李夢瑋,陳曉霞,廖禮彬,李婧怡,張楠楠,石福孫

(1.中國科學院成都生物研究所,成都 610041;2. 中國科學院大學,北京 100049;3. 中國科學院茂縣山地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站,四川 茂縣 623200)

【研究意義】花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)在我國具有廣泛的藥用和經(jīng)濟用途,位于四川省阿壩藏族羌族自治州的茂縣盛產(chǎn)“大紅袍”花椒,因其色澤紅潤、麻香濃郁,是當?shù)刂赂坏闹еa(chǎn)業(yè)。但花椒易受根腐病病害侵襲,造成大批成年椒樹死亡,且危害程度逐年上升,新椒園發(fā)病率為20.00%左右,種植5年以上的花椒發(fā)病率達45.00%以上,嚴重時可使花椒死亡率高達51.51%[1]。花椒根腐病的主要發(fā)病癥狀表現(xiàn)為側(cè)根易發(fā)生病斑,隨著病情加深,根系腐爛,根皮與木質(zhì)部易脫離,嚴重時木質(zhì)部呈黑色,有異臭味,地上枝葉發(fā)育不全、枯黃,果實小,產(chǎn)量下降,并且在已發(fā)病植株的土壤中再次種植健康花椒,根部仍會染病[2-3],不但給農(nóng)民造成不可挽回的損失,也影響花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4],是一項丞待解決的植物病害問題。目前,花椒根腐病的防治主要以農(nóng)業(yè)管理和化學藥劑使用為主,存在費時費力、污染環(huán)境等問題,因此,花椒根腐病的生物防治研究逐漸受到關(guān)注。生物防治技術(shù)具有綠色、環(huán)保、高效等特點,是將有益微生物或有拮抗作用的代謝物運用到防治病害中的一種方法。本研究圍繞花椒根腐病的生物防治,通過叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)真菌聯(lián)合拮抗菌對花椒根腐病的盆栽防效試驗,明確AM真菌和拮抗菌對花椒根腐病的防治效果,對預防花椒根腐病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】引發(fā)花椒根腐病的病因復雜。1994年,朱天輝等[5]首次發(fā)現(xiàn)四川漢源花椒根腐病的主要致病菌是腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani),李智敏等[6]、田鳳鳴等[7]和阮釗等[2]將云南昭通、甘肅隴南和陜西鳳的花椒根腐病致病菌也鑒定為腐皮鐮刀菌,發(fā)現(xiàn)此病原菌致病力強,具有頑固性,且能在土壤環(huán)境中長期存活,根腐病也因此成為最難防控的土傳植物病害。目前應用于花椒根腐病生防中的生防菌主要有芽孢桿菌屬、木霉屬菌株等,李姝江等[8]發(fā)現(xiàn),高濃度的蠟樣芽孢桿菌對花椒根腐病有明顯抑制作用,在田間試驗中預防率可達100%;田鳳鳴等[9]發(fā)現(xiàn)2種木霉復配對花椒根腐病病原菌的抑制效果為88%,并且發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌對花椒根腐病病原菌有平板抑制作用。生防菌主要包括真菌、細菌等有益微生物,廣泛分布于自然環(huán)境中,其中青霉菌和枯草芽孢桿菌是常用于植物病害防治的生防菌株。草酸青霉對番茄青枯病病原菌、金線蓮莖腐病病原菌等具有抑制作用[10-11],而枯草芽孢桿菌對水稻稻瘟病[12]、黃瓜白粉病[13]等多種植物病害有預防作用,能顯著降低發(fā)病率。