謝文霖,楊 燕,于龍飛,蔣 萍,蔣海峰,羅金洲,余 馬

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010;2.四川菌之味農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司,四川 大邑 611330;3. 四川省煙草公司瀘州市公司敘永分公司,四川 瀘州 646400)

【研究意義】羊肚菌(MorchellaSPP.)屬子囊菌門(mén)(Ascomycota)、盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)、盤(pán)菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。據(jù)Emile[2]報(bào)道,羊肚菌屬在世界范圍內(nèi)廣泛分布,共有28種。卯曉嵐[3]在《中國(guó)蕈菌》中記載已知羊肚菌屬菌物在中國(guó)有10個(gè)種,主要分布在我國(guó)四川、云南、青海、河南、河北、黑龍江、遼寧、寧夏、新疆、江蘇等。羊肚菌不僅具有風(fēng)味獨(dú)特和營(yíng)養(yǎng)豐富的食用品質(zhì),《本草綱目》中記載其具有“甘寒無(wú)毒,益腸胃,化痰利氣”的藥用價(jià)值。因野生羊肚菌資源有限且受破壞十分嚴(yán)重,陸續(xù)在全國(guó)多地開(kāi)展了羊肚菌人工栽培研究。四川具有復(fù)雜多樣的地形地貌、良好的土壤和氣候條件,為羊肚菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供了相對(duì)適宜的環(huán)境。近年來(lái),四川在羊肚菌人工商業(yè)化栽培方面取得了突破性進(jìn)展,種植規(guī)模和市場(chǎng)均居全國(guó)前列[4]。但隨著羊肚菌產(chǎn)區(qū)面積的擴(kuò)大,羊肚菌受到病害的影響加重,在進(jìn)行人工栽培時(shí)羊肚菌絕產(chǎn)絕收時(shí)有發(fā)生[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】?jī)?nèi)生菌(Endophyte)是指部分或全部生活史需生存于宿主組織的一類(lèi)微生物[6],主要包括內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌,其中內(nèi)生細(xì)菌是羊肚菌子實(shí)體中占比最多的微生物?，F(xiàn)代植物內(nèi)生菌的研究起源于對(duì)林木內(nèi)生真菌和禾本科植物內(nèi)生真菌的挖掘[7],邱德有等[8]從云南紅豆杉中分離出可以合成抗癌化合物紫杉醇的內(nèi)生真菌。國(guó)際上常見(jiàn)對(duì)禾本科植物的Epichloid內(nèi)生真菌研究,在我國(guó)則重點(diǎn)圍繞藥用植物內(nèi)生菌的生理活性物質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)上的應(yīng)用性研究[9]。內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主具有中性共生、益生及毒害作用,目前對(duì)羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌的初步鑒定和內(nèi)生真菌的多樣性研究已有相關(guān)報(bào)道[10-11],證實(shí)內(nèi)生菌與羊肚菌之間存在密切的共生關(guān)系,但感病羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)尚未完全發(fā)掘且對(duì)其多樣性研究仍處于初級(jí)階段,因此對(duì)羊肚菌病害發(fā)生的微生物機(jī)制急需研究。張慧等[12]通過(guò)人工合成菌群促進(jìn)了黃芪生長(zhǎng),高振峰等[13]通過(guò)內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選抑制了番茄灰霉病,羊肚菌與其內(nèi)生菌之間存在共生關(guān)系,內(nèi)生菌可以為其提供養(yǎng)分和保護(hù),也為羊肚菌在人工栽培時(shí)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)抗病提供了思路。羊肚菌內(nèi)生菌群與子實(shí)體共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),研究羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌可以了解該生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和功能[1]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)四川感病羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析,從基因組水平評(píng)估感病羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌的豐度、均勻度和多樣性,開(kāi)展感病羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與多樣性的基礎(chǔ)性研究,以期從內(nèi)生菌角度抑制羊肚菌病害發(fā)生?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在揭示感病羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌的分布情況、菌群差異以及相關(guān)代謝功能,為羊肚菌的抗病生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試樣本為羊肚菌(Morchellaesxtelata)新品種六妹羊肚菌,采自四川菌之味農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司大邑羊肚菌種植基地。在種植基地中,以健康子實(shí)體(H組)為對(duì)照,將子實(shí)體污染變色面積占總表面積達(dá)25%、50%、75%、100%的感病子實(shí)體分別劃分為輕度感病(D組)、中度感病(P組)、重度感病(C組)、完全感病(G組)共4組(圖1)。每組設(shè)3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)5株子實(shí)體。每個(gè)重復(fù)內(nèi)羊肚菌子實(shí)體混合裝入無(wú)菌袋中進(jìn)行干冰保存和運(yùn)輸,在實(shí)驗(yàn)室用75%乙醇進(jìn)行子實(shí)體表面消毒,無(wú)菌水沖洗10次,0.1%氯化汞浸泡5 min,再次用無(wú)菌水沖洗,確保充分去除子實(shí)體表面的微生物殘留,快速風(fēng)干子實(shí)體表面,將子實(shí)體置于液氮中磨碎,存儲(chǔ)于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增

