劉博文,李 蓉,楊 萍,李明鑒,王艷林,魏富剛,黃 永

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137;2.文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司,云南 文山 663099)

【研究意義】三七連作障礙嚴(yán)重影響其藥效質(zhì)量和產(chǎn)量[1]。土壤熏蒸是目前緩解連作障礙的最主要途徑[2]。然而土壤熏蒸無(wú)差別殺滅土壤中的微生物,導(dǎo)致土壤物種多樣性降低[3]。且熏蒸不能降低三七化感自毒物質(zhì),同時(shí)導(dǎo)致部分農(nóng)藥殘留量增加[4]。根腐病高發(fā)是三七連作障礙的主要表現(xiàn)形式[5],目前防治三七根腐病的主要措施是化學(xué)農(nóng)藥的施用,農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康存在潛在的安全隱患[6]。近年來(lái)的研究證實(shí),熏蒸后及時(shí)補(bǔ)充生物菌快速占領(lǐng)空白生態(tài)位,有助于形成抑病土壤,增強(qiáng)土壤對(duì)土傳疾病的抑制作用[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】病原菌的生物量會(huì)隨著三七種植年限的增加積累,同時(shí)土壤從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變,從而導(dǎo)致根腐病高發(fā)繼而引發(fā)連作障礙[8]。常見(jiàn)的輪作管理模式需要5～7年才能基本消除三七連作對(duì)土壤造成的負(fù)面影響,不能滿足三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展需求[9]。棉隆熏蒸能有效消除連作土壤的負(fù)面效應(yīng),防治土傳病害發(fā)生[10],對(duì)多種疫霉屬(Phytophthora)和鐮刀屬(Fusarium)病原菌有較高的抑制作用,但其減退作用無(wú)法達(dá)到100%[2]。熏蒸后土壤環(huán)境“真空”且益生菌屬受到抑制[3],繁殖能力強(qiáng)的病原菌可快速恢復(fù)至原水平。木霉菌(Trichoderma)對(duì)棉隆有極其優(yōu)良的耐受性,熏蒸可以創(chuàng)造出增強(qiáng)木霉菌有機(jī)質(zhì)分解能力的土壤環(huán)境,早期投入能迅速繁殖占領(lǐng)空白生態(tài)位[11],從而充分發(fā)揮其生防潛能。芽孢桿菌(Bacillus)應(yīng)用于多種植物鐮刀屬病原菌所致根腐病時(shí)都表現(xiàn)出較好的防效[12];劉海嬌等[13]從三七連作土壤中分離得到的假單胞菌(Pseudomonas)對(duì)叢赤殼科(Nectriaceae)根腐病致病菌有較強(qiáng)的抑制作用;葉云峰等[14]證實(shí)木霉菌對(duì)三七根腐病病原菌人參鏈格孢(Alternariapanax)和尖孢鐮刀菌(Fuariumsolani)有良好的抑制效率。此外,木霉菌與芽孢桿菌、假單胞菌等生物細(xì)菌組合施用具有提高生物效果的潛能[15]。土壤微生物直接或間接作用于營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化和循環(huán)過(guò)程,是土壤質(zhì)量演替的關(guān)鍵因素[16]。三七種植過(guò)程中,土壤有效氮和速效磷的累積以及速效鉀的耗竭導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不均衡是產(chǎn)生連作障礙的原因之一[17]。因此,明確生物菌劑對(duì)熏蒸后三七土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤環(huán)境的影響,對(duì)于優(yōu)化三七種植過(guò)程中的管理模式具有指導(dǎo)價(jià)值?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】熏蒸劑在緩解三七連作障礙方面的應(yīng)用已較成熟,但生防菌作用于三七根腐病病原的研究多停留在體外實(shí)驗(yàn)階段,特別是熏蒸后復(fù)配多種生物菌劑對(duì)三七連作土微生態(tài)的研究仍是空白。本研究設(shè)置熏蒸、熏蒸配施生物菌劑、非熏蒸、非熏蒸配施生物菌劑4個(gè)試驗(yàn)組,分析不同組土壤主要理化性質(zhì)和微生物群落組成差異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】考察熏蒸后添加益生菌劑是否對(duì)三七微生態(tài)的改善有促進(jìn)作用,揭示熏蒸和生物菌劑對(duì)三七根際微生物群落構(gòu)建的影響,為優(yōu)化三七種植管理方法提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試植物為生長(zhǎng)近半年的三七種苗(籽條),生防菌劑為枯芽春?(Bacillussubtilis,1×108CFU/g)、木每靈?(Trichodermaharzianum,1×108CFU/g)和熒光棒?(Pseudomonasfluorescens,5×108CFU/g),試驗(yàn)地選址在云南省文山市丘北縣樹(shù)皮鄉(xiāng)小新寨苗鄉(xiāng)三七有限公司三七種植基地(23°49′46.99′′ N, 104°06′12.99′′ E)。土壤前茬作物為菊花和烤煙,輪作時(shí)間為3年,輪作前經(jīng)歷3年完整三七種植周期,試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),土壤條件分為熏蒸地(LZ地)與非熏蒸地(PX地),處理方式分為常規(guī)管理模式(CG處理)與生物農(nóng)藥處理模式(TK處理)。LZ地使用450 kg/hm2棉隆覆膜熏蒸30 d,揭膜7 d后進(jìn)行移栽,PX地不作熏蒸;處理方式見(jiàn)表1。按照起壟方式種植三七,每壟3.36 m2,栽種120株三七種苗,每60壟設(shè)為1個(gè)小區(qū)作為重復(fù),每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。三七籽條于2021年7月進(jìn)行移栽,2022年1月采集80株以上三七樣品,統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)。試驗(yàn)期間不定期巡查田間,及時(shí)清除有根腐病癥狀的幼苗,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組隨機(jī)選取6壟地統(tǒng)計(jì)存活數(shù)作為評(píng)價(jià)組間防效差異的依據(jù)。

