石安惠 賀 丹 龍 琴 田旭琳

宜賓市婦幼保健院檢驗科 (四川 宜賓 644000)

遺傳代謝病(Inherited Metabolic Diseases, IMDs)是由于基因突變使維持機(jī)體正常代謝的某些酶、載體以及受體等蛋白合成出現(xiàn)缺陷，導(dǎo)致機(jī)體生化物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，產(chǎn)生一系列臨床異常的一大類疾病[1]。IMDs病種繁多、臨床表現(xiàn)多樣，群體發(fā)病率高，病死率高，延誤治療將導(dǎo)致發(fā)育障礙、智力低下、死亡等不可逆損害[2]，故早期篩查與診斷意義重大[3]。新生兒遺傳代謝病篩查能早期發(fā)現(xiàn)出生缺陷患兒，并及時予以有效治療。同時，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，直接影響到患兒的及時召回和確診；及時召回遺傳代謝病患兒，及時干預(yù)，及時治療，對降低出生缺陷，提高出生人口素質(zhì)具有較大的社會意義[4-5]。本研究針新生兒血斑卡在不同儲存溫度條件下對新生兒遺傳代謝疾病篩查結(jié)果的影響進(jìn)行分析，以選擇正確的儲存方法，確保新生兒遺傳代謝病檢測前樣本質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2023年1～6月在本院出生的進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查的100例新生兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)[5]，出生72h經(jīng)充分哺乳(6次以上)或7d以內(nèi)，以及各種原因(早產(chǎn)兒、低體重兒、處于治療疾病期的新生兒等)最遲不超過20d的新生兒。本研究經(jīng)過宜賓市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)(宜賓市婦幼保健院醫(yī)教科[2022]第59號通知)，所有研究對象法定監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 儀器與試劑儀器為芬蘭Wallac Oy公司生產(chǎn)的GSP全自動熒光免疫分析儀；試劑為芬蘭Wallac Oy公司生產(chǎn)的專用的血清促甲狀腺激素(TSH)測定、苯丙氨酸(Phe)測定、17a羥孕酮(17α-OHP)測定、葡萄糖6磷酸脫氫酶(G-6-PD)測定試劑盒。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集與遞送 采集符合研究標(biāo)準(zhǔn)的新生兒足跟血，滴于新生兒疾病篩查專用濾紙干血片上，每個新生兒采集三份干血斑，要求每份三個血斑、且每個血斑的直徑≥8mm，雙面滲透良好，在室溫中自然陰干。三份樣本分別封存于塑料密封袋，送新篩實驗室。接收干血斑樣本后，立即把每個新生兒的三份干血斑分別置于室溫(20-24℃)、2-8℃冰箱、37℃恒溫孵育箱放置48小時，取出干血片樣本，在GSP全自動時間分辨熒光免疫分析儀上進(jìn)行檢測。

1.3.2 檢測方法 應(yīng)用全自動打孔儀器對濾紙干血片樣本、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品進(jìn)行打孔(孔徑3mm)，放入96孔微孔板中，讀取微孔板條形碼并將樣品及質(zhì)控品信息輸入GSP工作站軟件，將板架裝載到自動進(jìn)樣器進(jìn)行自動檢測。記錄實驗結(jié)果，以備分析溫度對檢測結(jié)果的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法首先，使用D'Agostino和Pearson綜合正態(tài)性檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)方法。使用Friedman檢驗來判斷三組之間的指標(biāo)是否存在差異。差異的指標(biāo)使用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗進(jìn)行事后檢驗，并使用Bonferroni校正對p值進(jìn)行校正。所有統(tǒng)計分析均采用雙側(cè)檢驗，當(dāng)P<0.05時認(rèn)為存在顯著差異。在相關(guān)性計算中，使用Spearman秩相關(guān)性系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗，以相關(guān)性系數(shù)ρ表示數(shù)據(jù)間的單調(diào)相關(guān)性，ρ> 0時為正相關(guān)，ρ< 0時為負(fù)相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 干血斑儲存溫度對新生兒遺傳代謝檢測項目結(jié)果影響通過多重比較，查看20-24℃(常溫)、2-8℃冰箱和37℃孵箱等三種儲存條件下，四種代謝物檢測的結(jié)果是否存在差異，統(tǒng)計資料的分布及Friedman 檢驗結(jié)果見表1。

表1 三種不同儲存條件下新生兒遺傳代謝病篩查結(jié)果[Median (Q1, Q3)]