對(duì)獲得的羊肚菌子實(shí)體樣品用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取內(nèi)生細(xì)菌總DNA。使用上游引物338(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和下游引物806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對(duì)16S rDNA V3～V4保守區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行熒光定量分析。

1.3 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌高通量測(cè)序分析

采用Illumina公司的Miseq平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行雙端(Paired-end)測(cè)序,測(cè)序F端：AACMGGATTAGATACCCKG,測(cè)序R端：ACGTCATCCCCA CCTTCC,測(cè)序區(qū)域：16S rDNA的V3～V4區(qū)。序列去噪主要通過(guò)DADA2法,序列聚類(lèi)選擇Vsearch法。對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,使用已知數(shù)據(jù)庫(kù)SILVA132作為參考,通過(guò)去噪后的序列獲得有效序列,并通過(guò)去除嵌合體序列得到最終可用的高質(zhì)量序列,功能基因項(xiàng)目默認(rèn)選擇Vsearch法進(jìn)行分析,委托上海派森諾生物信息科技有限公司完成高通量測(cè)序。

H：健株子實(shí)體,未感病;D：子實(shí)體感病表面積25%;P：子實(shí)體感病表面積50%;C：子實(shí)體感病表面積75%;G：子實(shí)體感病表面積100%。H： Healthy fruiting body, no disease; D： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 25%; P： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 50%; C： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 75%; G： The susceptible surface area of the fruiting body reaches 100%.圖1 羊肚菌子實(shí)體污染變色面積Fig.1 Discolored area contaminated by Morchella fruiting body

1.4 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌生物信息學(xué)分析

使用QIIME2(2019.4)軟件和Vsearch(v2.13.4)軟件,分別獲取樣品在門(mén)、綱、目、科、屬5個(gè)分類(lèi)水平上的組成和豐度分布,使用R語(yǔ)言腳本及ggraph、ggplot2包等工具分析樣品總體并繪制熱圖和聚類(lèi)樹(shù)圖,使用PICRUSt2工具進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測(cè)。使用ASV/OTU豐度表制作韋恩圖,根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌在各組間的有無(wú)分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)集合的成員數(shù),對(duì)不同組的羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌界定共有和獨(dú)有的內(nèi)生細(xì)菌,最后進(jìn)行樣品組間群落差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌測(cè)序結(jié)果與質(zhì)量分析

羊肚菌子實(shí)體中的內(nèi)生細(xì)菌總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收純化,回收產(chǎn)物熒光定量后進(jìn)行高通量測(cè)序,對(duì)原始雙端序列進(jìn)行質(zhì)量篩選,獲得羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌的有效序列量及高質(zhì)量序列量(表1)。羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌有效的序列長(zhǎng)度為363～384 bp,其中378 bp的序列最多,占比67.11%,其次為370 bp的序列,占比16.07%。該序列長(zhǎng)度分布與16S rDNA V3～V4區(qū)序列長(zhǎng)度吻合,測(cè)序達(dá)到分析要求且數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠(圖2)。

2.2 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

使用QIIME2軟件進(jìn)行物種分類(lèi)學(xué)注釋和擴(kuò)增子序列變體(Amplicon sequence varian,ASV)表抽平,以100%相似度聚類(lèi)并使用DADA2質(zhì)控后產(chǎn)生去重的序列ASVs,將ASV豐度矩陣文件結(jié)果繪制成圖。對(duì)總樣本組內(nèi)求平均值后,共注釋得到5組ASV數(shù),其中H、C、D、G組的ASV數(shù)目均在250～400,而中度感病的P組ASV數(shù)目最高,達(dá)1591(圖3)。

ASV稀疏曲線可以評(píng)判樣品測(cè)序深度是否足以反映該樣本群落所包含的微生物多樣性。伴隨測(cè)序深度增加,ASV稀疏曲線趨于平緩,表明該測(cè)序結(jié)果已足夠反映樣品所包含的絕大部分微生物,繼續(xù)增加測(cè)序深度無(wú)法檢測(cè)到子實(shí)體中尚未發(fā)現(xiàn)的新ASVs(圖4)。