表1 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 根際土壤樣品的采集

在每個(gè)小區(qū)采用五點(diǎn)取樣法,采取三七帶土根系,抖落非根際土,將根系樣品轉(zhuǎn)移至含20 mL無(wú)菌10 mmol/L PBS溶液的50 mL無(wú)菌離心管后,置于搖床震蕩20 min(120 r/min,4 ℃),使用無(wú)菌鑷子挑除離心管中的根系,剩余懸浮液離心30 min(6000 r/min,4 ℃)后去除懸浮液,收集得到2 g左右的根際土壤,置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 土壤理化性質(zhì)

在每個(gè)小區(qū)內(nèi)采用五點(diǎn)取樣法,取得根周5～15 cm深的表層土壤作為理化分析樣本。pH儀測(cè)定土壤pH;堿解擴(kuò)散法測(cè)定土壤堿解氮;火焰光度法測(cè)定土壤速效鉀;碳酸氫鈉提取法測(cè)定土壤速效磷。

1.4 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

按照DNA提取試劑盒MN NucleSpin 96 Soi得到終濃度為4～5 ng/μL的根際土壤DNA。引物合成、擴(kuò)增步驟由百邁克公司完成。以引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′) 和806R2( 5′-GGA CTACNVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)域;以引物ITS1(F5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)擴(kuò)增真菌ITS1區(qū)域。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min,98 ℃10 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s循環(huán)10次,72 ℃退火5 min。后續(xù)測(cè)序使用Illumina Novaseq(Illumina, San Deigo,CA)平臺(tái)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic v0.33[18]對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾,使用Usearch v10[19]進(jìn)行雙端序列憑借,使用UCHIME v4.2[20]去除嵌合體得到有效數(shù)據(jù)。使用Usearch v10在相似性97%水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類,以所有序列數(shù)的0.005%作為過(guò)濾OTUs的閾值。以SILVA[21]為參考數(shù)據(jù)使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋。利用R語(yǔ)言工具[22]進(jìn)行α多樣性計(jì)算、PCoA分析、RDA分析。使用STAMP[23]軟件分析組間物種顯著性差異。屬水平熱圖距離算法為eculidean,聚類算法為complete。PCoA分析距離算法為bray_curtis。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七根際土壤物種組成分析