檢驗結(jié)果說明，TSH、Phe、17α-OHP和G-6-PD等4項指標(biāo)的檢測結(jié)果大小均受保存溫度影響。觀察數(shù)據(jù)分布可知，在37℃儲存48小時后TSH和G-6-PD兩項指標(biāo)檢測結(jié)果的中位數(shù)顯著下降。為了進(jìn)一步判斷各存儲條件下檢測值分布的差異，并確定對結(jié)果影響較大的保存條件，我們進(jìn)行了兩兩配對事后檢驗，并對p值進(jìn)行了校正。

從檢驗結(jié)果表2可知，常溫和低溫保存的TSH及Phe的檢測結(jié)果沒有差異。但是，在37℃保存時與其他保存條件下的檢測值有較大差異。17α-OHP指標(biāo)在常溫和37℃保存后的檢測結(jié)果沒有差異，但是低溫保存的樣本與其他兩種保存條件下的樣本檢測值存在顯著差異。最后，G-6-PD指標(biāo)似乎對保存溫度較為敏感，三種保存條件之間都存在差異。由于沒有對樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，無法排除差異來自于檢測誤差或其他實驗相關(guān)因素的可能性。

表2 配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗p值

2.2 不同溫度存儲的干血斑樣本檢測精密度分析根據(jù)《新生兒疾病篩查濾紙血片采集和遞送及保存專家共識》的建議，有條件的情況下干血斑濾紙片應(yīng)當(dāng)在低溫條件運輸與存放[6]。低溫保存的樣品更為穩(wěn)定、檢測結(jié)果最接近真實值，故以2-8℃冰箱保存樣本的檢測結(jié)果作為參考值，分析在20-24℃常溫及37℃孵育兩種保存條件下，檢測結(jié)果與參考值的相對誤差(Relative Error，RE)，計算公式如下：

以 20% 作為相對誤差的可接受限，可判斷在20-24℃ 保存的樣本G-6-PD檢測結(jié)果的精密度較高，97%的樣本檢測值在可接受限以內(nèi)。但是在37℃孵箱保存后，G-6-PD檢測結(jié)果受到的影響也最大，所有樣本的檢測結(jié)果都極大偏離了參考值，相對誤差的中位數(shù)達(dá)到-79%。其他檢測值也并不理想，都有超過40% 的樣本落在可接受限外，檢測結(jié)果與低溫存儲的樣本在數(shù)值上有差異。因此可以判斷，在常溫及37℃存儲可能對檢測的精密度產(chǎn)生不良影響。

2.3 不同溫度存儲的干血斑樣本檢測結(jié)果相關(guān)性分析另一方面，我們也查看了常溫及37℃儲存樣本的檢測結(jié)果與低溫儲存的樣本結(jié)果之間的存在的線性關(guān)系。不論保存條件如何，檢測結(jié)果之間都存在一定的單調(diào)正相關(guān)性。與常溫保存相比，在37℃孵箱保存的樣本檢測結(jié)果與參考值的相關(guān)性系數(shù)下降。Phe相關(guān)性相對較弱(常溫：ρ=0.53， 37℃：ρ=0.68)；TSH在兩種條件下都保持了較高的單調(diào)正相關(guān)性(常溫：ρ=0.93， 37℃：ρ=0.90)，但常溫保存的樣本檢測結(jié)果與低溫保存的結(jié)果更接近，而37℃保存的樣本中TSH含量下降，且含量越高差異越明顯(圖2 B)；17-αOHP的檢測結(jié)果的線性相關(guān)性受溫度影響不明顯(常溫：ρ=0.79， 37℃：ρ=0.75)，并且兩種不同條件的擬合線距離很近；G-6-PD受溫度影響最大(常溫：ρ=0.85， 37℃：ρ=0.51)，37℃條件下，不僅檢測值變化、相關(guān)性也明顯下降，但低溫與常溫保存后的檢測值相關(guān)性較高。

2.4 儲存溫度對新生兒篩查檢測結(jié)果判讀的影響除了檢測值本身的差異，本研究中進(jìn)一步關(guān)注了不同溫度儲存后，是否對結(jié)果判讀造成影響(初篩判讀切值、初篩陽性數(shù)量見表3)。整體來說，低溫儲存的樣本初篩陽性率最低，常溫儲存次之，37℃孵箱儲存的最高。尤其是G-6-PD缺乏癥的檢測結(jié)果在37℃儲存后，產(chǎn)生了大量假陽性結(jié)果(假陽性率90%)。