經(jīng)四川省茂縣生態(tài)站實驗室前期從花椒根部及根際土壤中經(jīng)分離、鑒定,獲得對F.solani有抑制作用的1株拮抗真菌草酸青霉(PenicilliumoxalicumHB21-1)和1株拮抗細菌枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisHX11),5 d的平板對峙試驗顯示其抑菌率分別為61.00%和42.34%。AM真菌屬于球囊菌門(Glomeromycota),其作為有益菌能與植物建立互惠共生關(guān)系,以不同方式和途徑影響植物的代謝過程,可增強植株對病原菌的抗逆性,是一類陸生植物中廣泛存在的共生微生物[14-16]。研究發(fā)現(xiàn),摩西球囊霉對洋蔥根腐病有防治作用,并能減少病原菌對洋蔥根系的侵染,提高植株抗病性[17],此后AM真菌對植物病害的影響逐步受到關(guān)注。接偉光等[18]發(fā)現(xiàn),摩西管柄囊霉可抑制大豆根腐病原菌尖孢鐮刀菌在根部的定殖,從而緩解根腐病的發(fā)生;Liu等[19]發(fā)現(xiàn),接種根內(nèi)根孢囊霉的蘆筍,其根腐病病情指數(shù)呈下降趨勢。叢枝菌根真菌不僅對植株根部的營養(yǎng)微環(huán)境有良好的改善作用,還能選擇性地對根部周圍的病原物產(chǎn)生抑制作用,降低病原菌侵染植株的概率,從而降低植株發(fā)病率和死亡率[20]。經(jīng)四川省茂縣生態(tài)站實驗室前期對花椒根際土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)進行分析,發(fā)現(xiàn)異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)在感病、健康土樣中均占比較高,設想其可與花椒建立良好的生態(tài)關(guān)系,易于定殖,所以選用異形根孢囊霉進行后續(xù)試驗。綜上,本研究通過AM真菌、HB21-1和HX11單獨或聯(lián)合進行盆栽試驗處理,進一步探究生防菌對花椒根腐病的防治效果?！颈狙芯壳腥朦c】目前,隨著越來越多有益微生物的開發(fā)和應用,研究者們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)有益菌對植物的防病效果具有協(xié)同作用,有益菌聯(lián)合接種對植物影響的研究越來越受到重視。Tanwar等[21]發(fā)現(xiàn),番茄接種尖孢鐮刀菌后發(fā)病率為70.00%,接種AM真菌摩西管柄囊霉和光壁無梗囊霉后發(fā)病率降為20.00%,2種AM真菌和木霉菌聯(lián)合接種則可完全抑制病害發(fā)生。Mwangi等[22]研究發(fā)現(xiàn),與單獨接種AM真菌混合菌劑或哈茨木霉相比,聯(lián)合接種可將番茄地上生物量提高11.60%～69.70%,2種菌劑聯(lián)合防治植物病害具有明顯的協(xié)同作用。因此,有益菌聯(lián)合防治植物病害成效顯著,能有效降低植物病害發(fā)生率,然而關(guān)于花椒根腐病的聯(lián)合生物防治研究鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以AM真菌、草酸青霉HB21-1和枯草芽孢桿菌HX11為供試菌株,以花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌為靶標菌,通過盆栽防效試驗探究生防菌單獨或聯(lián)合處理對花椒根腐病的防治效果及機制,為花椒根腐病的生物防治及合理利用微生物資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植株為“大紅袍”一年生花椒幼苗,購于四川省阿壩州茂縣五月脆農(nóng)業(yè)科技有限公司。花椒幼苗根部經(jīng)75%酒精浸泡5 min,磷酸鹽溶液浸泡5 min,無菌水反復沖洗后備用。