2.1.1 物種數(shù)量分析 16S rRNA測(cè)序共獲得1200 897對(duì)序列,質(zhì)控、拼接后產(chǎn)生1198 632條有效序列,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生79 555條有效序列,共產(chǎn)生1794個(gè)OTUs。其中LZCG組有1541個(gè)OTUs,LZTK組有1470個(gè)OTUs,PXCG組有1685個(gè)OTUs,PXTK組有1663個(gè)OTUs。PXTK-PXCG共有OTU 1588個(gè),LZTK-LZCG共有OTU 1402個(gè)。PXTK-LZTK共有OTU 1343個(gè),PXCG-LZCG共有OTU 1459個(gè)。圖1-a中ITS rRNA測(cè)序共獲得 1135 553 對(duì)序列,質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生 1129 295 條有效數(shù)據(jù),每個(gè)樣品至少產(chǎn)生 40 791 條有效數(shù)據(jù),平均產(chǎn)生75 286 條有效數(shù)據(jù),共產(chǎn)生2206個(gè)OTUs。其中LZCG組有1896個(gè)OTUs,LZTK組有1698個(gè)OTUs,PXCG組有1793個(gè)OTUs,PXTK組有1837個(gè)OTUs。PXTK-PXCG共有OTU 1526個(gè),LZTK-LZCG共有OTU 1533個(gè)。PXTK-LZTK共有OTU 1439個(gè),PXCG-LZCG共有OTU 1636個(gè)。由圖1-b可知,土壤條件相同時(shí),同一處理方式下微生物種類數(shù)量上更接近;相同土壤條件下的兩個(gè)組間共有物種更多。土壤熏蒸會(huì)使三七根際土中細(xì)菌種類減少,添加生物菌劑不能改變細(xì)菌種類減少的程度。常規(guī)管理模式下熏蒸后真菌種類增加,熏蒸后添加生物菌劑會(huì)降低真菌種類。PXTK組特有細(xì)菌和真菌種類最多。

2.1.2 門(mén)水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析 門(mén)水平分類上,三七根際土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌群依次為變形菌門(mén)(Proteobacteria,33.17%～53.70%),酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota,25.90%～10.71%,)放線菌門(mén)(Actinobacteriota,3.81%～13.13%),芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadota,7.89%～14.73%),綠彎菌門(mén)(Chloroflexi,1.93%～4.25%),粘菌門(mén)(Myxococcota,1.16%～2.72%),厚壁菌門(mén)(Firmicutes,1.08%～2.07%),擬桿菌門(mén)(Bacteroidota,0.97%～8.03%)。以上8個(gè)菌門(mén)共占細(xì)菌總數(shù)的87.29%～91.8%。熏蒸使變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)的豐度上升,同時(shí)降低芽單胞菌門(mén)、酸桿菌門(mén)的豐度,此外,Methylomirabilota在熏蒸后幾乎消失。熏蒸地添加菌劑并不能改變上述細(xì)菌門(mén)水平變化的趨勢(shì)。

圖1 不同組三七根際土壤中細(xì)菌和真菌群落OTUsFig.1 OTUs of bacterial and fungal community in rhizospere soil of P.notoginseng from different groups

門(mén)分類水平上,三七根際土壤真菌中的優(yōu)勢(shì)菌群依次為子囊菌門(mén)(Ascomycota,62.75%～64.35%),擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota,18.00%～20.24%),被孢霉(Mortierellomycota,6.30%～8.40%),unclassified_fungi(3.15%～5.66%),壺菌門(mén)(Chytridiomycota,1.72%～3.55%),羅茲菌門(mén)(Rozellomycota,1.13%～1.89%),油壺菌門(mén)(Olpidiomycota,0.27%～0.93%),球囊菌門(mén)(Glomeromycota,0.05%～0.17%)。以上8個(gè)菌門(mén)共占據(jù)真菌數(shù)量總數(shù)的99.60%～99.84%。子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)在各組間的豐度排名為L(zhǎng)ZTK>PXCG>PXTK>LZCG。

2.1.3 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)分析 豐度排名前30的細(xì)菌屬水平聚類熱圖(圖2-a)顯示同一組的樣品距離接近,說(shuō)明優(yōu)勢(shì)屬的物種豐度在組間的相似性更高,不同組的差異更大。土壤條件相同的組聚為一類,熏蒸使三七根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)物種組成發(fā)生明顯變化。處理方式相同土壤條件不同的兩組間,優(yōu)勢(shì)菌屬豐度排名均發(fā)生明顯變化,說(shuō)明熏蒸可能對(duì)未處理前的原始細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)造成破壞,且這種破壞在采收時(shí)未能恢復(fù)至未熏蒸土的水平。

