生產(chǎn)是未來林木遺傳育種的發(fā)展趨勢和重點方向[33]。本研究初步探討了轉(zhuǎn)錄因子PtrLBD12對毛果楊木材形成和生長發(fā)育的影響,明確了該基因?qū)顦淠举|(zhì)部細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響,為轉(zhuǎn)錄因子介導的木材形成調(diào)控機制的解析和林木的遺傳改良提供重要的理論線索,也為利用基因編輯等基因工程手段創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)、高抗、高產(chǎn)的林木新品種提供重要的、優(yōu)良的候選基因資源。