楊婭琳,吳峰婧琳,陳健鑫,武自強(qiáng),劉 麗,張東華,馬煥成,伍建榕,

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院/西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224)

【研究意義】油茶(CamelliaoleiferaAbel.)又稱茶子樹,屬于山茶科山茶屬,是中國南方特有的木本油料樹種[1],它與油棕、油橄欖和椰子一起被稱為世界四大木本油料植物。油茶具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、果期長、樹齡長等優(yōu)點(diǎn),因而成為中國南方推廣種植的經(jīng)濟(jì)林木。油茶主要分布在中國南方的大部分省份(如江西、湖南、云南等),種植歷史長達(dá)千年,云南具備高原特色油茶產(chǎn)業(yè)得天獨(dú)厚的自然條件,以野生型油茶為主[2]。油茶壓榨出的茶油是一種優(yōu)質(zhì)的植物油,不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上,還富含油酸、亞油酸、硬脂酸和茶多酚等活性成分,具有抗氧化、抗炎和抗菌等功效[3]。國家林業(yè)和草原局公布了《林草產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2021—2025年)》,根據(jù)規(guī)劃,油茶種植面積將達(dá)6.00×106hm2,油茶年產(chǎn)量將達(dá)2.00×106t[4]。叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是林地土壤中最普遍、最重要的真菌類群,定殖于植物根系后能與植物建立起良好的共生關(guān)系,研究發(fā)現(xiàn),AMF能夠與80%以上的陸生植物形成共生關(guān)系,形成互惠共生體[5-7]。植物分泌信號誘導(dǎo)AMF孢子的萌發(fā)并侵入根系,在根系皮層內(nèi)形成特殊結(jié)構(gòu),如叢枝(Arbuscule)、泡囊(Vesicle)和胞間菌絲等[8]。【前人研究進(jìn)展】油茶是能與AMF共生的植物之一,林宇嵐等[1]通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同品種油茶根際土壤共有AMF 12個(gè)屬,說明油茶根際土壤內(nèi)有豐富的AMF種類。AMF能夠提高植物的抗旱和抗鹽堿能力[9-10],緩解重金屬對宿主植物的影響[11],提高宿主植物對病蟲害的抵御能力[12],促進(jìn)植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收[13],增強(qiáng)宿主植物抗污染物毒害的能力[14],還能夠調(diào)節(jié)植物的種間關(guān)系[15]。Safir[16]研究發(fā)現(xiàn)摩西球囊霉(Glomusmosseae)定殖能夠減少洋蔥(Alliumcepa)根部病原菌紅根腐菌(Pyrenochaetaterestris)的侵染,提高洋蔥的抗病性。周昱[17]研究發(fā)現(xiàn),接種叢枝菌根真菌可提升對云杉根腐病的防治效果。如今,已有越來越多的研究關(guān)注AMF對植物病原菌的防控作用。【本研究切入點(diǎn)】油茶根腐病在苗期是一種毀滅性的土傳疾病。油茶患根腐病后地上部分表現(xiàn)為植株發(fā)育不良、矮小,葉片黃化脫落,甚至整株干枯死亡;受影響植株地下部分根部在初期變成褐色至深黑色,后期根部表皮腐爛脫落,延伸至地面根莖交界處,影響水分和養(yǎng)分運(yùn)輸,植株的生長發(fā)育受阻,嚴(yán)重影響油茶成林及后續(xù)產(chǎn)量[5]。【擬解決的關(guān)鍵問題】德宏州油茶集約化種植以及管理方式等原因?qū)е掠筒韪〈竺娣e發(fā)生,油茶品質(zhì)下降。本研究以德宏州梁河縣健康植株和根腐病發(fā)病植株根系和根際土壤為研究材料,探究根腐病的發(fā)生與AMF群落的關(guān)系,為充分挖掘和利用AMF生防、促生功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

樣品于2021年8月27日采自德宏州梁河縣九保鄉(xiāng)丙界村(98°19′40″ E,24°48′59″ N,海拔1451 m)。德宏州梁河縣是一個(gè)典型的農(nóng)業(yè)縣,境內(nèi)森林覆蓋率60%,具有豐富的森林資源,屬南亞熱帶季風(fēng)氣候,四季不分明,雨量充沛,立體氣候明顯,日照時(shí)數(shù)長。

