何 文,蔡兆琴,陳會鮮,張秀芬,黃珍玲,郭素云,阮麗霞,莫周美

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部龍州熱帶作物科學(xué)觀測綜合實(shí)驗(yàn)站/廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,廣西 龍州 532415)

【研究意義】葛根(PuerariaDC.)為豆科葛屬多年生植物,以其干燥根入藥[1],享有“北參南葛”的稱號[2],具有生津止渴、護(hù)肝、美容豐胸等功效[3-5]。除用于生產(chǎn)藥品、制作成食品外,葛根還能作為飼料[6]和乙醇生產(chǎn)原料[7],具有極大的開發(fā)前景。我國是葛根的起源分布中心,但因葛根資源開采過度和保護(hù)不及時(shí),導(dǎo)致一些擁有優(yōu)良性狀的葛根資源逐漸丟失[8],因此研究葛根種質(zhì)資源多樣性,構(gòu)建其分子身份證,對葛根種質(zhì)資源區(qū)分和精準(zhǔn)鑒定具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】遺傳多樣性代表了生物種群內(nèi)部和種群之間的可遺傳變異,是生物多樣性的重要組成部分和基礎(chǔ)[9]。種質(zhì)資源的遺傳多樣性通常采用表型性狀和分子標(biāo)記進(jìn)行研究[10]。近年來葛根種質(zhì)多樣性研究主要集中于SRAP[11]、RAPD[12-14]、SCoT[15]、SSR[16]等分子標(biāo)記,而葛根遺傳性狀多樣性方面的研究較少[17]。ISSR(Inter-simple sequence repeat)簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記具有操作簡單、可重復(fù)、引物通用性高等優(yōu)點(diǎn),被視為理想的遺傳標(biāo)記方法,廣泛應(yīng)用于椰子[18]、甘蔗[19]、赤蒼藤[20]等作物進(jìn)行遺傳多樣性分析[21]。葛花[22]和袁燦等[23]研究表明利用遺傳性狀和ISSR分子標(biāo)記研究葛根遺傳多樣性具有可行性,但研究中選取的遺傳性狀內(nèi)容較少,因此有必要選取更多代表性遺傳性狀進(jìn)行研究。分子身份證(Molecular ID)是在DNA指紋圖譜的基礎(chǔ)上提出的一種鑒定種質(zhì)資源的方法,即將指紋圖譜進(jìn)行編碼賦值,使每一份種質(zhì)擁有一段特定的字符串,通過字符串對種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分[24],目前已對棉花[25]、茶樹[26]、金針菇[27]等作物構(gòu)建了分子身份證。【本研究切入點(diǎn)】基于遺傳性狀和ISSR分子標(biāo)記的葛根遺傳多樣性研究較少,且未構(gòu)建葛根DNA分子身份證?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過25個(gè)遺傳性狀和ISSR分子標(biāo)記對葛根遺傳多樣性進(jìn)行研究,構(gòu)建葛根DNA分子身份證,為更深入全面地研究葛根種質(zhì)資源多樣性和葛根品種鑒別提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的試驗(yàn)材料共計(jì)21份葛根種質(zhì)資源 (表1),于2018—2019年收集自廣西、安徽、浙江和江西,種植于廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所葛根種質(zhì)資源圃。ISSR引物來源于加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的100條引物(http：//www.biotech.ubc.ca/services/naps/ primers.html.)中的48條,由北京擎科生物科技有限公司合成[20],DL2000 DNA Marker、2×EsTaqMasterMix、6×Glycerol DNA Loading Buffer、Biospin全能型植物基因組DNA提取試劑盒等試劑購于南寧國拓生物科技有限公司,其他生化試劑及引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 供試葛根材料及來源

表2 葛根性狀及其賦值

1.2 試驗(yàn)方法

試供材料于2020—2021年每年4月采用扦插苗統(tǒng)一種植于廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所葛根種植基地,每份材料種植40株,株行距為1.5 m×0.5 m,田間管理按照常規(guī)方法。

1.2.1 遺傳性狀 在葛根生長中期參照表2對完全展開葉片顏色、主莖顏色、嫩莖顏色、嫩莖茸毛顏色等16個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行調(diào)查和賦值;在收獲期測定葛根主莖粗、主莖節(jié)密度、塊根長度、塊根寬度、單株鮮重、塊根干物率、總黃酮含量、葛根素含量和淀粉含量。