供試土壤為農(nóng)田土、珍珠巖、蛭石(6∶2∶2)混合基質(zhì),農(nóng)田土過2 mm篩,珍珠巖、蛭石的粒徑分別為2.0～5.0、0.1～0.5 mm,高壓滅菌鍋121 ℃滅菌1 h,滅菌2次,間隔24 h,晾涼后備用。

供試菌株有AM真菌異形根孢囊霉、花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌HO21、拮抗真菌草酸青霉HB21-1、拮抗細菌枯草芽孢桿菌HX11。其中叢枝菌根真菌異形根孢囊霉購于北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所,菌株編號為BGC JX04B,由四川省茂縣生態(tài)站實驗室以三葉草為宿主進行擴繁;花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌HO21由四川省茂縣生態(tài)站實驗室分離于花椒患病根部,鑒定后于4 ℃保存;拮抗真菌草酸青霉HB21-1、拮抗細菌枯草芽孢桿菌HX11分別由四川省茂縣生態(tài)站實驗室前期分離于花椒根系及根際土壤,鑒定后于4 ℃保存。

1.2 供試拮抗菌間相互拮抗性試驗

為避免菌株間的拮抗作用,復配后相互干擾防病效果。將供試菌株HB21-1、HX11菌餅分別接種于PDA培養(yǎng)基兩側(cè),兩菌餅間相距4 cm,于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,每天記錄兩菌落的生長情況,觀察有無抑菌圈以確定是否可以復配組合。

1.3 盆栽試驗

花椒根腐病病原菌腐皮鐮刀菌HO21、拮抗真菌草酸青霉HB21-1孢子懸液的制備[23]：將菌株HO21、HB21-1分別接種至PDB培養(yǎng)液中,經(jīng)28 ℃、120 r/min培養(yǎng)5 d,用無菌水調(diào)整濃度為1×106CFU/mL,備用。

拮抗細菌枯草芽孢桿菌HX11菌懸液的制備：將菌株HX11接種于NA培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d,待長出明顯的單菌落后,用直徑6 mm的打孔器取出菌餅,接種于裝有80 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中,120 r/min條件下,28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,以無菌水稀釋配成含菌量為1×106CFU/mL的菌懸液。

將花椒幼苗栽種至高20 cm,直徑17 cm的塑料盆中,每盆填土量為3 kg。每盆澆灌100 mL植物營養(yǎng)液以保證幼苗生長所需營養(yǎng)。溫室培養(yǎng)條件為夜間20 ℃、白天30 ℃,濕度60%,光周期為13 h光照和11 h黑暗。

AM真菌異形根孢囊霉接種方法[24]：先在塑料盆中加1500 g滅菌土壤基質(zhì),將40 g AM真菌接種劑平鋪;不接種AM真菌處理則添加40 g滅活菌劑,并用3層42號濾紙過濾接種物中的AM真菌,將濾液加入土壤,確保土壤中其他微生物一致,最后覆蓋1500 g無菌土。

緩苗14 d待幼苗發(fā)出綠芽后采用傷根灌注法進行試驗處理,盆栽試驗處理組合和接種量等信息如表1所示,每個處理10盆,重復3次。盆栽試驗進行至60 d時進行病害調(diào)查,分級標準[8]如表2所示,統(tǒng)計花椒幼苗的發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

花椒根腐病病害計算公式：

D=d/T×100%

I=[∑(n×L)/(T×V)]×100

C=(K-S)/k×100%

式中：D為發(fā)病率;d為發(fā)病株數(shù);T為總株數(shù);I為病情指數(shù);n為各級株數(shù);L為級值;V為病害最高級;C為防治效果;K為對照病情指數(shù);S為試驗病情指數(shù)。

1.4 AM真菌侵染率測定

采用染色鏡檢法[25]測定花椒根系AM真菌侵染率。將花椒根系沖洗干凈,剪成1 cm長的根段,裝入20 mL刻度試管,加入10 mL 10% KOH,置于90 ℃水浴鍋中20 min,用蒸餾水漂洗3次。然后將根系浸泡在1 mol/L 鹽酸40 min,再用蒸餾水漂洗3次,裝入試管,加入5 mL 0.05%曲利苯藍染色劑,置于85 ℃水浴鍋中20 min,蒸餾水漂洗3次。將清洗后的根系放置于載玻片,50%甘油封片后鏡檢。在顯微鏡下觀察叢枝及菌絲的侵染情況,每個處理觀察10個根樣,每個根樣觀察5個根段,采用十字交叉法[26]記錄其侵染率。

表1 花椒根腐病盆栽防效試驗處理組合

表2 花椒根腐病病害分級標準

1.5 植株根部防御酶活性的測定

盆栽試驗進行第30、60天時取樣測定花椒幼苗根部防御酶活性。采用愈創(chuàng)木酚法[27]測定過氧化物酶(POD)活性,采用氮蘭四唑(NBT)測定法[27]超氧化物歧化酶(SOD)活性,用宋金秋等[28]的方法檢測苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。

1.6 土壤酶活性的測定

盆栽試驗進行第30、60天時按五點法分別采集不同處理的土樣,過1 mm篩后測定土壤酶活性。采用磷酸苯二鈉比色法[29]測定土壤酸性磷酸酶活性,采用苯酚納比色法[30]測定土壤脲酶活性,采用3,5-二硝基水楊酸比色法[30]測定土壤蔗糖酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2020、Origin 2023對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖,采用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及差異顯著性檢驗(Duncan法,P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌拮抗性測試