研究對象為10年生的白花油茶,品種為德林油B1。根據(jù)油茶地上部分黃化、葉片脫落等癥狀選擇對象,共選取15棵目標(biāo)樹。在距離主干約30～50 cm的東南西北4個(gè)方向須根豐富處,采集油茶根系,輕晃掉附著在根系表面不緊密的土壤,收集剩余附著在根系的土壤,充分混勻,為根際土壤樣品(S);抖落土壤后的二級側(cè)根,為根系樣品(R)。將樣本用干冰保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,放入-80 ℃的冰箱備用。根系分為2份,1份用于分子實(shí)驗(yàn),1份用于AMF侵染率測定;土壤以200目篩網(wǎng)過篩,分為2份,1份用于分子實(shí)驗(yàn);1份用于理化參數(shù)測定。

表1 病害嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)參考方中達(dá)[18]制定的分級標(biāo)準(zhǔn)(表1)計(jì)算。每個(gè)病害等級下采集3份不同油茶植株的根系及根際土壤,充分混合為1個(gè)樣本,最后得到5個(gè)根系樣本和5個(gè)根際土壤樣本,0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級下根系分別命名為HR0、DR1、DR2、DR3、DR4,根際土壤分別命名為HS0、DS1、DS2、DS3、DS4。對采集的根系進(jìn)行表面消毒,用75%乙醇浸泡消毒1 min,再用無菌水沖洗1次,然后用5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min,最后用無菌水沖洗3次,即完成表面消毒[19]。

1.2 油茶根系中AMF的定殖情況觀察及根際土壤中AMF孢子密度檢測

計(jì)算AMF的孢子密度(Spore density),采用濕篩沉淀法分離根際土壤中的AMF孢子,將分離得到的孢子置于立體顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù),以每20 g風(fēng)干土樣中含有的孢子數(shù)表示。

計(jì)算AMF定殖率,采用AMF定殖染色法：先將根樣用無菌水沖洗4～5次;再用90 ℃的10% KOH水浴解離2 h;待自然冷卻后,蒸餾水沖洗4～5次;再放入2% HCl溶液內(nèi)常溫浸泡5～10 min;用蒸餾水將根系清洗干凈,加入0.05%苯胺藍(lán)溶液室溫染色1 h;隨后用脫色液[m(甘油)∶m(乳酸)∶m(蒸餾水)=1∶1∶1]脫色2～3 d后制成玻片。在光學(xué)顯微鏡下觀察,每個(gè)重復(fù)至少檢測30個(gè)根段觀察菌根定殖情況,記錄其定殖率。

菌根真菌定殖率(%)=∑(0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+……+100%×根段數(shù))/觀察總根段數(shù)

1.3 高通量基因組測序方法

根系表面經(jīng)過洗凈消毒后,采用液氮研磨的方法將樣品磨成粉末狀以便提取,采用E.Z.N.A Mag-Bind soil DNA Kit提取試劑盒(OMEGA)進(jìn)行土壤和植物根系DNA提取,2%瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性,DNA樣本濃度采用Qubit3.0熒光定量儀檢測。采用AMV4.5NF(5’-AAGCTCGTAGTTGAATTCG-3’)/AMDGR(5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’)引物對AMF真菌rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用30 μL擴(kuò)增體系,PCR反應(yīng)條件：94 ℃,3 min→(94 ℃,30 s→45 ℃,20 s→65 ℃,30 s)5次循環(huán)→(94 ℃,20 s→55 ℃,20 s→72 ℃,30 s)20次循環(huán)→72 ℃,5 min→10 ℃,∞。第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物,采用30 μL擴(kuò)增體系,PCR反應(yīng)條件：95 ℃,3 min→(94 ℃,20 s→55 ℃,20 s→72 ℃,30 s)5次循環(huán)→72 ℃,5 min→10 ℃,∞。利用Illumina 高通量測序儀測序平臺進(jìn)行測序。PCR擴(kuò)增及測序工作由生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。