1.2.2 DNA提取與檢測 本試驗(yàn)于2021年7月取各種質(zhì)5～8片無病蟲害頂端嫩葉,放入已編號的自封袋后放置于冰盒,帶回實(shí)驗(yàn)室于-40 ℃保存?zhèn)溆?。混合取?用液氮研磨后使用Biospin全能型植物基因組DNA提取試劑盒提取葛根全基因組DNA,取3 μL提取的DNA通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量,用超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop one)檢測DNA濃度和純度,檢測完畢后將合格的DNA稀釋至合適濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),剩余DNA在-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與引物篩選 以表型差異較大的4個(gè)葛根樣本DNA為模板,從48條ISSR引物中篩選出10條擴(kuò)增效果好、背景清晰、多態(tài)性豐富的引物進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增(表3)。PCR擴(kuò)增體系(25.0 μL)：DNA模板2.0 μL,10×Bufer 2.5 μL,Primer-F(0.3 μmol/L) 0.6 μL, Primer-R(0.3 μmol/L) 0.6 μL,4dNTPs(0.25 μmol/L)2.0 μL,MgCl(1.5 mmol/L)2.0 μL,TaqDNA聚合酶(5 μmol/L)0.3 μL,加ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性45 s,55～62 ℃復(fù)性45 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸10 min,于4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠(電壓120 V電泳50 min)進(jìn)行檢測。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存結(jié)果(圖1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對21份葛根種質(zhì)資源描述性遺傳性狀數(shù)據(jù)化(表2),使用Excel 2019和SPSS 20.0軟件進(jìn)行遺傳性狀變異系數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)計(jì)算和Ward法聚類分析。

表3 10對ISSR引物信息

圖1 引物P17在供試材料中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of primer P17 in experimental materials

Shanno-Weaver多樣性指數(shù)計(jì)算公式：

H′=-ΣPi×lnPi

其中Pi為某性狀第i級別內(nèi)材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比,ln為自然對數(shù)。

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳在凝膠某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1,無DNA條帶記為0制作ISSR數(shù)據(jù)矩陣,利用Popgene 1.32計(jì)算等位基因數(shù)(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index,I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity,H′),并按照公式PIC=1-∑Pi2計(jì)算多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content,PIC),其中Pi為當(dāng)前引物第i個(gè)等位基因出現(xiàn)的頻率,用NTsys 2.10 e軟件進(jìn)行非加權(quán)UPGMA聚類分析。利用3對核心引物對各個(gè)種質(zhì)中條帶數(shù)據(jù)按順序進(jìn)行串聯(lián)排列作為分子指紋圖譜,將種質(zhì)資源信息和分子指紋圖譜相結(jié)合,再分別利用條碼生成器(https：//qr-batch.com/barcode.php)和二維碼生成器(https：//cli.im/)構(gòu)建21個(gè)葛根種質(zhì)的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根種質(zhì)資源遺傳性狀多樣性分析

2.1.1 變異和遺傳多樣性分析 如表4所示,葛根種質(zhì)資源遺傳性狀的變異系數(shù)為16.330%～55.714%,平均變異系數(shù)為35.157%,其中成熟葉片花紋變異系數(shù)最大,為55.714%,其次為頂生小葉裂缺、主莖顏色、頂生小葉形狀、淀粉含量、塊根寬、塊根長,變異系數(shù)最小的是成熟葉片茸毛顏色,為16.330%。Shannon-Weaver多樣性指數(shù)為0.381～1.844,平均值為1.166,其中主莖粗Shannon-Weaver多樣性指數(shù)最大,為1.844,其次為單株鮮重、頂生小葉葉長、頂生小葉葉寬、塊根長度、主莖節(jié)數(shù)密度、淀粉含量。由此可知,21份葛根種質(zhì)資源在各性狀上表現(xiàn)出不同程度的遺傳多樣性。

表4 21份葛根種質(zhì)資源遺傳性狀的變異系數(shù)及遺傳多樣性分析

2.1.2 葛根種質(zhì)資源聚類分析 采用Ward法對葛根種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析,由圖2可知,遺傳距離為15時(shí),21份供試材料可以分為3類,第I類包含6份材料,對比性狀數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)第I類材料頂生小葉深裂缺,頂生小葉長寬小、主莖節(jié)數(shù)密度大、塊根短粗,葛根素含量低,且可以自然開花。第II類包含4份材料,表現(xiàn)為主莖粗,單株產(chǎn)量高,塊根粗,淀粉含量高。第III類包含11份材料,表現(xiàn)為主莖細(xì),單株產(chǎn)量低,塊根細(xì)長。