表1 肚菌子實(shí)體內(nèi)生菌測(cè)序統(tǒng)計(jì)

a：各長(zhǎng)度下的序列數(shù)量,b：各長(zhǎng)度的序列占比分布。a： Number of sequences at each length; b： Proportion distribution of sequences at each length.圖2 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌DNA序列長(zhǎng)度數(shù)量及占比分布Fig.2 DNA sequence length quantity and proportion distribution of endophytic flora in Morchella

Alpha多樣性分析表明,Chao1指數(shù)和可觀測(cè)物種(Observed species)指數(shù)作為表征豐富度的指數(shù)和操作分類(lèi)單元數(shù)相同,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果足夠反映樣品的菌群豐度,且5組(H、D、P、C、G)內(nèi)生菌豐度無(wú)顯著差異(P>0.05),P組Chao1平均指數(shù)為1611,內(nèi)生菌豐富度最大,健康羊肚菌菇體的H組Chao1平均指數(shù)為328,內(nèi)生菌豐富度最小,根據(jù)上述指數(shù)對(duì)組間菌群豐度大小進(jìn)行排序：P組>G組>D組>C組>H組;Shannon指數(shù)和Faith’s PD指數(shù)分別表征多樣性及基于進(jìn)化的多樣性。雖然各組存在羊肚菌感病程度的不同,但2種指數(shù)在羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌組間進(jìn)行差異性分析時(shí),內(nèi)生菌的多樣性并無(wú)顯著差異(P>0.05),羊肚菌菇體半黑的P組shannon平均指數(shù)為6.8,該組樣品內(nèi)生菌菌群多樣性最高,羊肚菌菇體全黑的G組Shannon平均指數(shù)為3.2,該組樣品內(nèi)生菌菌群多樣性最低(圖5)。根據(jù)Shannon指數(shù)對(duì)菌群多樣性高低進(jìn)行排序?yàn)镻組>H組>D組>C組>G組。

圖3 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌ASV劃分和分類(lèi)地位鑒定統(tǒng)計(jì)Fig.3 ASV classification and classification status identification statistics of endophytic flora in Morchella

圖4 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌ASV數(shù)的稀疏曲線Fig.4 Sparse curve of ASV number of endophytic flora in Morchella

圖5 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性相關(guān)指數(shù)Fig.5 Alpha diversity correlation index of endophytic flora in Morchella

由圖6可知,P組樣品曲線最寬,表示物種的組成最豐富;物種組成的均勻程度由曲線的曲度來(lái)反映,P組樣品均勻程度最低,其余4組羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌組成的均勻程度較高。內(nèi)生細(xì)菌菌群均勻度排序?yàn)镠組>C組>D組>G組>P組。

圖6 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌豐度等級(jí)曲線Fig.6 Abundance grade curve of endophytic flora in Morchella

2.3 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌群落組成分析

羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌主要包括3門(mén)7綱10目17科28屬(圖7)。從門(mén)水平來(lái)看,H組未感病羊肚菌的內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類(lèi)于變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),分別占總數(shù)的55.81%和42.57%。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的內(nèi)生細(xì)菌僅在感病羊肚菌子實(shí)體中出現(xiàn),輕度感病的D組和中度感病的P組羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌主要屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria),分別占其所屬組總數(shù)的73.51%和72.29%,其次是擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes),分別占其所屬組總數(shù)的17.50%和25.96%,其中厚壁菌門(mén)的內(nèi)生細(xì)菌在P組羊肚菌子實(shí)體內(nèi)占比最高,占該組總數(shù)的7.50%。重度感病的C組和完全感病的G組羊肚菌的內(nèi)生細(xì)菌主要屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria),分別占其所屬組總數(shù)的96.64%和98.36%。說(shuō)明,變形菌門(mén)在健株子實(shí)體中和擬桿菌門(mén)占比接近,在感病子實(shí)體中隨感病程度加劇而占比升高。擬桿菌門(mén)則呈相反趨勢(shì)。

在綱水平上,H組健株子實(shí)體優(yōu)勢(shì)菌綱主要是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidia),所占比例分別是55.33%和42.57%。芽孢桿菌綱(Bacilli)的內(nèi)生細(xì)菌僅存在于感病程度中度及以上的羊肚菌子實(shí)體中,在重度感病的C組及完全感病的G組羊肚菌子實(shí)體中該綱內(nèi)生細(xì)菌占比分別為2.18%和0.20%,在中度感病的P組中占比最高,為7.49%。從目水平來(lái)看,羊肚菌子實(shí)體在中度感病前,H、D、P 3組內(nèi)生細(xì)菌存在三大類(lèi)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌,主要屬于假單胞菌目(Pseudomonadales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)和β-變形菌目(Betaproteobacteria),重度感病程度以上的羊肚菌子實(shí)體中只存在1種假單胞菌目(Pseudomonadales)的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌,在C組和G組中占比同為95.8%。