1.4 土壤養(yǎng)分檢測

1.5 生物學(xué)信息分析

將二代測序得到的PE讀數(shù)首先按照Overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,區(qū)分樣本后進(jìn)行序列質(zhì)量質(zhì)控和篩選,然后進(jìn)行OTU聚類(ASV去噪)分析和物種分類學(xué)分析。所有序列都可以根據(jù)不同的相似性等級劃分OTUs,通常對97%相似等級的OTUs進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)不同的擴(kuò)增類型,通過相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫對OTU代表序列進(jìn)行分類和分析。最后,在每個(gè)分類級別上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成：界(Kingdom),門(Phylum),綱(Class),目(Order),科(Family),屬(Genus),種(Species)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PE讀數(shù)之間的Overlap關(guān)系,PEAR用于將成對的讀數(shù)合并為一個(gè)序列;使用PRINSEQ在讀取尾部切割質(zhì)量值小于20的堿基,并設(shè)置10 bp窗口,如果窗口中的平均質(zhì)量值低于20,則從窗口中切掉后端堿基,篩選出質(zhì)量控制后的含N序列和短序列,最后篩掉低復(fù)雜度序列。選取具有97% 相似性的OTU分類等級,利用 Mothur 計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的α多樣性指數(shù),利用Excel 2003軟件統(tǒng)計(jì)各分類單元的數(shù)據(jù);Qiime(v1.9.1) 用于計(jì)算β多樣性距離矩陣;用R 語言工具繪制香農(nóng)指數(shù)、維恩圖和PCA分析的稀釋曲線。直方圖繪圖由GraphPad繪制。

表2 不同病情等級根腐病油茶土壤理化性質(zhì)測定

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由表2可知,隨病害等級增加,土壤pH呈升高趨勢,且發(fā)病等級Ⅲ、Ⅳ級與0、Ⅰ、Ⅱ級油茶土壤間的pH存在顯著差異;發(fā)病等級為0級和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級的油茶土壤有機(jī)質(zhì)存在顯著差異,且病害等級隨有機(jī)質(zhì)含量的增加而升高;發(fā)病等級為Ⅲ級和0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ級的油茶土壤速效磷有顯著差異;發(fā)病等級為Ⅳ級和0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的油茶土壤速效鉀有顯著差異;油茶根腐病病害等級隨全氮含量的增加而升高;發(fā)病等級為Ⅲ、Ⅳ和0、Ⅰ、Ⅱ級的油茶土壤全鉀存在顯著差異,且病害等級隨全鉀含量的增加而降低;發(fā)病等級0、Ⅰ與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級間的油茶土壤硝態(tài)氮存在顯著差異;發(fā)病等級Ⅰ、Ⅱ與0、Ⅲ、Ⅳ級間的油茶土壤氨態(tài)氮存在顯著差異。

**表示差異顯著(P<0.05)。下同。** indicates significant differences at the 0.05 level. The same as below.圖1 不同發(fā)病等級油茶的AMF定殖率Fig.1 Total AMF infection rate of C.oleifera with different disease grades

2.2 油茶根系的AMF定殖率及根際土壤孢子密度

在梁河縣5個(gè)發(fā)病等級的油茶根系和根際土壤中均檢測到AMF的存在,不同發(fā)病等級油茶AMF的定殖率和孢子密度存在差異。由圖1可知,病害等級為0級的油茶AMF的定殖率最高,病害等級為Ⅳ級的油茶AMF定殖率最低。由圖2可知,在每20 g病害等級不同的油茶根際風(fēng)干土壤中,AMF孢子密度均在30個(gè)以上,病害等級為0級的油茶AMF的孢子密度最高,病害等級為Ⅳ級的油茶AMF的孢子密度最低,這與油茶根系 AMF 定殖狀況結(jié)果相一致。