2.2 ISSR多樣性分析

2.2.1 ISSR標(biāo)記多態(tài)性分析 利用篩選出來的10條ISSR引物從21份葛根種質(zhì)資源中擴(kuò)增出77條條帶(表5),其中多態(tài)性條帶62條,平均多態(tài)性比率為80.52%;每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為5～10條,平均7.7條,多態(tài)性條帶數(shù)為2～10條,平均每條引物可擴(kuò)增出6.2條多態(tài)性條帶,多態(tài)性比率為40.00%～100.00%;PIC、Na、Ne、H′、I分別為0.7043～0.8468、1.4000～2.0000、1.1135～1.4741、0.0776～0.2999、0.1276～0.4720,其平均值分別為0.7800、1.7830、1.3514、0.2160、0.3353。說明篩選出的10條ISSR引物對供試材料的多態(tài)性檢測效率較高,適合用于葛根種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

圖2 基于21份葛根種質(zhì)資源遺傳性狀的聚類分析Fig.2 Cluster dendrogram based on characters of 21 Pueraria DC. germplasms resources

2.2.2 遺傳距離及聚類分析 用Popgene軟件計(jì)算21份葛根種質(zhì)資源間的遺傳距離,結(jié)果表明供試材料間的遺傳距離為0.035～0.541,平均為0.2442,變幅為0.506。其中廣西融安的G5和江西贛州的G18親緣關(guān)系最遠(yuǎn),遺傳距離為0.541,廣西梧州的G8和G9親緣關(guān)系最近,遺傳距離為0.035。

按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖3)。21份葛根種質(zhì)資源在遺傳距離0.32時(shí)可分成3類材料(I、II、III),其中I類材料包含1份來自江西贛州的種質(zhì)G18;II類材料包含來自廣西融安的種質(zhì)G21和安徽宜城的種質(zhì)G19;III類材料包含剩余18份種質(zhì)。

2.2.3 引物鑒定效率及種質(zhì)特異性分析 10對ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果顯示(表6),有17個(gè)葛根種質(zhì)具有至少1個(gè)特有基因型,僅用1對引物便可區(qū)分開,其中G1、G2、G11和G14具有1個(gè)特有基因,G18具有9個(gè)特有基因型,G3、G7、G8和G15無特有基因型,需要不同引物條帶組合才能鑒定。單對引物P17的鑒定效率最高,可區(qū)分10個(gè)葛根種質(zhì)(鑒定效率47.6%),其次是P14(鑒別效率38.1%),P19(鑒定效率4.8%)僅能鑒定出G1。

表5 ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息

圖3 基于ISSR標(biāo)記的21份葛根種質(zhì) UPGMA 樹狀圖Fig.3 UPGMA tree map of 21 Pueraria DC.germplasms based on ISSR markers

2.2.4 核心引物篩選、分子指紋圖譜和分子身份證構(gòu)建 10對引物在葛根種質(zhì)中多態(tài)性位點(diǎn)的PIC值為0.7043～0.8468,表現(xiàn)出較高多態(tài)性,其中P17的PIC最高(0.8468),其次為P42(0.8327)和P6(0.8197)。按照ISSR標(biāo)記PIC值由大到小的順序,逐個(gè)增加ISSR引物對葛根種質(zhì)進(jìn)行鑒定(表7),發(fā)現(xiàn)最少可使用P17、P42和P6等3個(gè)ISSR引物便可實(shí)現(xiàn)參試種質(zhì)資源的有效區(qū)分,適合選為核心引物,構(gòu)建分子指紋圖譜和分子身份證。

表6 單一引物對可鑒定的葛根種質(zhì)

根據(jù)21份葛根種質(zhì)資源在P17、P42和P6引物中的電泳數(shù)據(jù)矩陣,構(gòu)建葛根種質(zhì)資源分子指紋圖譜(圖4)。利用3對核心引物對各個(gè)種質(zhì)中條帶數(shù)據(jù)按順序進(jìn)行串聯(lián)排列作為分子指紋圖譜,將葛根種質(zhì)編號、來源地和分子指紋圖譜字符串等相結(jié)合,運(yùn)用條碼二維碼生成器構(gòu)建 21個(gè)葛根種質(zhì)的分子身份證(表8,圖5)。