豐度排名前30的真菌屬水平熱圖(圖2-b)顯示PXCG和LZCG的土壤真菌距離較接近,兩組的組間差異也最小。其他組的樣品則不能嚴(yán)格按照分組聚類。這可能是因?yàn)槿叻N植過(guò)程中施用的化學(xué)農(nóng)藥大多是廣譜殺真菌劑,化學(xué)農(nóng)藥處理下土壤中豐度高的多為對(duì)農(nóng)藥抗性高的特定真菌物種。同樣土壤條件下,TK組中鐮刀菌、柱孢屬(Cylindrocarpon)、鏈格孢屬(Alternaira)和小不整球殼屬(Plectospaerella)的豐度均低于CG組。

2.2 三七根際土壤菌群多樣性分析

2.2.1 三七根際細(xì)菌α多樣性分析 通過(guò)計(jì)算ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)比較組間α多樣性差異(表2～3)。除LZCG組Shannon指數(shù)高于PZCG組外,處理方式相同時(shí),熏蒸使α多樣性指數(shù)均有所下降。PXTK組4個(gè)α多樣性指數(shù)在所有處理組中最高。LZCG組Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著高于LZTK組(P=0.006,0.011,0.001),PXCG組Shannon指數(shù)顯著低于PXTK組(P=0.009)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)估算群體OTU數(shù)/物種數(shù),辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)考慮物種豐度加權(quán),即考察豐富度的同時(shí)考慮物種的均勻度。處理方式相同時(shí)熏蒸處理會(huì)降低根際細(xì)菌菌群的辛普森指數(shù),PX地上TK處理能有效改善細(xì)菌群落的不均衡發(fā)展提升均勻度。相反,LZ地上TK處理使得細(xì)菌α多樣性指數(shù)有所下降。

2.2.2 三七根際真菌α多樣性分析 細(xì)菌α多樣性指數(shù)結(jié)果類似,LZTK組4個(gè)α多樣性指數(shù)均最低。LZCG和PXCG組的Chao1值數(shù)和ACE指數(shù)高于LZTK和PXTK組。PX地上TK處理的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)高于CG處理,LZ地TK處理則使真菌α多樣性指數(shù)均低于CG處理。

2.2.3 細(xì)菌Beta多樣性分析 PCoA圖(圖3-a)顯示PXTK的樣品更緊密地聚集在一起,PXCG的樣品更分散,說(shuō)明在PX地上TK處理較CG處理對(duì)根系菌群有更強(qiáng)的塑造作用。LZCG組樣品更聚集,說(shuō)明常規(guī)管理模式和熏蒸對(duì)土壤菌群的篩選有疊加作用,而菌劑的添加可以一定程度減緩這種作用。LZCG和LZTK、PXCG和PXTK的距離更接近,說(shuō)明在PX地上處理方式不同對(duì)群落結(jié)構(gòu)造成的差異更大。不同土壤條件的樣本在PC1軸上完全區(qū)分,PC1軸解釋度為64.5%;同樣土壤條件下,TK處理與CG處理組的樣品都能在PC2軸上區(qū)分開(kāi)。使用置換多元方差分析(PERMANOVA)對(duì)不分組樣品間的β多樣性是否具有顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果表明所有細(xì)菌樣品組間差異大于組內(nèi)差異(R=0.779),且檢驗(yàn)可信度高(P=0.001<0.05)。說(shuō)明處理方式和熏蒸均對(duì)三七根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。

圖2 根際土壤細(xì)菌(a)和真菌(b)屬水平豐度Fig.2 The abundance of bacterial(a)and fungal(b) community in rhizosphere soil at genus level

表2 三七根際土壤細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

表3 三七根際土壤真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

圖3 基于OTU水平三七根際土壤細(xì)菌群落PCoA分析(a)和真菌群落PLS-DA分析(b)Fig.3 PCoA analysis of bacterial communities(a)and PLS-DA analysis of fungal community(b) based on OTU levels in rhizosphere soils of P.notoginseng

2.2.4 真菌Beta多樣性分析 基于OTU水平的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)結(jié)果(圖3-b)顯示不同組的真菌群落存在明顯差異。其中LZCG組最緊密,組內(nèi)差異小。LZCG與PXCG、PXCG與PXTK在component2(10.42%)軸和component3(9.16%)軸上均能完全區(qū)分開(kāi)。PXCG與PXTK、LZCG與LZTK 在componet1(13.4%)軸上距離較遠(yuǎn)。菌劑和熏蒸劑均能在一定程度上解釋三七真菌群落組成的改變。