2.3 油茶根系以及根際土壤AMF分子多樣性分析

2.3.1 不同病害等級油茶根系及根際土壤AMF測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 對病害等級不同的油茶根系以及根際土壤進(jìn)行高通量分子測序(表3～4),在病健植株的根系中共獲得有效序列212 150個(gè),HR0、DR1、DR2、DR3和DR4的有效序列分別為45 621、43 551、40 267、39 534和43 177,平均長度為216～218 bp。在油茶植株樣本的根際土壤中共獲得有效序列241 631個(gè),HS0、DS1、DS2、DS3和DS4的有效序列分別是49 595、52 158、49 093、41 334和49 451,平均長度為218～224 bp。所有有效序列被劃分成203個(gè)OTU,其中根系的OTU數(shù)量為112,HR0、DR1、DR2、DR3和DR4的OTU數(shù)量分別為47、61、30、21和31;根際土壤中OTU數(shù)量為186,HS0、DS1、DS2、DS3和DS4的OTU數(shù)量分別為99、75、69、69和62。

圖2 不同發(fā)病等級油茶的AMF孢子密度Fig.2 AMF spore density of C.oleifera with different disease grades

表3 植株樣本根系A(chǔ)MF高通量測序數(shù)據(jù)

表4 植株樣本根際土壤AMF高通量測序數(shù)據(jù)

2.3.2 不同病害等級油茶根系及根系土壤AMF稀釋曲線比較分析 稀釋曲線可用于比較不同測序樣品中物種的豐富度,也可用于解釋樣品中測序數(shù)據(jù)的數(shù)量是否足夠以及是否需要添加測試數(shù)據(jù)。由圖3可知,采樣點(diǎn)檢測樣品的稀釋曲線最終趨于穩(wěn)定,表明測序數(shù)據(jù)量足夠大,能夠客觀反映群落的真實(shí)情況,可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。由圖3-A可知,不同病害等級的油茶根系內(nèi)AMF的Shannon指數(shù)HR0>DR1>DR2>DR3>DR4,說明不同病害程度的油茶根系中AMF的多樣性由高到低依次為HR0、DR1、DR2、DR3和DR4,即油茶越健康,根系內(nèi)AMF的多樣性越豐富(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.896),且呈顯著相關(guān)性(P<0.05);由圖3-B可知,不同病害等級的油茶根際土壤中AMF的Shannon指數(shù)HS0>DS4>DS2>DS3>DS1,說明不同病害程度的油茶根際土壤中AMF的多樣性由高到低依次為HS0、DS4、DS2、DS3和DS1,即油茶的發(fā)病程度與土壤中AMF的多樣性無關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.059),這與根系中AMF的多樣性指數(shù)狀況不一致。

圖3 不同病害程度的油茶根系和根際土壤Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.3 Shannon index dilution curves of C.oleifera roots and rhizosphere soil with different disease degrees

2.3.3 不同病害等級油茶根系以及根際土壤 AMF 多樣性比較分析 α多樣性可用來反映物種豐富度及多樣性。由表5可知,油茶根系中：不同病害等級的油茶根系內(nèi)AMF的OTUs、均勻度指數(shù)Ace和豐富度指數(shù)Chao1均是DR1最大,其次是HR0,說明健康和發(fā)病程度為Ⅰ級的油茶根系中AMF的豐度較高。病害等級為Ⅳ(DR4)的Shannon指數(shù)最低,同時(shí)Simpson指數(shù)最高,說明在根系中連續(xù)抽到相同 AMF 物種的概率較高,其 AMF 多樣性較低。而健康油茶(HR0)的Shannon指數(shù)最高,同時(shí)Simpson指數(shù)又是最低,說明在健康根系中連續(xù)抽到相同 AMF 物種的概率較低,其 AMF 多樣性較高,HR0多樣性指數(shù)是DR4的6.26倍。由表6可知,油茶根際土壤中：不同病害等級油茶的根際土壤AMF的OTU、均勻度指數(shù)Ace、豐富度指數(shù)Chao1以及Shannon指數(shù)均是健康油茶(HS0)的最高,說明HS0中AMF的豐富度以及多樣性最高?？赡懿『Πl(fā)生后,會不同程度地降低油茶根系及根際土壤中AMF的豐富度和多樣性。

