彭興華 李章紅 羅 列

（贛州市人民醫(yī)院心臟外科，江西 贛州 341000）

冠心病是臨床常見(jiàn)的心血管疾病，由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起的血管狹窄和阻塞所致。最常見(jiàn)的特征是心肌供血不足從而致使心臟缺血缺氧，甚至?xí)?dǎo)致一些心肌細(xì)胞的死亡［1］。該病嚴(yán)重威脅著患者的生命健康安全，更有甚者會(huì)導(dǎo)致猝死。近年來(lái)，中醫(yī)技術(shù)發(fā)展迅速，在治療冠心病方面，其效果在一定程度上較西醫(yī)更好［2］。目前，一些學(xué)者［3］發(fā)現(xiàn)，丹參中可以提取出一種名為丹酚酸鹽的成分，它可抵抗氧化自由基、抵抗血栓形成，對(duì)心血管系統(tǒng)有著較好的保護(hù)作用。此外，NF-κB通路是一種炎癥信號(hào)，是一種既能穩(wěn)定心臟內(nèi)環(huán)境，又能介導(dǎo)致病特異性反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［4］。但并未有研究指出丹參多酚酸鹽可以調(diào)控NF-κB 通路對(duì)冠心病心肌細(xì)胞凋亡有影響。因此，本研究就丹參多酚酸鹽對(duì)冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制進(jìn)行探討，以期為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取60 只健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量260 g 左右，飼養(yǎng)于無(wú)菌環(huán)境中（溫度：27 ℃左右；濕度：55%左右），自由進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將其隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、丹參多酚酸鹽低劑量組、丹參多酚酸鹽中劑量組、丹參多酚酸鹽高劑量組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品高脂飼料（江蘇協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司，20210712），垂體后葉素（南京新百藥業(yè)有限公司，150902），注射用丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050247），瑞舒伐他汀鈣片（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，H20143339）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（武漢塞維爾生物科技有限公司，G1017），蘇木精染色液（北京雷根生物科技有限公司，DH0041），ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，20200516），生理鹽水（石家莊四藥有限公司，1901023203），超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（上海邦奕生物科技有限公司，20201023），丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，20200504），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0012），脫脂奶（美國(guó)BD 公司，232100），鼠抗NF-κB p65、NF-κB 抗體、β-actin 抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司，bs-23216R、bs-3543R、bs-0061R），PCR檢測(cè)試劑盒（艾科瑞生物工程有限公司，AG11708-S）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)喂食高脂肪飲食并腹腔注射垂體后葉素建立模型。在連續(xù)6 周每天喂食高脂飼料后，每隔24 h 腹腔注射30 μg/kg 垂體后葉素，連續(xù)3 次。丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組分別給予50、150 和450 mg/L注射用丹參多酚酸鹽，陽(yáng)性對(duì)照組給予10 mg/kg 瑞舒伐他汀鈣片，對(duì)照組采用常規(guī)飲食。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 心肌梗死面積測(cè)定處死大鼠取出心臟并切片，未染色的組織為危險(xiǎn)區(qū)（AAR），分離后稱(chēng)重并在TTC溶液中孵育。染色后，正常心肌組織變?yōu)榇u紅色，而梗死心肌組織（IS）為灰白色。分離、稱(chēng)重IS，并計(jì)算IS/AAR以反映心肌梗死的大小。

1.5.2 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況收集的組織用石蠟包埋、切片并用蘇木精染色。然后在磷酸鹽緩沖液（PBS）中浸泡和洗滌2 次，向切片中加入50 μL TUNEL 反應(yīng)混合物，后用PBS 洗滌3 次，并在倒置顯微鏡下觀察組織細(xì)胞的凋亡情況，并計(jì)算凋亡率。

1.5.3 ELISA檢測(cè)心肌組織中炎性因子含量取心肌組織制備成勻漿，在4 ℃下以3000 r/min 離心10 min（離心半徑8.5 cm）。收集上清液，用ELISA 試劑盒檢測(cè)上清液中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。

