汪 洋 葉河楊 申小年

（1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，安徽 蕪湖 241002；2.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校中醫(yī)學(xué)系，安徽 蕪湖 241002）

糖尿病的特征為，臨床表現(xiàn)為多尿、多飲、多食、煩渴、消瘦和疲勞等癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致酮癥酸中毒以及種種并發(fā)癥和伴隨癥。Ⅰ型糖尿?。═1DM）是一種代謝功能障礙，特征是胰島β 細(xì)胞的選擇性破壞，氧化應(yīng)激在這種疾病狀態(tài)的表現(xiàn)中起重要作用［1］。胰島素分泌和活性的相對不足或絕對缺乏，導(dǎo)致高血糖和脂肪及蛋白代謝改變。Ⅱ型糖尿?。═2DM）是一種發(fā)病率和病死率都很高的慢性低度炎癥性疾?。?］。鬼箭羽具有調(diào)節(jié)血脂、降低血糖的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可應(yīng)用于化合物的篩選［3］。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，預(yù)測鬼箭羽治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥活性成分及其潛在目標(biāo)靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的收集以漢語拼音“guijianyu”為關(guān)鍵詞，數(shù)據(jù)來自中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//tcmspw.com/index.php），從該庫中篩選鬼箭羽在吸收、分布、代謝、排泄過程中的活性分子，即口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18。本研究采用OB≥0 和DL≥0，使用TCMSP 篩選潛在的生物活性成分?；赥CMSP 和Drug-Bank 數(shù)據(jù)庫，利用Perl 軟件和UniProtKB 檢索活性成分的靶點(diǎn)（http：//www.uniprot.org/），并進(jìn)行基因注釋。

以“糖尿病”為關(guān)鍵詞，對基因卡（https：//www.genecards.org/）、藥物庫（https：//go.drugbank.com/）、靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（TTD）、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）和藥理學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行搜索，并篩選相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 獲取藥物靶點(diǎn)基因和疾病基因交集圖使用Venny 2.1 軟件，將篩選出的鬼箭羽的活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與DM 靶點(diǎn)對應(yīng)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交叉，并通過維恩圖獲得共同靶點(diǎn)。將預(yù)測目標(biāo)導(dǎo)入字符串?dāng)?shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），進(jìn)行進(jìn)一步預(yù)測。

1.3 繪制藥物靶點(diǎn)基因圖基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，確定共同目標(biāo)和富集通路。使用GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫分析基因-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.7.2 軟件生成活性組件與目標(biāo)之間相互作用以及靶標(biāo)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，用網(wǎng)絡(luò)將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點(diǎn)及其之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物化合物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析。

1.4 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與中央網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隼肅ytoscape 3.6.1 分析蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦浴Ｓ谩肮?jié)點(diǎn)”表示目標(biāo)蛋白分子，用“邊”表示相互關(guān)系，根據(jù)中間中心性、接近中心性和程度，計算PPI 網(wǎng)絡(luò)的中間中心，使各成分與目標(biāo)的相互作用顯示。

1.5 GO和KEGG途徑富集分析軟件和生物體（http：//www.bioconductor.org）進(jìn)行核心靶基因ID，以進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。選擇P＜0.05 進(jìn)行功能注釋聚類。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及其潛在目標(biāo)靶點(diǎn)機(jī)制利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，在鬼箭羽中共分離并鑒定出8 個活性組分（見表1）。即篩選鬼箭羽（吸收、分布、代謝、排泄）的類藥性，OB≥30%、DL≥0.18。

表1 鬼箭羽的部分類藥性成分的分子信息

2.2 獲取藥物靶點(diǎn)基因和疾病基因交集圖根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過數(shù)據(jù)庫篩選、收集到24 個活性化合物和181個“guijianyu”對應(yīng)靶點(diǎn)、4621 個DM 靶點(diǎn)。通過交集，發(fā)現(xiàn)從數(shù)據(jù)庫中共鑒定出21 個化合物相關(guān)靶點(diǎn)與DM 有關(guān)（OB≥0，DL≥0）。獲得4621 個DM 靶基因和鬼箭羽21個活性成分的靶點(diǎn)共交集154疾病相關(guān)基因。見圖1。

圖1 鬼箭羽與糖尿病的交集目標(biāo)的基因維恩圖

2.3 活性成分基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了明確中藥、活性成分和鬼箭羽的潛在靶點(diǎn)之間的關(guān)系，用網(wǎng)絡(luò)將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點(diǎn)及其之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“藥物化合物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析。見圖2。菱形組成的方塊為糖尿病基因，圓形為鬼箭羽藥物分子，其中三角形為基因與分子相交超過5 條邊的基因分子。網(wǎng)絡(luò)由175個節(jié)點(diǎn)、662條邊組成。