2.3.4 不同病害等級油茶根系以及根際土壤AMF的OTU分類 韋恩圖可以直觀地展示不同病害等級下油茶根系和根際土壤中 AMF 群落間 OTUs物種組成的共有及差異情況。油茶根系中：5個(gè)病害等級不同的油茶共有112個(gè)OTUs,共享OTU數(shù)4個(gè),HR0、DR1、DR2、DR3和DR4分別有47、61、30、29和31個(gè)OTUs,HR0、DR1、DR2、DR3和DR4特有的OTUs分別為21、18、11、2和7,HR0特有的OTU數(shù)最多,占所有OTUs的18.75%(圖4-A)。油茶根際土壤中：5個(gè)病害等級不同的油茶共有186個(gè)OTUs,共享OTU數(shù)14個(gè),HS0、DS1、DS2、DS3和DS4分別有99、75、69、69和62個(gè)OTUs,HS0、DS1、DS2、DS3和DS4特有的OTU數(shù)分別為23、30、17、10和7,DS1特有的OTU數(shù)最多,占所有OTUs的16.13%(圖4-B)。5個(gè)不同病害等級的根際土壤中共同包含的OTU數(shù)比根系中的多10個(gè)。5個(gè)不同病害等級的根系和根際土壤中共享2個(gè)OTUs,HR0、DR1、DR2、DR4、HS0、DS1、DS2、DS3和DS4特有OTUs分別為1、4、4、5、15、21、12、8和3個(gè),DR3沒有(圖4-C)。

2.3.5 油茶根系以及根際土壤AMF的群落組成 在油茶的根系以及根際土壤中共獲得203個(gè)AMF-OTUs,排除不可歸類的,總共將其劃分為1門1綱4目7科(表7)。在門和綱水平上分別是球囊菌門 (Glomeromycota)和球囊菌綱(Glomeromycetes);在目水平共鑒定4個(gè)目：球囊霉目Glomerales,83.62%)、類球囊霉目(Paraglomerales,10.45%)、多樣孢囊霉目(Diversisporales,3.68%)、原囊霉目(Archaeosporales,1.30%);在科水平,共鑒定出7個(gè)科：球囊霉科(Glomeraceae,83.38%)、近明球囊霉科(Claroideoglomeraceae,0.25%)、巨孢囊霉科(Gigasporaceae,3.00%)、無梗囊霉科(Acaulosporaceae,0.68%)、類球囊霉科(Paraglomerales,0.11%)、雙型囊霉科(Ambisporaceae,0.92%)、原囊霉科(Archaeosporaceae,0.38%);未被注釋到的歸為“Others”。

表5 不同病害等級油茶根系A(chǔ)MF-α多樣性指數(shù)

A：根系;B：根際土壤;C：根系和根際土壤。A： Fibrous roots; B： Rhizosphere soil; C： Root system and rhizosphere soil.圖4 AMF-OTU比較分析Fig.4 Comparison of AMF-OTU

2.3.6 不同病害等級油茶的根系以及根際土壤AMF在屬水平比較分析 將未定名和未分類的AMF歸入“Others”,不同病害等級下油茶根系A(chǔ)MF群落由根孢囊霉屬Rhizophagus、球囊霉屬(Glomus)、雙型囊霉屬(Ambispora)和巨孢囊霉屬(Gigaspor) 4個(gè)屬組成;根際土壤AMF群落由根孢囊霉屬、球囊霉屬、雙型囊霉屬、巨孢囊霉屬和類球囊霉屬(Paraglomus)5個(gè)屬組成。由圖5-A可知,油茶根系中,發(fā)病等級不同的5個(gè)樣本HR0、DR1、DR2、DR3和DR4中分別檢測到4、4、1、1和3個(gè)屬,病害等級為0、Ⅰ的油茶根系中AMF優(yōu)勢屬(豐度>1%)均為根孢囊霉屬(1.35%～11.44%);與健康油茶相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級球囊霉屬豐度分別降低95.9%、98.6%、100%和97.1%,根孢囊霉屬豐度別降低88.2%、100%、100%和100%。由圖5-B可知,油茶根際土壤中：發(fā)病等級不同的5個(gè)樣本HS0、DS1、DS2、DS3和DS4中分別檢測到5、5、4、5和4個(gè)屬,HS0的優(yōu)勢屬為球囊霉屬(1.40%),DS1的優(yōu)勢屬為球囊霉屬(12.40%)和巨孢囊霉屬(3.65%),DS3的優(yōu)勢屬為球囊霉屬(16.05%)和雙型囊霉屬(3.78%),DS4的優(yōu)勢屬為根孢囊霉屬(44.13%)、球囊霉屬(3.38%)、雙型囊霉屬(2.59%)和類球囊霉屬(1.14%);發(fā)病程度最嚴(yán)重的油茶根際土壤(DS4)內(nèi)根孢囊霉屬(Rhizophagus)明顯多于其他病害等級內(nèi)的。此外類球囊霉屬(Paraglomus)只出現(xiàn)在根際土壤中。