從屬水平來(lái)看,H、P、D組的內(nèi)生細(xì)菌大部分屬于假單胞菌屬(Pseudomona),分別占其所屬組總數(shù)的46.92%、47.59%和59.79%,其次是黃桿菌屬(Flavobacterium),分別占其所屬組總數(shù)的41.07%、10.90%和25.92%。P組的內(nèi)生細(xì)菌中還含有相當(dāng)數(shù)量的八疊球菌屬(Sporosarcina)和金黃桿菌屬(Chryseobacterium),占比分別為6.54%和6.13%。C組、G組的內(nèi)生細(xì)菌主要屬于假單胞菌屬(Pseudomona),分別占其所屬組總數(shù)的95.88%和95.79%。說(shuō)明,隨著感病程度的加深,羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌屬的數(shù)量呈先上升后下降趨勢(shì),中度感病時(shí)其群落組成最豐富,在完全感病時(shí)群落組成較單一。

A～E分別表示在門(mén)、綱、目、科、屬水平的群落分布。A to E represent the community distribution at phylum, class, order, family and genus levels, respectively.圖7 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌群落分類(lèi)學(xué)組成和分布Fig.7 Taxonomic composition and distribution of bacterial communities at each level of endophytic morels

2.4 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌群落差異分析

5組樣品間共有的ASV/OTU的個(gè)數(shù)為40,H組健株羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌中獨(dú)有的ASV數(shù)目最小,為369;感病中期的P組獨(dú)有的ASV數(shù)目最大,為3144;完全感病的G組獨(dú)有的ASV數(shù)目次大,為556(圖8)。

對(duì)平均豐度前20位的屬豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖,并根據(jù)樣本組間的相關(guān)性繪制聚類(lèi)樹(shù)。重度感病的D組與完全感病的G組內(nèi)生細(xì)菌群落相關(guān)程度最高,即菌群差異最小。感病中期的P組樣品與其余4組樣品的內(nèi)生細(xì)菌群落均有相關(guān)性,表明該組樣品內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)可能處于調(diào)整轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵期(圖9)。

圖8 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌群落差異分析Fig.8 Differences of endophytic bacterial communities in Morchella

圖9 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌組成Fig.9 Endophytic bacterial composition in Morchella

2.5 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)

PICRUSt2的KEGG預(yù)測(cè)分析中,羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌大部分屬于生物合成功能類(lèi),其中,控制輔酶因子合成以及維生素代謝功能類(lèi)群的相對(duì)豐度最高,價(jià)值為69;其次是同化降解功能類(lèi)群,其中芳香族化合物降解功能類(lèi)群的相對(duì)豐度最高,價(jià)值為43;解毒功能類(lèi)群占比最低,價(jià)值為4,其中包含甲醇轉(zhuǎn)換二氧化碳的功能類(lèi)群,價(jià)值為1(圖10)。