圖2 鬼箭羽藥物分子與糖尿病基因的交接圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)和核心基因網(wǎng)絡(luò)通過GO和KEGG通路富集分析，闡明鬼箭羽相關(guān)靶點(diǎn)的特征。核心靶蛋白GO項(xiàng)目數(shù)為17項(xiàng)（P＜0.05），其中生物過程（BP）154項(xiàng)、細(xì)胞組分（CC）43 項(xiàng)、分子功能（MF）17 項(xiàng)。關(guān)鍵靶點(diǎn)包括乙酰膽堿酯酶（AChE）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）。

字符串?dāng)?shù)據(jù)庫生成的PPI 圖中，有17 個目標(biāo)具有很強(qiáng)的交互作用（置信度評分≥5），3 層菱形靶點(diǎn)組成的圓，其中中間層菱形靶點(diǎn)組成的圓為第一次篩選靶點(diǎn)，最內(nèi)層的菱形靶點(diǎn)組成的圓為第二次篩選靶點(diǎn)（見圖3）?；诔潭群椭行亩?，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤蛋白p53 基因（TP53）是治療DM的關(guān)鍵。

圖3 蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)；潛在治療靶點(diǎn)的核心基因

2.5 GO和KEGG富集為了通過調(diào)節(jié)特定途徑來研究藥物治療中靶點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)，根據(jù)富集程度篩選前20項(xiàng)，并繪制柱狀圖。同樣選擇P＜0.05 作為聚類分析的重要路徑，根據(jù)富集程度篩選前20 項(xiàng)，繪制氣泡圖。GO 分析顯示（見圖4），大部分潛在的靶點(diǎn)在CC 中，包括藥物反應(yīng)、活性氧代謝過程、對脂多糖的反應(yīng)對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)。KEGG 富集分析顯示（見圖5～圖7），鬼箭羽影響了182 條通路（P＜0.05），主要富集通路包括脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、高級糖基化終末產(chǎn)物-受體（AGE-RAGE）信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、胰島素信號通路、腺分泌、胰高糖素信號通路等。

圖4 20個靶基因的GO富集分析

圖5 AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用

圖6 脂質(zhì)和動脈粥樣硬化信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用

圖7 流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用

3 討論

中國是世界上糖尿病患者數(shù)量最多的國家，發(fā)病率為11.2%［4］。糖尿病本身不僅對人類健康有嚴(yán)重的危害，而且其并發(fā)癥也會給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前，胰島素抵抗日益受到關(guān)注，急需解決，因?yàn)樗粌H使患者有患Ⅱ型糖尿病的風(fēng)險，而且還會導(dǎo)致代謝綜合征和心血管疾病等［5］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，鬼箭羽對糖尿病的治療效果得到了驗(yàn)證。鬼箭羽的主要成分槲皮素、山柰酚、鬼箭羽堿等通過藥物相似性篩選，有可能成為治療糖尿病非常有前景的口服藥物。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略評估鬼箭羽的潛在成分和作用靶點(diǎn)，揭示其抗糖尿病機(jī)制，并為下一步通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用做準(zhǔn)備。GO 和KEGG 分析表明，炎癥相關(guān)通路可能是參芪降糖顆粒調(diào)節(jié)胰島素抵抗的核心因素［5］。

結(jié)果表明，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供了一種新的“多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)”網(wǎng)絡(luò)模型。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來尋找參與鬼箭羽提供的緩解DM 的潛在分子靶點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得的核心分子靶點(diǎn)中，前6 個程度較高的靶點(diǎn)為絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤蛋白p53 基因（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）和血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA），均被報道對炎癥緩解和血管生成有調(diào)節(jié)作用［6］。鬼箭羽中的生物堿、山柰酚和槲皮素等可通過調(diào)節(jié)葡萄糖、氨基酸和脂類代謝，發(fā)揮降血糖作用。山柰酚是鬼箭羽的有效成分，可通過調(diào)節(jié)hedgehog 信號通路降低IL-6和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平，從而發(fā)揮治療慢性萎縮性胃炎的作用［7］。此外，夏枯草的抗高血壓作用機(jī)制主要是通過甾醇和黃酮類化合物，影響TNF 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、MAPK 通路、PI3K-Akt通路相關(guān)靶標(biāo)，如IL-6 和胰島素，發(fā)揮積極的抗高血壓作用［8］。鬼箭羽的主要成分即槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇，因此其血液動力學(xué)影響作用可能也在于它的甾醇類化合物作用。因此本文可為進(jìn)一步揭示鬼箭羽的藥理作用機(jī)制提供方法學(xué)依據(jù)和理論依據(jù)。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索其可能的機(jī)制，體現(xiàn)了多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，為今后鬼箭羽的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)語

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對接技術(shù)，確定了鬼箭羽在DM 治療中的多成分、多靶點(diǎn)機(jī)制，為開發(fā)鬼箭羽活性化合物作為一種創(chuàng)新的DM 替代治療提供了理論依據(jù)。然而，我們也必須認(rèn)識到，目前的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫還不能包含所有參與DM 發(fā)展的信號分子，因此在我們的研究中可能還有一些重要的分子沒有發(fā)現(xiàn)，需要進(jìn)一步的深入研究。本研究為今后鬼箭羽在DM 患者中的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。