如圖1所示,將菌株HB21-1和HX11培養(yǎng)5 d后,可觀察到草酸青霉HB21-1生長范圍擴大,可分布在枯草芽孢桿菌HX11菌落上生長,無抑菌圈出現(xiàn),表明兩菌株間無拮抗作用,可組合作為復合菌處理。

a. 3 d時兩菌株的平板對峙形態(tài); b. 5 d時兩菌株的平板對峙形態(tài)。a. The plate confrontation morphology of the two strains at 3 days; b. Plate confrontation morphology of two strains at 5 days.圖1 菌株HB21-1和HX11的拮抗作用Fig.1 Mutual antagonism of strain HB21-1 and HX11

2.2 生防菌對花椒根腐病的盆栽防治效果

由圖2、表3可知,與對照組(N)相比,經(jīng)腐皮鐮刀菌HO21(F)處理的花椒幼苗長勢瘦小,根系韌皮部脫落腐爛,木質(zhì)部呈褐色,地上部分枝葉枯萎,甚至枯死,發(fā)病率達86.67%(圖2-b)。與病原菌(F)處理相比,AM真菌和拮抗菌處理下的花椒幼苗根尖處有輕微變黑現(xiàn)象,木質(zhì)部生長正常,地上部分無明顯根腐病發(fā)病癥狀。其中,AF處理下部分花椒幼苗根尖處腐爛較嚴重,韌皮部有脫落現(xiàn)象(圖2-d),發(fā)病率為60.00%,病情指數(shù)為50.00。BPF、APF和ABF處理下的花椒幼苗長勢與對照相近,部分根部有輕微腐爛變黑的現(xiàn)象(圖2-e,f,g),發(fā)病率分別為33.33%、40.00%和53.33%。APBF處理下的少數(shù)花椒幼苗根部出現(xiàn)腐爛,大部分根部生長健康,枝葉正常,發(fā)病率最低,為13.33%(圖2-h)。與F組處理相比,AM真菌與拮抗菌單獨或2種接種的組合處理,均能降低花椒幼苗根腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)。但不同處理下的防治效果不同,APBF處理對根腐病的防治效果最顯著,病情指數(shù)相比F組降低57.23%,其次是PBF和APF處理,防治效果分別為62.78%、57.12%。

N： 無菌水; F： 病原菌HO21; BF： 枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; AF： AM真菌+病原菌HO21; PBF： 草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; APF： AM真菌+草酸青霉HB21-1+病原菌HO21; ABF： AM真菌+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; APBF： AM真菌+草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21。N： Sterile water; F： F. solani HO21; BF： B. subtilis HX11+F. solani HO21; AF： AM fungi+F. solani HO21; PBF： P. oxalicum HB21-1+B. subtilis HX11+F. solani HO21; APF： AM fungi+P. oxalicum HB21-1+F. solani HO21; ABF： AM fungi+B. subtilis HX11+F. solani HO21; APBF： AM fungi+P. oxalicum HB21-1+B. subtilis HX11+F. solani HO21.圖2 AM真菌聯(lián)合拮抗菌對花椒根腐病的防治效果Fig.2 Morphology of Z.bungeanum seedlings under different treatments

表3 不同處理下花椒根腐病的盆栽防治效果

2.3 AM真菌對花椒幼苗根系的侵染率

在不接種AM真菌的處理未出現(xiàn)根部菌根侵染,即AM真菌侵染率均為0;在接種AM真菌的處理中,有AM真菌與花椒根系的侵染共生現(xiàn)象,形成菌絲、泡囊等菌根結(jié)構(gòu)(圖3)。AM真菌菌絲可在根系表皮細胞間形成少量的胞間連絲,叢枝結(jié)構(gòu)較少,集中分布在表皮細胞間,泡囊形態(tài)呈圓形、橢圓形等。由圖4可知,單獨接種AM真菌的侵染率最低,為24.89%,而在AM真菌+病原菌接種處理下的侵染率比AM真菌單獨接種高3.55%。APBF組聯(lián)合接種處理下的侵染率顯著高于其他處理,為52.22%。