1.5.4 檢測(cè)心肌組織SOD、MDA含量在預(yù)冷的生理鹽水中沖洗心肌組織，去除血液，用手術(shù)剪刀切斷心肌組織塊，并轉(zhuǎn)移至勻漿管，制成組織漿。3000 r/min 離心10 min（離心半徑8.5 cm）后，取上清液，根據(jù)每個(gè)試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)心肌組織的SOD活性和MDA含量。

1.5.5 WB檢測(cè)心肌組織相關(guān)蛋白含量取心肌組織加入組織蛋白提取物，4 ℃充分研磨，10 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），取上清。用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量。定量的蛋白樣品在凝膠電泳前煮沸變性，脫脂奶粉密封閉1 h，加入一抗孵育過(guò)夜，漂洗后標(biāo)記二抗反應(yīng)，發(fā)光顯色，凝膠成像儀曝光攝影。檢測(cè)NF-κB p65、NF-κB蛋白表達(dá)。

1.5.6 PCR檢測(cè)心肌組織NF-κB p65、NF-κB mRNA表達(dá)收集組織，然后加入RNAiso plus以提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明配置反轉(zhuǎn)錄體系以制備cDNA。通過(guò)20 μL 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，通過(guò)定量PCR 儀擴(kuò)增目的基因。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠IS/AAR情況比較與對(duì)照組比較，模型組IS/AAR 較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組IS/AAR 較低（P＜0.05），且隨著劑量的升高而降低；丹參多酚酸鹽高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.604，P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 6組冠心病模型大鼠IS/AAR情況比較（± s）

表1 6組冠心病模型大鼠IS/AAR情況比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組IS/AAR 0 0.79±0.101）0.52±0.092）0.40±0.082）0.20±0.062）0.20±0.052）鼠數(shù)10 10 10 10 10 10

2.2 6 組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較與對(duì)照組比較，模型組凋亡率較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組凋亡率較低（P＜0.05），且隨著劑量的升高而降低；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=209.506，P＞0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 6組冠心病模型大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較（×400）

表2 6組冠心病模型大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較（± s，%）

表2 6組冠心病模型大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較（± s，%）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

凋亡率2.35±0.20 42.69±5.411）36.84±4.392）28.69±2.572）20.06±51.632）20.00±1.052）組別對(duì)照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10

2.3 6 組大鼠炎性因子水平比較與對(duì)照組比較，模型組炎癥因子水平較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組炎癥因子水平較低（P＜0.05），且隨著劑量的升高而降低；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 6組冠心病模型大鼠炎癥因子水平比較 （± s，ng/L）

表3 6組冠心病模型大鼠炎癥因子水平比較 （± s，ng/L）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

TNF-α 4.48±1.06 80.47±3.151）62.50±2.542）50.05±3.052）24.41±3.152）24.00±3.602）組別對(duì)照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 IL-1β 0.85±0.18 8.15±0.221）6.28±0.412）4.84±0.262）3.02±0.202）3.00±0.162）IL-6 14.15±1.51 68.12±5.691）52.09±4.712）40.96±4.082）31.77±3.082）31.05±3.692）

2.4 6 組大鼠SOD活性及MDA含量比較與對(duì)照組比較，模型組SOD較低，MDA 較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組SOD 較高，MDA 較低（P＜0.05）；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 6組冠心病模型大鼠SOD活性及MDA含量比較（± s）

表4 6組冠心病模型大鼠SOD活性及MDA含量比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組MDA/（nmol/mg）8.02±1.25 16.41±3.521）14.36±3.402）12.47±3.072）10.42±1.512）10.40±1.062）鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 SOD/（U/mg）120.42±5.42 60.54±4.081）78.62±4.922）86.97±6.572）92.51±8.022）92.50±8.562）