2.3 多級(jí)物種差異分析

2.3.1 熏蒸地上處理方式不同造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出熏蒸地上處理方式不同造成顯著差異的微生物。由圖4-a可知,LZCG組顯著富集Vicinamibacterales,芽單胞桿菌目(Gemmatimonadales)以及該目下的芽單胞桿菌科(Gemmatimonadaceae)和黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)的部分屬。生物菌劑顯著富集微球菌目(Micrococcales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales),以及上述3個(gè)目下的微球菌科(Micrococcaceae)、伯克氏科(Burkholderiaceae)、鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)。

圖4-b顯示LZCG顯著富集17個(gè)屬的真菌,主要集中在傘菌亞門(mén)(Agaricomycetes)、盤(pán)菌亞門(mén)(Eurotiomycetes)以及油壺菌目(Olpidiales)。在LDA>3.0的水平下,沒(méi)有找到LZTK的關(guān)鍵物種。

圖4 多級(jí)分類水平下LZCG-LZTK組間細(xì)菌(a)和真菌(b)LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZCG and LZTK at multi-level classification

2.3.2 非熏蒸地上處理方式不同造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出非熏蒸地上處理方式不同造成顯著差異的微生物。由圖5-a可知,TK處理后起關(guān)鍵作用的細(xì)菌物種有伯克氏菌目、Pyrinpmonadales及該目下的Pyrinomonadaceae;CG處理的關(guān)鍵細(xì)菌物種集中在酸桿菌目(Acidobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)和芽單胞菌菌屬(Gemmatimonas)。

圖5-b顯示CG處理顯著富集的真菌物種種類較多且彼此親緣關(guān)系較遠(yuǎn),包括鏈格孢屬、鐮刀屬、叢赤殼科、小不整球殼屬、Staphylotrichum等病原菌屬和Chaetpmiaceae、曲霉屬(Aspergillus)等益生菌。PXTK組顯著富集的真菌物種親緣關(guān)系較分散,包括Tubefiaceae、酵母科(Saccharomycetaceae)、絲膜菌科(Cortinariaceae)以及Kazachstania、黏滑菇屬(Hebeloma)等。

2.3.3 常規(guī)管理模式下熏蒸造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出常規(guī)管理模式下熏蒸造成的顯著差異物種。圖6-a顯示,LZ地上富集的細(xì)菌物種集中在放線菌目(Actinomycetales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)、Rhodanobacteraceae、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)。PX地上顯著富集酸桿菌目(Acidobacteriales)、Vicinamibacterales、芽單胞菌目(Rokubacteriales)以及屬于上述目下的芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、SC_I_84、unculured_Firmicutes_bacterium。

圖6-b顯示,LZ地顯著富集的真菌物種集中在刺盾炱目(Chaetothyriales)、油壺菌科(Olpidiaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、絲膜菌科,以及屬水平上的黏滑菇屬、亡革菌屬(Thanatephorus)、油壺菌屬等。PX地顯著富集的真菌物種有肉膜菌目(Helotiales)、Rhizophydiales、糞殼菌目(Sordariales)、毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)以及屬水平上的紅曲霉屬(Monascus)、Gorgonomyces。

2.3.4 生物菌劑處理下熏蒸造成的關(guān)鍵差異物種 基于線性判別分析,篩選出施加菌劑的管理模式下熏蒸造成的顯著差異物種。由圖7-a可知,同為T(mén)K處理,不同土壤條件下的關(guān)鍵細(xì)菌物種與同為CG處理時(shí),不同土壤條件下的關(guān)鍵細(xì)菌物種相似。不同的是,LZTK還對(duì)微球菌科(Micrococcaceae)、鞘脂桿菌科(Sphingobacteriaceae)有富集作用。PXTK還對(duì)硝化螺旋科(Nitrosporaceae)、硝化螺旋屬(Nitrospira)有富集作用。

圖5 PXCG-PXTK組間細(xì)菌(a)和真菌(b)LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of bacteria and fungi between PXCG and PXTK at multi-level classification

圖6 LZCG-PXCG組間細(xì)菌和真菌LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZCG and PXCG at multi-level classification

圖7 LZTK-PXTK組間細(xì)菌和真菌LEfSe分析Fig.7 LEfSe analysis of bacteria and fungi between LZTK and PXTK at multi-level classification

表4 土壤理化性質(zhì)