2.4 不同菌種處理對花椒幼苗根部的防御酶活性的影響

從圖5-a可知,不同時期所有處理下的花椒根部POD酶活性均高于對照(N)。30 d時,在單個菌株的處理中,F組POD酶活性最高,較N、B和A組分別高91.15%、33.67%和14.22%,表明病原菌能刺激花椒根部POD酶活性升高;在多菌株的處理中,APF組POD酶活性最高,較F組高175.63%。60 d時,在單個菌株的處理中,對照(N)的POD酶活性最低;在多菌株的處理中,APF組的POD酶活性仍最高,較F組高355.24%,POD酶活性大小依次為APF>APBF>PBF>ABF>BF>AF。

V： 不規(guī)則泡囊; H： 菌絲。V：Vesicle;H：Hypha.圖3 接種AM真菌的處理下花椒根系菌根形成情況Fig.3 Mycorrhizal formation of Z.bungeanum root under the treatment of AM fungi inoculation

AM真菌; AF： AM真菌+病原菌HO21; APF： AM真菌+草酸青霉HB21-1+病原菌HO21; ABF： AM真菌+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; APBF： AM真菌+草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21。A： AM fungi; AF： AM fungi+F. solani HO21; APF： AM fungi+P. oxalicum HB21-1+F. solani HO21; ABF： AM fungi+B. subtilis HX11+F. solani HO21; APBF： AM fungi+P. oxalicum HB21-1+B. subtilis HX11+F. solani HO21.圖4 接種AM真菌的不同處理下花椒根系菌根侵染率Fig.4 Mycorrhizal infection rate of Z.bungeanum root under different treatments inoculated with AM fungi

由圖5-b可知,隨處理時間推移,F組的SOD酶活性呈顯著下降趨勢。30 d時,所有處理的花椒根部SOD酶活性均高于對照(N),在單個菌株的處理中,B組的SOD酶活性最高,較F組高28.24%;在多菌株的處理中,APBF組的SOD酶活性最高,比F、PBF組分別高0.34、0.05倍。60 d時,所有處理的SOD酶活性都顯著高于F組,在單個菌株處理中,B、A和N組的SOD酶活性較F組分別高294.23%、273.67%和170.90%;在多菌株處理中,ABF的SOD酶活性最高,較F、BF組分別增加4.95、0.68倍,其次是APF、APBF組處理,分別比F組增加4.06、4.04倍。

從圖5-c可知,隨時間推移,有拮抗菌和AM真菌處理下的PAL酶活性呈顯著升高趨勢。30 d時,單個菌株的處理之間無顯著差異,其中F組的PAL酶活性最低;在多菌株的處理中,ABF組的PAL酶最高,比F、BF組分別增加1.26、0.76倍,其次為APF、AF組,分別比F組增加0.93、0.71倍。60 d時,在單個菌株的處理中,F組的PAL酶活性最低;在多菌株的處理中,ABF組的PAL酶最高,比F、BF組分別增加2.86、1.43倍,且與其他處理差異顯著。

2.5 不同菌種處理對土壤酶活性的影響

從圖6-a可知,30 d時,所有處理的土壤酸性磷酸酶活性均高于病原菌(F)處理,在單個菌株的處理中,B組的酸性磷酸酶活性最高,比F組高19.54%;在多菌株處理中,APBF的酸性磷酸酶活性最高,比F組高40.25%。60 d時,在單個菌株處理中,土壤酸性磷酸酶活性大小依次為B組>A組>F組>N組;在多菌株處理中,PBF組的酸性磷酸酶活性最高,比F、PF和BF組分別高102.85%、35.39%和32.25%。

N： 無菌水; F： 病原菌HO21; B： 枯草芽孢桿菌HX11; A： AM真菌; BF： 枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; AF： AM真菌+病原菌HO21; PBF： 草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; APF： AM真菌+草酸青霉HB21-1+病原菌HO21; ABF： AM真菌+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21; APBF： AM真菌+草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11+病原菌HO21.不同小寫字母表示同一時間不同處理間的差異顯著(P<0.05);*表示同一處理不同時間間的差異顯著(P<0.05),下同。N： Sterile water; F： F. solani HO21; B： B. subtilis HX11; A： AM fungi; BF： B. subtilis HX11+F. solani HO21; AF： AM fungi+F. solani HO21; PBF： P. oxalicum HB21-1+B. subtilis HX11+F. solani HO21; APF： AM fungi+P. oxalicum HB21-1+F. solani HO21; ABF： AM fungi+B. subtilis HX11+F. solani HO21; APBF： AM fungi+P. oxalicum HB21-1+B. subtilis HX11+F. solani HO21.Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the same time (P<0.05); *means significant differences between different times of the same treatment (P<0.05). The same as below.圖5 不同處理下的花椒根部防御酶活性變化Fig.5 Changes of defense enzyme activity in Z.bungeanum root treated with different treatments

