李 玥 陳俊逾

（新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院神志病科，新疆 烏魯木齊 830099）

鐵死亡是Dixon S 等［1］于2012 年提出的一種新的、鐵依賴性的細(xì)胞程序性死亡。不同于傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡，鐵死亡兼具凋亡和壞死的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞相互分離、變小變圓，細(xì)胞膜完整但發(fā)生聚縮，無(wú)核固縮，及線粒體皺縮、線粒體嵴減少甚至消失、線粒體膜密度增加、線粒體外膜破裂等［2］。鐵死亡現(xiàn)象廣泛存在于體細(xì)胞當(dāng)中，參與神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的發(fā)生；鐵蛋白自噬是由核受體共激活因子4（NCOA4）介導(dǎo)的鐵蛋白吞噬過(guò)程，即NCOA4的有效結(jié)構(gòu)域可以和鐵蛋白重鏈1 亞基（FTH1）結(jié)合，形成復(fù)合物，參與溶酶體自噬，從而在細(xì)胞內(nèi)釋放大量鐵離子［3］。已有研究［4］表明，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞（HT22）神經(jīng)毒性模型中，鐵蛋白自噬通量增加，NCOA4 和FTH1 共定位增加。目前有多種化合物被證實(shí)可以誘導(dǎo)鐵死亡，敲低NCOA4的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin的敏感性減低［5，6］。

姜黃醇是傳統(tǒng)中藥莪術(shù)中的活性成分，是一種具有生物活性的小分子倍半萜化合物［7］?；瘜W(xué)分離姜黃醇提取物后發(fā)現(xiàn)，姜黃醇中的酚羥基結(jié)構(gòu)是其抗氧化活性基礎(chǔ)；酚羥基甲基化具有對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的自由基清除作用，抗氧化物中酚羥基數(shù)越多，其抗氧化活性越強(qiáng)［8，9］。適當(dāng)劑量的姜黃醇可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制腦缺血再灌注損傷小鼠模型的海馬神經(jīng)元凋亡［10］。已有體外研究［11，12］證明，姜黃醇能夠調(diào)控非Caspases 依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，且可通過(guò)抑制Yes 相關(guān)蛋白（YAP）/NCOA4軸發(fā)揮抗鐵死亡作用。亦有系統(tǒng)藥理學(xué)研究［13］表明，姜黃醇可能通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮抗鐵死亡作用。基于此，本研究探究姜黃醇是否可以通過(guò)調(diào)控NCOA4 介導(dǎo)的自噬以調(diào)控鐵死亡，并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HT22細(xì)胞系購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0697-D）。

1.1.2 主要試劑與耗材姜黃醇、Erastin 均購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；NCOA4、半胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（xCT）、FTH1、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A 合成酶4（ACSL4）、β-actin抗體購(gòu)自Abcam 公司；膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FPN1）抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；CCK-8 試劑購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞鐵含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小鼠GPX4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自于江萊生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞分組與處理（1）工作液的配置：①1 μM Erastin 工作液：將1 mg Erastin 加至5 mL 離心管，常溫下離心2 min（轉(zhuǎn)速：1000 r/min，離心半徑：15.9 cm）；再加入1.8280 mL 的二甲基亞砜（DMSO）充分渦旋、混勻，即獲得。②5 μM 姜黃醇工作液：將5 mg 姜黃醇溶于2.1155 mL 的DMSO 中，充分吹打、混勻；渦旋3 次，每次10 s，即獲得。（2）細(xì)胞分組及給藥處理：本實(shí)驗(yàn)分4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即對(duì)照組、DMSO 組、Erastin 組和Erastin+姜黃醇組。細(xì)胞復(fù)蘇后，傳代2～3 代以獲得足量HT22細(xì)胞，接種至6孔板和96孔板中；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，棄原培養(yǎng)基，給予含藥培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基換液處理。①對(duì)照組：予完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。②DMSO 組：予含0.1%的DMSO 完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。③Erastin 組：將50 μL 的1 μM Erastin工作液溶于100 mL 完全培養(yǎng)基中，獲得Erastin 濃度為0.5 μM 的含藥培養(yǎng)基，給予含Erastin 完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。④Erastin+姜黃醇組：將50 μL 的5 μM 姜黃醇工作液溶于5 mL 完全培養(yǎng)基中，獲得姜黃醇濃度為50 μM 的含藥培養(yǎng)基；給予含Erastin 完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；更換為含姜黃醇完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)（CCK-8法）將HT22 細(xì)胞接種于96 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔；待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)80%，按組別給藥處理；每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀562 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔分光度，并計(jì)算不同組別的細(xì)胞活力。