圖7-b顯示,LZTK僅對(duì)unclassified_Clavicipitaceae有富集作用。2.3.1項(xiàng)下沒(méi)有計(jì)算出LZTK的關(guān)鍵物種,說(shuō)明TK處理對(duì)LZ地上真菌的篩選和富集作用不明顯。PXTK顯著富集的真菌物種集中在球囊菌目(Glomerales)、Sporidioboales、unclassified_Agaricomycetes、白粉菌目(Erysiphales)、柔膜菌目以及這些目下部分科屬。

2.4 三七土壤微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性

由表4可知,除PXTK組AP含量略高于PXCG組,當(dāng)土壤條件一致時(shí),生物菌劑的施用均促進(jìn)三七對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。處理方式一致時(shí),熏蒸降低土壤pH和有效氮的含量。不同土壤條件下,生物菌劑的添加對(duì)AP和AK的影響沒(méi)有表現(xiàn)出一致的規(guī)律。

圖8顯示黃色桿菌科未分類屬和芽單胞菌桿菌屬與AP和AK正相關(guān),Vicinamibacter和unclassified_Vicinamibaceraceae與pH正相關(guān),與AN呈正相關(guān)的有芽單胞桿菌科,與AN呈負(fù)相關(guān)的有羅河桿菌屬(Rhodanobacter)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)。pH與PXTK的細(xì)菌群落正相關(guān),與LZCG和LZTK負(fù)相關(guān)。所有環(huán)境因子中,pH對(duì)細(xì)菌群落的影響最大,AN對(duì)細(xì)菌群落的影響最小。

圖9顯示與AP正相關(guān)性最強(qiáng)的是青霉屬(Penicillium);與AK正相關(guān)的有曲霉屬、鐮刀屬和unclassified_Agaricomycetes;與pH和AN正相關(guān)的有unclassified_Basidiomycota,Cladpsphaerina。pH對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性最強(qiáng),其中PXTK的真菌群落與pH呈正相關(guān)。

圖8 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落RDA分析 Fig.8 Redundant analysis of soil environmental factor and soil bacterial community

2.5 三七根際土壤真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為80,邊數(shù)量為452,模塊性為0.319。圖10顯示相關(guān)性排名前50的屬之間,互相促進(jìn)關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)是抑制關(guān)系的10倍之多,這可能導(dǎo)致了部分共生網(wǎng)絡(luò)更發(fā)達(dá)的物種獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)不斷積累,例如三七根腐病病原菌所在的鐮刀屬、鏈格孢屬、土赤殼屬(Ilyonectria)以及叢赤殼科等。種間促進(jìn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)過(guò)多往往不利于菌群的平衡,且更容易受到病原菌的侵襲[24],這可能也是三七連作過(guò)程中土壤逐漸從“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)向“真菌型”的原因之一。

圖9 土壤理化性質(zhì)與真菌群落RDA分析Fig.9 Redundant analysis of soil environmental factor and soil bacterial community

2.6 三七生長(zhǎng)狀況和根腐病發(fā)生情況

試驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組三七主要農(nóng)藝性狀見(jiàn)表5。熏蒸能夠提高莖高和全根重。同樣土壤條件下施加生物菌劑增加了剪口的重量同時(shí)對(duì)主根重量沒(méi)有影響,其中PXTK組的剪口重量顯著高于LZCG組。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)PXTK、PXCG、LZCG、LZTK各組的三七植株存活率分別為70.7%、77.8%、75.4%、84.2%。施加生防菌劑和熏蒸都能提高根腐病的防效,其中LZTK組的存活率最高。

圓圈大小代表平均豐度大小,邊的粗細(xì)代表相關(guān)性強(qiáng)弱,橙色代表正相關(guān),綠色代表負(fù)相關(guān)(P<0.05)。The size of the circles represents the average abundance of species; The thickness of the edges represents the strength of correlation and the orange color represents positive correlation while green represents negative correlation(P<0.05).圖10 三七根際土壤真菌間相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)Fig.10 Correlation network of soil fungi in rhizosphere of P.notoginseng