從圖6-b可知,30 d時,所有處理的土壤蔗糖酶活性均高于對照(N),在單個菌株處理中,F組的蔗糖酶活性最高,較N、P、B和A組分別高229.65%、53.83%、50.97%和66.45%,表明病原菌能提升土壤蔗糖酶活性;在多菌株處理中,土壤蔗糖酶活性大小依次為ABPF組>APF組>ABF組>BF組>AF組>PBF組,其中APBF組的蔗糖酶活性較F組高67.33%。60 d時,單個菌株處理中,N組的蔗糖酶活性最低;在多菌株處理中,ABPF處理的蔗糖酶仍最高,其次為APF、ABF組,分別較F組高90.39%、85.69%和83.15%。

由圖6-c可知,隨處理時間推移,AM真菌處理中土壤脲酶活性均呈顯著上升趨勢。30 d時,單個菌株處理間無顯著差異;多菌株處理中,APBF組的脲酶活性最高,較F、PBF組分別高65.17%、71.47%。60 d時,單個菌株處理中,A組的脲酶活性與其他處理差異顯著,較N和F組高873.96%、766.60%;多菌株處理中,APF組的土壤脲酶活性與APBF組間無顯著差異,且較F組高902.03%、826.11%。ABF組的土壤脲酶活性比BF組高550.66%,APBF組的土壤脲酶活性比PBF組高552.76%。

3 討 論

植物共生微生物在促進作物生長、增強抗逆性等方面發(fā)揮著越來越重要的作用,以多種有益菌、生防菌等微生物組合來控制植物病害已成為當前研究熱點之一。單一的植物共生真菌、細菌難以達到理想的生物防治效果,而將一些有益菌、拮抗菌聯(lián)合接種可協(xié)同發(fā)揮更大的生理生態(tài)效應[31]。在本研究中,AM真菌+草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11對花椒根腐病的防治效果最佳,其次是HB21-1+HX11的聯(lián)合處理。與草酸青霉對花椒根腐病的防治效果[23]對比發(fā)現(xiàn),AM真菌+HB21-1、AM真菌+HX11聯(lián)合處理下的防治效果均高于AM真菌、拮抗菌的單獨處理,表明AM真菌聯(lián)合拮抗菌可發(fā)揮協(xié)同作用,有效降低花椒根腐病的發(fā)病率,提高生物防治效果,這與Eman等[32]的研究結(jié)果一致。

AM真菌與宿主間的親和力決定了其菌根效應是否能較好發(fā)揮,侵染率能夠表明AM真菌對植株根皮層的定殖情況[33]。劉芳潔[34]研究表明,AM真菌摩西球囊霉對紫蘇的侵染率達82.36%,接種AM真菌可顯著提升對紫蘇根腐病的預防效果。本研究表明,接種AM真菌處理下,花椒根系均能形成菌根結(jié)構(gòu)。AM真菌+HB21-1+HX11聯(lián)合處理下的菌根侵染率最高,其次是AM真菌+HB21-1處理。AM真菌單獨處理下的侵染率最低,一定程度上表明病原菌或拮抗菌等外界條件的刺激下,能夠提高AM真菌對花椒根系的侵染能力。本研究表明,AM真菌對花椒根系的侵染率越高,其根腐病發(fā)病率越低,表明叢植菌根真菌能提高花椒對根腐病的抗病性,這與唐燕等[35]的研究結(jié)果一致。但在婁璇[36]的研究中,侵染率高并不能代表防治效果好,不同種類的AM真菌對植物病害的防治效果還受環(huán)境、寄主等其他因素的影響。