1.2.3 HT22鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)（Western Blot法） 將HT22 接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)80%，按組別給藥處理；干預(yù)后，每孔加入放射免疫沉淀法裂解緩沖液（RIPA蛋白裂解液），提取總蛋白，并以二辛可寧酸（BCA）法檢測(cè)濃度；各組總蛋白取20 μg制備蛋白質(zhì)樣品；蛋白質(zhì)樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h；加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入鐵自噬相關(guān)蛋白（NCOA4、FTH1）、鐵死亡相關(guān)蛋白［GPX4、鐵泵蛋白（FPN）、ACSL4］二抗，室溫孵育2 h；加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑顯色，并使用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白灰度值。

1.2.4 細(xì)胞鐵含量檢測(cè)冰浴超聲波破碎細(xì)胞，然后使用鐵含量測(cè)定試劑盒測(cè)定鐵含量。酶標(biāo)儀510 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)平均光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞鐵含量。

1.2.5 GPX4濃度測(cè)定（酶聯(lián)免疫吸附法）使用RIPA 蛋白裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清液，然后通過(guò)GPX4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定各組上清液GPX4 濃度。酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)平均光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞鐵含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0 分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較行單因素x2分析，兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率影響對(duì)照組細(xì)胞與DMSO 組細(xì)胞活力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Erastin組較對(duì)照組細(xì)胞活性顯著降低，Erastin+姜黃醇組較Erastin 組細(xì)胞存活率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22存活率影響（± s）

表1 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22存活率影響（± s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與Erastin組比較，2）P＜0.05。

細(xì)胞存活率/%96.10±9.34 104.80±7.03 75.63±0.811）94.97±4.222）組別對(duì)照組DMSO組Erastin組Erastin+姜黃醇組樣本數(shù)3333

2.2 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵含量影響與對(duì)照組、DMSO 組比較，Erastin 組細(xì)胞鐵含量較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與Erastin 組比較，Erastin+姜黃醇組HT22 鐵含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22鐵含量影響(± s，ng/104 cell)

表2 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22鐵含量影響(± s，ng/104 cell)

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與DMSO 組比較，2）P＜0.01；與Erastin組比較，3）P＜0.01。

鐵含量0.367±3.85 0.353±4.40 0.610±2.301）2）0.125±3.343）組別對(duì)照組DMSO組Erastin組Erastin+姜黃醇組樣本數(shù)3333

2.3 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞GPX4酶活性影響 對(duì)照組、DMSO組細(xì)胞GPX4酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，Erastin 組細(xì)胞GPX4 酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Erastin 組比較，Erastin+姜黃醇組細(xì)胞GPX4 酶活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22 GPX4酶活性影響（± s）

表3 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22 GPX4酶活性影響（± s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與Erastin組比較，2）P＜0.05。

OD值0.30±0.03 0.32±0.02 0.24±0.051）0.44±0.122）組別對(duì)照組DMSO組Erastin組Erastin+姜黃醇組樣本數(shù)3333

2.4 姜黃醇對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響與對(duì)照組比較，Erastin 組NCOA4、ASCL4 蛋白水平顯著上調(diào)，F(xiàn)TH1、FPN、GPX4 蛋白水平顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與Erastin 組比較，Erastin+姜黃醇組NCOA4、ASCL4 蛋白水平顯著下調(diào)，F(xiàn)TH1、FPN、GPX4 蛋白水平顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DMSO 組、對(duì)照組比較，上述蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1、表4。

圖1 Western blot檢測(cè)NCOA4、FPN、ASCL4、FTH1、GPX4蛋白水平

表4 姜黃醇對(duì)HT22細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響 （± s）

表4 姜黃醇對(duì)HT22細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平影響 （± s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與Erastin組比較，2）P＜0.01。

組別對(duì)照組DMSO組Erastin組Erastin+姜黃醇組GPX4 0.71±0.18 0.75±0.01 0.17±0.021）0.63±0.042）樣本數(shù)3333 NCOA4 0.35±0.05 0.35±0.06 1.14±0.181）0.26±0.102）FTH1 0.53±0.10 0.81±0.20 0.38±0.101）0.82±0，152）ACSL4 0.30±0.10 0.38±0.16 1.07±0.211）0.28±0.062）FPN 0.80±0.22 0.73±0.13 0.15±0.121）0.93±0.182）

3 討論

作為近年來(lái)腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及諸多領(lǐng)域神經(jīng)退行性疾病的研究靶點(diǎn)，鐵死亡被廣泛研究。鐵死亡涉及鐵代謝、脂代謝、糖代謝和氨基酸代謝等多途徑，而鐵自噬是其最為重要的上游機(jī)制之一，NCOA4是鐵自噬過(guò)程中重要的貨物蛋白，在該過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