圖5 不同病害等級油茶根系以及根際土壤 AMF 在屬水平上聚類樹Fig.5 Cluster tree of AMF in C.oleifera roots and rhizosphere soil of different disease grades at genus level

圖6 不同病害等級油茶根系和根際土壤中AMF的β多樣性的主成分分析(PCA)Fig.6 Principal component analysis (PCA) of AMF β diversity in C.oleifera roots and rhizosphere soil with different disease grades

2.3.7 不同病害等級油茶根系以及根際土壤AMF群落PCA分析 根系和根際土壤主成分分析結(jié)果表明PC1和PC2的累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)96.89%。由圖6可知,不同病害等級的根系和根際土壤存在著一定差異,油茶根系及根際土壤中患病樣品(DR1、DR2、DR3、DR4、DS1、DS2、DS3、DS4)間距離較近,AMF組成較相似,而油茶根系及根際土壤中健康樣本(HR0、HS0)間距離較遠(yuǎn),AMF的組成則存在較大差異,說明病害等級為0級時(shí)AMF的結(jié)構(gòu)與病害等級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的差異較大,患病能改變油茶根際AMF結(jié)構(gòu),使AMF的結(jié)構(gòu)趨于相似。

2.4 AMF群落組成與土壤因子RDA分析

從圖7可知,土壤因子對AMF群落變異的解釋量超過96.89%。第一排序軸解釋群落變化的60.34%,而第二排序軸解釋群落變化的36.55%。對AMF群落影響從大到小的環(huán)境因子是有機(jī)質(zhì)>pH>速效鉀>有效磷。AMF和環(huán)境因子相關(guān)性分析(表8)表明,有機(jī)質(zhì)與均勻度指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān),與AMF定殖率和孢子密度呈極顯著負(fù)相關(guān);全氮與AMF定殖率呈顯著負(fù)相關(guān),與孢子密度呈極顯著負(fù)相關(guān);孢子密度與全鉀呈極顯著正相關(guān),與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān),其余土壤理化性質(zhì)與Ace指數(shù)、AMF定殖率和孢子密度無顯著相關(guān)。所有土壤理化性質(zhì)與Shannon指數(shù) 和Chao指數(shù)無顯著相關(guān)性。

表8 AMF物種多樣性和環(huán)境因子相關(guān)性分析

圖7 不同病害等級油茶根際土壤AMF屬水平群落及土壤理化因子的RDA分析Fig.7 RDA analysis of AMF horizontal community and soil physical and chemical factors in rhizosphere soil of C.oleifera at different disease levels

3 討 論

AMF作為一類有益真菌,在陸地土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。它通過與寄主植物建立穩(wěn)定的互惠菌根共生體,來促進(jìn)植物生長發(fā)育,改善植株生理特性,從而提高植物對非生物脅迫和生物如病蟲害的抗性等[20]。AMF在顯微鏡下難以鑒定區(qū)分,其缺乏明顯的物種特征,因而研究AMF多樣性存在一定的困難[21],同時(shí),傳統(tǒng)分離方法分離AMF孢子的效率低,不能在短時(shí)間內(nèi)獲得全面、大量的孢子信息。而Illumina高通量測序具有高通量和高精度的優(yōu)點(diǎn),可以克服這些方法的局限性,擴(kuò)大對油茶AMF類群的了解。油茶是能與AMF建立共生關(guān)系的作物之一,對油茶根際土壤中AMF群落的研究已有開展,先前的研究表明在油茶根際土壤內(nèi)存在著豐富的AMF資源,如鄧小軍等[22]采用濕篩傾析-蔗糖離心法在湖南省油茶林樣地共分離到3屬8種AMF;林宇嵐等[1]采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)在江西省的5個(gè)油茶品種中獲得4目10科12屬的AMF。本研究利用Illumina高通量測序技術(shù),在健康和患病的油茶根系以及根際土壤中共檢測到203個(gè)AMF-OTUs,屬于4目7科5屬(屬水平將未定名和未分類的AMF歸入“Others”)。