2.5 6 組大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達(dá)比較與對(duì)照組比較，模型組NF-κB p65、NF-κB 蛋白表達(dá)較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組NF-κB p65、NF-κB 蛋白表達(dá)較低（P＜0.05）；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達(dá)比較

表5 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達(dá)比較（± s）

表5 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組NF-κB 0.41±0.10 1.52±0.121）1.21±0.112）0.92±0.082）0.71±0.052）0.70±0.072）鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 NF-κB p65 0.30±0.09 1.23±0.101）1.06±0.082）0.82±0.062）0.62±0.042）0.60±0.062）

2.6 6 組大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表達(dá)比較與對(duì)照組比較，模型組NF-κB p65、NF-κB mRNA 表達(dá)較高；與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組NF-κB p65、NF-κB mRNA 表達(dá)較低（P＜0.05）；高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6。

表6 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表達(dá)比較（± s)

表6 6組冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表達(dá)比較（± s)

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組NF-κB mRNA 1.00±0.05 5.05±1.021）4.05±0.852）3.16±0.502）2.74±0.322）2.70±0.352）鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 NF-κB p65 mRNA 1.00±0.06 3.22±0.501）2.85±0.412）2.03±0.322）1.85±0.262）1.82±0.272）

3 討論

冠心病是全球死亡率最高的疾病，丹參多酚酸鹽是中藥丹參最重要的有效成分，具有活血化瘀的作用，現(xiàn)廣泛用于冠心病、心絞痛等心血管疾?。?］。此外，還有研究［3］認(rèn)為，該藥物聯(lián)合瑞舒伐他汀可抑制機(jī)體血小板聚集；而該藥在一定程度上還能促進(jìn)血管的舒張、增加其通透性，避免心肌細(xì)胞異?，F(xiàn)象的發(fā)生，從而保證心肌供血供氧。因此文章進(jìn)行了以下探討。

在本研究中，對(duì)各組大鼠IS/AAR 進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示模型組IS/AAR 最高，丹參多酚酸鹽可改善IS/AAR，同樣在對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡中也發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽可以改善心肌細(xì)胞凋亡，表明丹參多酚酸鹽對(duì)冠心病的保護(hù)作用與改善凋亡有關(guān)，通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡從而改善急性心肌梗死后遠(yuǎn)期心功能［6］。除此之外，有研究［7］表明冠心病最主要的病理基礎(chǔ)就是炎癥反應(yīng)，它在該病出現(xiàn)血管損傷時(shí)扮演著重要的角色。而在本研究的炎癥因子水平觀察中也驗(yàn)證了模型組炎癥因子水平最高，丹參多酚酸鹽可降低炎癥因子水平這一結(jié)論。因此，抑制炎癥反應(yīng)中炎性因子釋放非常關(guān)鍵，而NF-κB 信號(hào)通路是抑制炎癥相關(guān)通路，早就有研究［8，9］發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸鹽注射液可以有效抑制炎癥因子的釋放和NF-κB 信號(hào)通路的活化，抵抗機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。SOD 一般在機(jī)體中存在范圍較廣，也是清除心肌組織氧化自由基的重要指標(biāo)。MDA則是氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)的最終產(chǎn)物，還可以間接地反映出細(xì)胞的損傷程度［10，11］。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽可以提高大鼠SOD 水平，降低MDA含量，與其結(jié)論一致。而在NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的檢測(cè)中，結(jié)果也顯示模型組NF-κB p65、NF-κB 蛋白及mRNA 表達(dá)最高，丹參多酚酸鹽可降低NF-κB p65、NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)，提示丹參多酚酸鹽可通過(guò)抑制NF-κB 通路傳導(dǎo)途徑，降低炎癥因子釋放以及氧化應(yīng)激損傷來(lái)達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的目的。

綜上所述，丹參多酚酸鹽可有效抑制冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌梗死面積，改善氧化應(yīng)激損傷，這可能是通過(guò)調(diào)控NF-κB 通路實(shí)現(xiàn)的，為冠心病的臨床治療提供了新的思路與理論研究支撐。