作為傳統(tǒng)中草藥莪術(shù)有效提取物，姜黃醇不僅能夠發(fā)揮強(qiáng)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，且具有較好的安全性。早期動(dòng)物研究［10，14］發(fā)現(xiàn)，姜黃醇可改善多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如卒中和再灌注損傷、阿爾茨海默病、腦動(dòng)脈粥樣硬化等，具有發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用、治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要潛力［15］。并有研究［12］表明，姜黃醇可能通過(guò)調(diào)節(jié)NCOA4 發(fā)揮抗鐵死亡作用。但是關(guān)于姜黃醇調(diào)控NCOA4/FTH1 作用鮮有研究。文章的創(chuàng)新點(diǎn)在于，探究了姜黃醇在體外減輕Erastin 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡，與調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平、降低細(xì)胞內(nèi)亞鐵含量、提高細(xì)胞活力相關(guān)。如預(yù)期Erastin 可通過(guò)抑制xCT功能、降低GPX4 水平，誘導(dǎo)HT22 小鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生鐵死亡；而姜黃醇處理后，HT22亞鐵含量降低、細(xì)胞活性升高，鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、FTH1、FPN 水平升高，NCOA4、ACSL4 水平降低，提示姜黃醇在體外可以調(diào)控鐵自噬，從而緩解神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡。

GPX4 是一種可以修復(fù)細(xì)胞不飽和脂肪酸氧化損傷的硒蛋白，能夠特異性將具有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為無(wú)毒性的脂醇，是保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的關(guān)鍵酶。xCT 是由輕鏈的溶質(zhì)載體家族7 成員11（SLC7A11）和重鏈溶質(zhì)載體家族3 成員2（SLC3A2）構(gòu)成的異二聚體，胱氨酸與谷氨酸通過(guò)System XC-在生物膜內(nèi)外進(jìn)行1∶1轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。胱氨酸經(jīng)xCT進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被還原為半胱氨酸，進(jìn)一步在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）、谷胱甘肽合成酶（GSS）作用下合成谷胱甘肽（GSH）；GSH 是體內(nèi)強(qiáng)抗氧化物，也是GPX4 的關(guān)鍵輔助因子，在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。xCT 被阻斷時(shí)，胱氨酸無(wú)法與谷氨酸進(jìn)行交換，細(xì)胞內(nèi)谷氨酸堆積，過(guò)量谷氨酸具有直接細(xì)胞毒性；同時(shí)胞內(nèi)GSH 合成底物胱氨酸缺乏，GSH 耗竭，導(dǎo)致GPX4 酶活性下降，促進(jìn)鐵死亡發(fā)生［17］。

已有研究［18］證明，ACSL4 是鐵死亡的標(biāo)記物，多不飽和脂肪酸（PUFA）在ACSL4 催化下形成多不飽和脂肪酸-酰基輔酶A（PUFA-coA），再經(jīng)過(guò)酯化后插入生物膜磷脂中，形成脂質(zhì)過(guò)氧化底物。Fe2+進(jìn)入不穩(wěn)定鐵池后，部分游離鐵以鐵蛋白的形式儲(chǔ)存，未結(jié)合的Fe2+由FPN 轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，從而維持不穩(wěn)定鐵池穩(wěn)態(tài)；FPN表達(dá)水平下降，不利于細(xì)胞內(nèi)游離鐵轉(zhuǎn)出胞外，加速細(xì)胞鐵死亡［19］。

NCOA4 作為選擇性鐵自噬過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)蛋白，是靶向自噬體的貨物蛋白。Mancias［3］提出了NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬，還鑒定了NCOA4 和FTH1 的結(jié)合泛素化系統(tǒng)調(diào)節(jié)；NCOA4表達(dá)升高不僅促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡，并可增加細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性；FTH-1 作為細(xì)胞儲(chǔ)鐵元件之一，隨細(xì)胞鐵自噬增加而減少。

上述證據(jù)為本研究結(jié)果提供了理論機(jī)制，姜黃醇調(diào)節(jié)Erastin 處理后的HT22 細(xì)胞的鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平、減輕細(xì)胞內(nèi)游離鐵蓄積，提高了細(xì)胞活性。綜上所述，姜黃醇可在體外抑制HT22 鐵死亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但本研究尚缺乏靶向NCOA4/FTH1 的反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，后續(xù)我們將對(duì)該方向進(jìn)行深入研究。