表3 不同保存條件下初篩陽性的數(shù)量

圖1 不同條件下保存的樣本各項檢測值與20-24℃儲存樣本的相對誤差。橙色：37℃孵箱儲存，藍(lán)色：2-8℃冰箱儲存；灰色虛線：相對誤差可接受限，x=-20% 和x=20%。圖2 不同條件下保存的樣本各項檢測值與20-24℃儲存樣本檢測值的相關(guān)性。圖2A: TSH；圖2B：Phe；圖2C： 17-α-OPH；圖2D：G-6-PD。藍(lán)色：20-24℃常溫儲存，橙色：37℃孵箱儲存。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)保存溫度對苯丙酮尿癥(PKU)，先天性甲狀腺功能減低癥(CH)，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(CAH)及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G-6-PD) 缺乏癥的新生兒篩查結(jié)果存在影響。一方面，暴露在常溫或高溫下會加速樣本中的待測物質(zhì)的分解，使檢測結(jié)果精密度下降；另一方面，待測物質(zhì)含量的變化可能會影響檢測結(jié)果的判讀，造成假陽性結(jié)果，導(dǎo)致復(fù)檢率的增加。

在TSH、Phe、17α-OPH 及 G-6-PD 等四個檢測項目中，G-6-PD檢測結(jié)果受溫度影響最明顯，隨著濾紙片干血斑標(biāo)本存儲溫度的升高，G-6-PD活性顯著降低，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，與之前的報道相符[7]。這可能是由于G-6-PD酶活性受溫度和保存時間影響較大。另一方面，朱文娟等人[8]曾研究了不同制備條件對干血斑中氨基酸濃度的影響，結(jié)果顯示Phe的濃度受制備條件影響較小，在4℃、25℃及37℃三個不同制備下，Phe的檢測結(jié)果沒有顯著差異。由于這項研究中是制備后直接進(jìn)行取樣檢測的，不能說明在這些條件下保存對氨基酸濃度的影響。本研究中發(fā)現(xiàn)，在低溫及常溫保存48小時后檢測結(jié)果沒有顯著差異，但是37℃孵箱保存后Phe含量顯著降低，說明在37℃保存會對Phe含量產(chǎn)生影響；同時，常溫保存48小時以內(nèi)對Phe的含量的影響較小，但常溫保存更長時間對樣本中Phe含量的影響尚不清楚。另外，本研究中干血斑制備時采用了自然晾干的方法，未來也可以考慮引入吹干裝置[9]，提升干燥效率。

從實驗方法來說，本研究中涉及的檢測均采用免疫熒光分析法，方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用面廣、所需設(shè)備簡單、線性范圍較寬等優(yōu)點，但在檢測低豐度的物質(zhì)時也可能受到背景干擾導(dǎo)致檢測精度的下降。研究結(jié)果顯示，豐度相對較高的蛋白質(zhì)G-6-PD檢測精度較高，而干血斑中豐度較低的激素17α-OHP、TSH和氨基酸Phe等三種物質(zhì)檢測精密度相對較低。對于這些低豐度的物質(zhì)，未來可以引進(jìn)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析[10-11]，增加可檢測的化合物數(shù)量，提高檢測的特異性和靈敏度。另外，除蛋白、氨基酸、激素等代謝物的檢測外，基因檢測也將逐步納入新篩體系，目前已有研究建立了濾紙干血斑用脊髓性肌萎縮癥基因篩查方法[12]，干血斑保存條件對基因檢測結(jié)果的影響也將成為一個值得探究的課題。

實驗設(shè)計方面，本批樣本中沒有納入陽性樣本，僅考察了保存溫度對檢測值及假陽性率的影響，在未來的實驗中，可重點研究溫度對于陽性樣本檢測結(jié)果及判讀的影響。另外，本批樣本存放的時間都是48小時，有研究顯示，在常溫存放三天的干血斑樣本在G-6-PD酶活性檢測中出現(xiàn)假陽性結(jié)果[7]，本研究中雖然并未產(chǎn)生假陽性，但已觀測到常溫存放的樣本和低溫存放的樣本G-6-PD的檢測結(jié)果存在顯著差異。未來也可以進(jìn)一步探究保存時間對樣本的影響。

總之，干血斑保存溫度是新生兒遺傳代謝病篩查質(zhì)量控制中的重要環(huán)節(jié)，在干血斑的運輸和存儲中，應(yīng)當(dāng)盡量保持低溫條件。常溫下放置時間不超過48小時對樣本檢測的精密度有影響但是對于檢測結(jié)果的影響很小，如沒有條件進(jìn)行低溫保存應(yīng)當(dāng)盡快進(jìn)行檢測減少對檢測結(jié)果的影響。但應(yīng)當(dāng)避免將樣本放置于37℃的環(huán)境下。良好的保存條件有助于降低假陽性率，提高新生兒篩查效率。建議所有新篩實驗室都要注意樣本保存溫度，以更好地開展相關(guān)檢測、為出生缺陷防控作出貢獻(xiàn)。