經(jīng)AM真菌侵染后,形成菌根的植株可以更迅速對病原菌的入侵產(chǎn)生防御,通過提高植物的防御酶活性,清除因病原菌入侵而形成的氧化逆境,提升植物抗病性[37-39]。Cai等[40]將AM真菌、木霉、枯草芽孢桿菌與熒光假單胞菌復配探究對番茄根腐病的防治效果,發(fā)現(xiàn)4種生防菌聯(lián)合處理下番茄的POD、PAL等酶活性大幅提高。本研究表明,60 d時AM真菌+枯草芽孢桿菌HX11處理的SOD、PAL酶活性最高,AM真菌+草酸青霉HB21-1處理的POD酶活性最高,且隨時間推移植株防御酶活性均呈上升趨勢,表明AM真菌和拮抗菌的單獨、聯(lián)合接種均能誘導植株防御酶活性的升高。本研究還發(fā)現(xiàn),病原菌也能刺激植株SOD、POD酶活性增加,推測可能在病害作用下激發(fā)了花椒免疫防御反應,致使防御酶活性升高,這與張濤等[41]測定的黃萎病病原菌能激發(fā)棉花POD、SOD酶活性的升高,但拮抗菌的添加能誘導植株產(chǎn)生更高的防御酶活的研究結(jié)果一致。

圖6 不同處理花椒土壤酶活性變化Fig.6 Changes of soil enzyme activity of Z.bungeanum under different treatments

土壤酶活性反映土壤肥力的高低,對保持土壤肥力具有重要意義,能反映土壤有機養(yǎng)分轉(zhuǎn)化情況[42]。賈紅梅等[43]研究表明,蔭性球囊霉及一些復合菌種能顯著提高丹參根際土蔗糖酶活性,改善土壤營養(yǎng)條件,促進植株生長。本研究發(fā)現(xiàn),60 d時草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11處理的土壤酸性磷酸酶活性最高,AM真菌+草酸青霉HB21-1處理的土壤脲酶活性最高,且隨時間呈顯著上升趨勢;AM真菌+HB21-1+HX11處理下的土壤蔗糖酶最高,但隨時間呈下降趨勢。綜合來看,AM真菌、枯草芽孢桿菌HX11能促進土壤酸性磷酸酶、脲酶活性隨時間顯著升高,草酸青霉HB21-1能促進土壤蔗糖酶活性顯著升高。添加不同拮抗菌均能不同程度提高土壤酶活性,表明AM真菌聯(lián)合拮抗菌可在一定程度上提高花椒根際土肥力。本研究中,土壤蔗糖酶活性隨時間呈下降趨勢,土壤酶活性變化隨時間推移會出現(xiàn)峰值,但還需進一步監(jiān)測探究,這與姜莉莉等[44]發(fā)現(xiàn)的草酸青霉作用下土壤酶活性變化結(jié)果一致。雖然本研究通過盆栽試驗探究AM真菌聯(lián)合拮抗菌對花椒根腐病的防治效果,并初步分析了防病機理,但所選菌種資源有限,不同組合間菌株的相互作用特點還需進一步深入研究,同時對花椒根腐病的防效還需進行大田試驗進一步探究。

4 結(jié) 論

在生防菌單個或聯(lián)合處理中,AM真菌+HB21-1+HX11 3種菌株的聯(lián)合處理對根腐病的防治效果最好,可達78.89%,其次為HB21-1+HX11 2種拮抗菌聯(lián)合的防效。AM真菌單獨接種處理下的花椒根部侵染率最低,為24.89%;AM真菌+HB21-1+HX11 3種菌株聯(lián)合接種處理下的侵染率最高,為52.22%。與對照(N)相比,添加菌株處理的防御酶和土壤酶活性均有不同程度升高。與病原菌處理(F)相比,隨時間推移,拮抗菌、AM真菌處理的花椒根部POD、SOD和PAL酶活性均呈上升趨勢,且土壤酸性磷酸酶、脲酶活性也呈上升趨勢,土壤蔗糖酶活性稍有下降,但均高于F組,表明AM真菌、HB21-1和HX11能不同程度誘導植株防御酶活性、土壤酶活性的升高。綜上,AM真菌+草酸青霉HB21-1+枯草芽孢桿菌HX11這3種菌株聯(lián)合處理對花椒根腐病有較好的防治效果,該微生物組合具有開發(fā)為有效生防劑的潛力。