AMF分布受到根際土壤和環(huán)境的影響,本研究發(fā)現(xiàn),無論是健康植株還是患病植株,根際土壤AMF多樣性和豐富度指數(shù)普遍高于根系,這與王化秋等[23]的研究結(jié)果一致。 AMF 定殖率和孢子密度與植物病害的發(fā)病率、病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)[24],當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)可能會影響孢子的密度以及定殖率,本研究發(fā)現(xiàn),隨著病害等級的上升,AMF的定殖率和孢子密度顯著下降,即油茶發(fā)病的情況越嚴(yán)重AMF的定殖率和孢子密度越低,裴妍等[21]也同樣證實(shí)健康煙株AMF的定殖率和孢子密度顯著大于患黑脛病的煙株。本研究發(fā)現(xiàn),油茶根系中,較健康(HR0和DR1)的AMF總OTU數(shù)和特有OTUs大于患病較嚴(yán)重(DR2、DR3和DR4),說明感根腐病會降低油茶根系內(nèi)的OTUs。較為健康(HR0和DR1)的油茶,根系內(nèi)AMF的 Ace、Chao 指數(shù)更高;Shannon指數(shù)隨病害等級的升高而降低,即感病會降低油茶根系 AMF 的多樣性;宋放等[25]同樣也證實(shí)柑橘受黃龍病病原侵染后根系中AMF的物種組成和相對豐度會發(fā)生改變。油茶根際土壤中,隨著病害程度的加重,AMF類群的OTUs呈現(xiàn)出逐級遞減的趨勢,且健康的油茶根際土壤內(nèi)AMF的 Ace、Chao 指數(shù)最高,即患根腐病會降低根際土壤中AMF的豐富度;但Shannon指數(shù)與發(fā)病程度的關(guān)系不明顯,即患病對油茶根際土壤內(nèi)AMF的多樣性影響較弱;呂燕等[26]研究發(fā)現(xiàn),寧夏枸杞根區(qū)土壤 AMF多樣性不受根腐病菌影響,AMF 多樣性變化不明顯,這與本研究結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果可知油茶患病能夠降低根系內(nèi)AMF的多樣性,改變AMF的群落結(jié)構(gòu);油茶患病能夠降低根際土壤內(nèi)AMF的豐度,改變AMF的群落結(jié)構(gòu),但不影響其AMF群落的多樣性。由此推測,根腐病病原菌和AMF在油茶根內(nèi)存在明顯的競爭作用,一方面,AMF菌絲能通過競爭生態(tài)位點(diǎn),來減少病原菌的侵占位點(diǎn),一定程度上抑制病原菌對植物根系的侵染[27];另一方面,AMF通過與病原菌直接的營養(yǎng)競爭,提升寄主抵御病原菌的能力[28]。