表5 三七生長(zhǎng)狀況

3 討 論

土傳病害的發(fā)生和根際微生物群落多樣性密切相關(guān),通常微生物群落多樣性高,群落之間均衡發(fā)展的土壤中,土傳病原菌較少[25]。生物菌劑的引入往往可以增加微生物的多樣性,補(bǔ)償性地改變病原菌積累對(duì)土著微生物的變化[26]。PXTK組在所有組中細(xì)菌α多樣性指數(shù)均最高,以往的研究證實(shí)連作模式下三七根際土壤細(xì)菌α多樣性逐年下降[27]。棉隆熏蒸會(huì)顯著降低細(xì)菌α多樣性,這與前人研究結(jié)果一致[28]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)熏蒸會(huì)增加真菌物種豐富度,而三七根際真菌的豐富度與幼苗移栽后的死亡率顯著正相關(guān)[29]。真菌均勻度的降低,導(dǎo)致群落間的平衡性打破,將會(huì)影響土壤健康,使根腐病發(fā)生率上升[30]。PX地上菌劑的添加能夠有效增加真菌群落的均勻度,但LZ地上添加菌劑未能出現(xiàn)一致的結(jié)果。

同樣處理方式下,LZ地pH顯著降低。土壤酸化有利于三七根腐病病原菌的生長(zhǎng),是三七連作障礙的誘因之一[8]。土壤pH與三七籽條移栽后的存活率呈正相關(guān)[31],與根腐病的發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)[32]。RDA分析顯示pH與群落之間的相關(guān)性最大,熏蒸顯著降低了土壤pH,PXTK組pH最高。本試驗(yàn)選擇的生物菌也是常見(jiàn)的根際促生菌(PGPR),可通過(guò)溶磷、固氮、影響植物激素分泌、誘導(dǎo)脅迫應(yīng)答基因、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等方式直接或間接提高作物產(chǎn)量[33-34]。試驗(yàn)結(jié)果顯示土壤條件一致時(shí),除了PXTK組AK含量與PXCG組相近,TK處理后的土壤有效氮、速效鉀、速效磷含量均低于CG組。氮元素富集是三七種植過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題,高濃度氮肥會(huì)提高鐮刀菌屬和鏈格孢屬的豐度,同時(shí)降低芽孢桿菌和假單胞菌屬的豐度[35],且會(huì)抑制三七的光合作用導(dǎo)致減產(chǎn)[36-37]。威百畝通過(guò)在土壤中降解為異氰酸甲酯發(fā)揮熏蒸滅菌作用,與棉隆的抗菌機(jī)制相同。前人研究發(fā)現(xiàn)威百畝會(huì)影響具有氮礦化等轉(zhuǎn)化能力的土壤功能菌數(shù)量,從而妨礙氮循環(huán)過(guò)程[38]。楊馥霞等[39]發(fā)現(xiàn)熏蒸后土壤中具有固氮能力的慢生根瘤菌顯著下降,熏蒸后應(yīng)當(dāng)補(bǔ)充益生菌和氮肥。本試驗(yàn)LZCG組中慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)的豐度較PZCG下降78.7%。威百畝、棉隆還會(huì)抑制反硝化菌從而進(jìn)一步加深氮素累積[40-41]。相比PXCG組,硝化螺旋門(mén)(Nitrospirales)、硝化螺旋屬在PXTK組中顯著富集,且單因素方差分析顯示其含量顯著高于LZTK組,說(shuō)明菌劑在土著菌群中的投入有利于維持三七土壤生態(tài)中氮元素的平衡。但本試驗(yàn)田測(cè)得堿解氮的含量均低于云南地區(qū)三七種植地堿解氮的平均值(142.58 mg/kg),而氮元素含量與三七塊根和根條總皂苷含量正相關(guān)[42]。處理方式一致時(shí)土壤熏蒸均降低有效氮含量,是否應(yīng)當(dāng)在生產(chǎn)中補(bǔ)充氮元素缺失以避免藥材有效成分的損失有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。同樣的處理?xiàng)l件,黃色桿菌科在連作地的豐度均顯著提高,而同為連作地,黃色桿菌科則是農(nóng)藥處理組的關(guān)鍵物種。種植三七對(duì)土壤全磷有富集作用,且全磷含量與速效磷含量正相關(guān)[8],三七根際黃色桿菌科的豐度與磷元素正相關(guān)[43]。黃色桿菌屬常被視為益生菌屬,小米的產(chǎn)量與其在根際的豐度呈正相關(guān)[44],有研究認(rèn)為病原真菌的增多能刺激植物茉莉酸通路進(jìn)而誘導(dǎo)黃單胞菌(Xanthomona)在根際的富集從而使植物抗病性增強(qiáng)[45]。