3 討 論

何培新等[14]分離不同發(fā)生地粗柄羊肚菌的內(nèi)生真菌,用常規(guī)形態(tài)學(xué)技術(shù)和ITS序列分析進(jìn)行鑒定,從3處發(fā)生地采集的羊肚菌子實(shí)體中共分離出屬于14個(gè)分類(lèi)單元的16個(gè)內(nèi)生真菌菌株,其中僅1個(gè)菌株(高山被孢霉)屬于接合菌門(mén),其余15個(gè)菌株為子囊菌或無(wú)性型,毛殼菌為3個(gè)發(fā)生地共有的內(nèi)生真菌,Lecanicilliumfungicolavar.aleophilum僅在四川綿陽(yáng)和河南鄭州采集的羊肚菌子實(shí)體中分離到,表明羊肚菌內(nèi)生真菌具有多樣性。在同一生態(tài)位下,真菌和細(xì)菌都與羊肚菌存在共生關(guān)系,兩者的不同功能和多樣性共同維系著羊肚菌子實(shí)體內(nèi)的生態(tài)平衡。沈洪等[15]對(duì)羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行DGGE鑒定,測(cè)序共得到7種內(nèi)生細(xì)菌,主要屬于變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén),DGGE鑒定在一定程度上反映羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),該結(jié)果也與本研究H組健株羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌群落組成吻合。杜曉寧等[16]對(duì)枸杞內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),枸杞中存在的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性,其對(duì)枸杞的病原菌具有一定的抑菌活性。針對(duì)本研究羊肚菌子實(shí)體中存在的內(nèi)生細(xì)菌,下一步應(yīng)分離出可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌以便進(jìn)行后續(xù)的抑菌活性實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)湖榮等[17]對(duì)菌根植物白術(shù)的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S r DNA分析,結(jié)果表明白術(shù)內(nèi)生細(xì)菌中共有11個(gè)屬,假單胞菌屬占優(yōu)勢(shì)地位,其中分離出的菌株大多數(shù)具有固氮和解鉀作用。本研究發(fā)現(xiàn),羊肚菌的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌主要屬于3門(mén)7綱10目20科30屬。在門(mén)水平上豐度最高的是變形菌門(mén),在科水平上豐度較高的是假單胞菌科、黃桿菌科,在屬水平上豐度較高的是假單胞菌屬和黃桿菌屬。本研究表明,不同感病程度的羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌豐富度、多樣性、均勻度雖各有差異,但多樣性指數(shù)差異都未達(dá)到顯著水平,這可能與四川地方性土壤、氣候、溫度等環(huán)境條件和栽培方式相近有關(guān),通過(guò)本研究可初步明確四川羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和感病后內(nèi)生細(xì)菌多樣性的變化。

目前對(duì)內(nèi)生細(xì)菌代謝功能與宿主生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系等的研究較多。內(nèi)生細(xì)菌可固定空氣中的氮[22],產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素[23]、酶[24]等,可直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)能合成細(xì)胞壁裂解酶等物質(zhì)抵抗病菌侵入,間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[18-19]。從茅蒼術(shù)中分離到可產(chǎn)生IAA的內(nèi)生細(xì)菌[20],從中華補(bǔ)血草中分離到產(chǎn)ACC脫氨酶的內(nèi)生細(xì)菌[21],均可促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。本研究對(duì)子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌的基因功能和代謝途徑進(jìn)行初步分析,結(jié)果表明功能類(lèi)群中的生物合成功能在羊肚菌樣品中的相對(duì)豐度最高,其中,芳香族化合物的代謝功能相對(duì)豐度較高,其次是維生素代謝功能類(lèi)群,與抗菌作用有關(guān)的功能類(lèi)群豐度值最小,為今后研究羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物多樣性和生防菌的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。未感病羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生菌群均勻程度最高,表明其內(nèi)生細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)合理,有利于羊肚菌正常的生長(zhǎng)發(fā)育;感病后,羊肚菌子實(shí)體中均出現(xiàn)了厚壁菌門(mén)的內(nèi)生細(xì)菌,表明厚壁菌門(mén)內(nèi)生細(xì)菌起到一定的抗逆作用;中度感病的羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)最高,表明內(nèi)生細(xì)菌菌群趨于飽和,有關(guān)菌群積極參與抗逆過(guò)程但是未能阻止感病程度繼續(xù)加深,可以針對(duì)該組樣品的厚壁菌門(mén)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定,可能獲得羊肚菌抗病菌群;完全感病的羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生菌優(yōu)勢(shì)菌群基本轉(zhuǎn)變?yōu)榧賳伟鷮?多樣性指數(shù)最低,表明羊肚菌被該屬病菌基本侵染且菌群結(jié)構(gòu)單一。功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明,羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌中多數(shù)菌群與生物代謝相關(guān),與生物同化降解功能和解毒功能的相關(guān)性次之。

橫坐標(biāo)為各功能類(lèi)群在樣品內(nèi)的相對(duì)豐度,縱坐標(biāo)為KEGG第二等級(jí)功能類(lèi)群。The abscissa is the relative abundance of functional group, and the ordinate is the KEGG second-level functional group.圖10 羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌基于KEGG功能的豐度分布Fig.10 KEGG secondary distribution of of endophytic flora in Morchella

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)16S rDNA測(cè)序分析明確了羊肚菌健株和感病株其子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成,明確了假單胞菌屬和黃桿菌屬為羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬,在感病程度加重時(shí)假單胞菌屬的內(nèi)生細(xì)菌比例逐漸上升,而黃桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌呈下降趨勢(shì),在健株子實(shí)體中黃桿菌屬與假單胞菌屬細(xì)菌呈同等優(yōu)勢(shì)屬地位。中度感病組多樣性指數(shù)最高,完全感病組多樣性指數(shù)最低,對(duì)羊肚菌子實(shí)體內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬的平衡調(diào)控可能有助于其健康生長(zhǎng)。