AMF孢子可以在沒有寄主的情況下萌發(fā)和生長,但它們的菌絲生長非常有限,必須依賴宿主植物才能完成其生活史[29]。本研究發(fā)現(xiàn),根系中,油茶患根腐病后,球囊霉屬Glomus和根孢囊霉屬Rhizophagus的豐度降低。劉先良等[30]發(fā)現(xiàn)接種根內(nèi)球囊霉(G.intraradices)和摩西球囊霉(G.mosseae)的煙草菌根苗對青枯病的抗性明顯增強(qiáng),李柄霖等[31]發(fā)現(xiàn)接種根內(nèi)根孢囊霉(R.intraradices)可以降低根腐病的發(fā)病率和病害指數(shù),增加相關(guān)防御酶的活性以增強(qiáng)植物對根腐病的抗性,減少根腐病的發(fā)生和危害。表明球囊霉屬和根孢囊霉屬可能會提高植物的抗性,但這兩類AMF類群能否提高油茶對根腐病的抗性還需進(jìn)一步研究。根系招募土壤真菌是具有選擇性的[32],本研究發(fā)現(xiàn),在健康油茶根系內(nèi)豐度最高的根孢囊霉屬,在發(fā)病等級最嚴(yán)重的根際土壤中豐度最高,由此推測,油茶可能在受到病原菌侵染后會向環(huán)境中分泌相關(guān)物質(zhì),招募有益菌。另外,類球囊霉屬(Paraglomus)只在根際土中出現(xiàn),這可能是因?yàn)锳MF對寄主植物的侵染有一定的偏好性。PCA結(jié)果表明,患病會導(dǎo)致AMF的群落發(fā)生改變,根系及根際土壤中的AMF群落組成在受到病原菌侵染后,結(jié)構(gòu)趨于相似,發(fā)病后的油茶AMF群落與健康油茶存在較大差異,這與裴妍等[21]研究結(jié)果一致。

本研究表明,土壤有機(jī)質(zhì)與AMF的Ace指數(shù)、AMF定殖率、孢子密度呈顯著負(fù)相關(guān),盛敏等[33]研究發(fā)現(xiàn)AMF種的豐度和多樣性指數(shù)隨有機(jī)質(zhì)的增加而降低,但劉敏等[34]研究發(fā)現(xiàn),土壤有機(jī)質(zhì)與孢子密度呈正相關(guān),這可能是土壤有機(jī)質(zhì)含量對AMF分布的影響有一個(gè)閾值,當(dāng)土壤有機(jī)質(zhì)含量太高時(shí),肥力過剩,會抑制菌根和AMF生長,導(dǎo)致AMF豐度下降[35]。土壤全氮含量與AMF定殖率和孢子密度呈顯著負(fù)相關(guān)性,低濃度下的氮會促進(jìn)AMF生長,與前人研究結(jié)果一致[36]。此外,有研究表明鉀元素與AMF定殖呈正相關(guān),也有研究發(fā)現(xiàn)根系全鉀含量與AMF群落的多樣性和豐富度呈顯著正相關(guān)[23],本研究發(fā)現(xiàn),全鉀與孢子密度呈極強(qiáng)正相關(guān),這可能因?yàn)锳MF的外生菌絲可以延伸到鉀的虧缺區(qū),吸收利用空間上對植物根系無效的那部分鉀元素使得孢子密度增加。在土壤中,有效養(yǎng)分是植物可以直接吸收和利用的養(yǎng)分形式,與AMF密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),硝態(tài)氮與孢子密度呈顯著負(fù)相關(guān)。裴妍等[21]研究發(fā)現(xiàn)速效氮與根系A(chǔ)MF多樣性指數(shù)間呈負(fù)相關(guān),均證實(shí)了土壤速效養(yǎng)分與AMF的負(fù)相關(guān)性。盡管速效磷通常是調(diào)控AMF定殖植物的主要因素,但是本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)速效磷與AMF的相關(guān)性,推測在一定范圍內(nèi)隨著土壤磷含量的增加,將會促進(jìn)AMF的定殖及生長發(fā)育[37];當(dāng)超過或低于一定范圍時(shí),不利于AMF的生長發(fā)育,AMF的定殖率和多樣性就會減少[38]。

4 結(jié) 論

從不同病害等級的油茶根系和根際土壤來看,根系中AMF多樣性和豐富度指數(shù)低于根際土壤。隨著病害程度的加重,AMF的定殖率與孢子密度下降,即油茶病害的嚴(yán)重程度與定殖率以及孢子密度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。根系內(nèi),隨著油茶病害程度的加重,AMF的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,豐富度以及多樣性下降;根際土壤內(nèi),隨著油茶病害程度的加重,AMF的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,豐富度下降,但多樣性變化不明顯。土壤理化性質(zhì)影響AMF定殖與孢子密度,但不影響AMF的多樣性。本研究為篩選具有拮抗作用的 AMF 菌劑防治油茶病害奠定了理論基礎(chǔ)。