棉隆與常規(guī)管理模式下預(yù)防三七根腐病的廣譜殺真菌劑——福雙美、代森錳鋅、丙森鋅等[46]同屬于二硫代氨基甲酸酯類化合物,這可能會(huì)加劇熏蒸后部分對(duì)此類農(nóng)藥耐受性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌屬的積累,使得菌群結(jié)構(gòu)更為失衡。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同處理LZ地高豐度真菌物種高度一致,這些物種在LZCG和PXCG中的豐度高于LZTX和PXTK。其中曲霉屬對(duì)鐮刀菌屬、鏈格孢菌屬、土赤殼屬等病原菌有較強(qiáng)的正相關(guān)性,從而成為加劇根腐病發(fā)生的隱患。LEfSe分析顯示對(duì)比LZCG-LZTK、LZCG-PXCG,LZCG均顯著富集鞘氨醇單胞屬或鞘氨醇單胞菌科。鞘氨醇單胞屬易于在連作地患病三七的根際富集,常被視為潛在的根腐病病原菌[27]。Wei等[47]通過(guò)LEfSe分析觀察到孢腔菌科(Pleosporaceae)易在三七銹腐病根際土顯著富集,Pyronemataceae、Xenopolyscytalum在健康三七根際土顯著富集。PX地上施加菌劑顯著降低了孢腔菌科的豐度,同時(shí)顯著升高了Pyronemataceae、Xenopolyscytalum的豐度。Eo等[48]發(fā)現(xiàn)毀滅柱孢菌(C.decstructans)對(duì)棉隆有較高的耐受性,本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)LZCG與PXCG中柱孢屬的豐度接近,而其在PXTK的豐度僅為PXCG的1/10。此外,同樣土壤條件下TK處理均能顯著提升假單胞菌屬的豐度,但木霉菌和芽孢桿菌的豐度增加沒(méi)有顯著性。益生菌劑的生物效果可能并非通過(guò)增加所選益生菌豐度,而是通過(guò)提升土著菌群網(wǎng)絡(luò)整體的抑病能力和群落恢復(fù)能力發(fā)揮生物效果[49]。PXTK組提高了其他益生菌豐度。比如溶桿菌(Lysobacter)、伯克霍爾德菌等。溶桿菌對(duì)多種病原真菌、卵菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)均具有溶菌活性[50]。伯克氏菌科能夠抑制毀滅柱孢生長(zhǎng)并講解三七自毒物質(zhì)[51]。

由于熏蒸劑對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的破壞,病原菌二次感染率高是熏蒸劑防控效果差的主要原因[52],添加生物菌劑形成抑病區(qū)系往往能彌補(bǔ)其不足。張慶華等[53]發(fā)現(xiàn)熏蒸+生物菌肥處理抑制草莓病原菌屬的同時(shí)可以增加部分有益菌并使微生物多樣性恢復(fù)更快。楊柳等[54]也認(rèn)為,棉隆熏蒸配施水肥菌可以降低初侵染來(lái)源并增加益生菌定殖率從而使得大棚番茄綜合發(fā)病率極大的下降。然而熏蒸后添加生物菌并非一定起到增加抑病能力的效果。張立彭等[55]發(fā)現(xiàn),威百畝和棉隆不能緩解百合連作障礙,熏蒸加益生菌劑對(duì)比單獨(dú)熏蒸可以提高百合根系活力,但對(duì)百合增產(chǎn)的作用尚不及單獨(dú)使用菌劑。這可能由于熏蒸劑對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)功能的改變影響了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,且微生物多樣性很難恢復(fù)到原來(lái)水平[56]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,PXTK與LZTK微生物群落結(jié)構(gòu)的組成更接近,但熏蒸并沒(méi)有增加生物菌劑對(duì)微生物多樣性改變的作用。菌劑的施加在不影響三七地下重量的同時(shí)能夠降低根腐病的發(fā)生,熏蒸后添加菌劑的管理模式有增加三七連作地抑病能力的潛能。

4 結(jié) 論

相較常規(guī)管理模式,在非熏蒸地上施用生物菌劑可以提高三七根際細(xì)菌群落α多樣性和真菌群落均勻度。施用生物菌劑可以抑制棉隆熏蒸對(duì)真菌群落豐富度的提升,但不能改善熏蒸降低根際土壤細(xì)菌群落的豐富度和均勻度的效果。生物菌劑處理降低三七病原菌相對(duì)豐度的同時(shí)增加部分益生菌屬的豐度,對(duì)菌群結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的塑造能力,并能調(diào)節(jié)三七種植過(guò)程中造成的土壤營(yíng)養(yǎng)元素失衡和土壤酸化問(wèn)題。