表7 逐個(gè)增加ISSR引物對葛根種質(zhì)的區(qū)分

1～10 表示對應(yīng)ISSR標(biāo)記所檢測到的條帶;黑色方塊表示在對應(yīng)位置檢測到目標(biāo)條帶。1-10 represented the bands detected by the corresponding ISSR locus;Black squares indicated that the target band was detected at the corresponding position.圖4 21份葛根種質(zhì)的分子指紋圖譜Fig.4 The fingerprint of 21 Pueraria DC.germplasms

表8 21份葛根種質(zhì)的分子身份證信息

圖5 葛根種質(zhì)G11的字符串、條形碼和二維碼分子身份證及掃碼內(nèi)容示例Fig.5 String,bar code,QR code and scanning content example of Pueraria DC.germplasm G11

3 討 論

3.1 葛根種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

種質(zhì)資源遺傳性狀和分子標(biāo)記是物種遺傳多樣性研究的常用手段[10]。本研究基于25個(gè)遺傳性狀和ISSR分子標(biāo)記探究21份葛根種質(zhì)資源多樣性。通過遺傳性狀變異系數(shù)和多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn),25個(gè)遺傳性狀變異系數(shù)為16.330%～55.714%,低于葛花[22]研究137份葛根材料所得性狀變異系數(shù)17.55%～174.04%;平均變異系數(shù)為35.157%,與袁燦等[23]的2個(gè)定量性狀變幅一致。Shannon-Weaver多樣性指數(shù)平均值為1.166,說明葛根樣本遺傳性狀具有豐富的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)葛根遺傳性狀變異系數(shù)和Shannon-Weaver多樣性指數(shù)變化不完全一致,其中成熟葉片花紋變異系數(shù)最大,遺傳多樣性指數(shù)最小,主莖粗遺傳多樣性指數(shù)最大,變異系數(shù)排名第9,究其原因,一是因?yàn)榄h(huán)境影響會導(dǎo)致遺傳性狀表達(dá)出現(xiàn)差異;其次,2種指標(biāo)反應(yīng)的內(nèi)容不同,變異系數(shù)越高表明性狀的離散程度越大、變異幅度越大,而多樣性指數(shù)越高表明多樣性程度越豐富、種類越多[28],這與謝向譽(yù)等[29]對廣西食用木薯的研究結(jié)論相似。

多態(tài)性是評價(jià)分子標(biāo)記的重要指標(biāo)[30]。尚小紅等[15]采用25條SCoT引物對44份廣西葛根種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,多態(tài)性比率為86.99%;葛花[22]利用22對ISSR引物對137份葛根進(jìn)行擴(kuò)增,多態(tài)性比率為92.05%,而本研究對21份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記分析,平均多態(tài)性比率為80.52%,多態(tài)性水平相對較低,原因可能是前人研究的葛根種質(zhì)資源材料多,分布廣,而本研究材料大部分來自廣西,但是高于吳瀟[31]研究的葛根多樣性水平(多態(tài)性比率為74.55%),說明收集的21份葛根種質(zhì)資源遺傳多樣性仍具有一定豐富度。本研究對21份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記分析,其中PIC平均值為0.7800,Na平均值為1.7830;Ne平均值為1.3514;H′平均值為0.2160;I平均值為0.3353,說明種質(zhì)資源具有較高雜合度,可能與葛根為雌雄異花授粉植物有較大關(guān)聯(lián)。

3.2 葛根種質(zhì)資源聚類分析

本研究對21份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳性狀與分子標(biāo)記聚類分析。通過遺傳性狀與材料收集地理分布比對發(fā)現(xiàn),I類材料均來自廣西區(qū)內(nèi),II類材料和III類材料地理來源無規(guī)律,說明種質(zhì)遺傳性狀與地理來源關(guān)聯(lián)性不強(qiáng),與劉林婭等[32]的研究結(jié)論一致。按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類與材料收集地理位置關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn),部分葛根種質(zhì)與地理位置有一定關(guān)聯(lián),如廣西融安的G5與江西贛州的G18遺傳距離最大(0.541),分別聚合在I和III類,同為廣西梧州的G8和G9遺傳距離最小(0.035)且最早被聚合到III類。通過遺傳性狀和ISSR分子聚類對葛根種質(zhì)資源進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)表型聚類和分子聚類結(jié)果不一致。因此在鑒定種質(zhì)資源時(shí)應(yīng)該聯(lián)合遺傳性狀和分子標(biāo)記,以提高鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。

3.3 葛根種質(zhì)資源分子身份證構(gòu)建

分子身份證是將種質(zhì)分子指紋圖譜抽象化,生成數(shù)字編號、條形碼和二維碼等,是一種現(xiàn)代化的便捷方法[33]。白曉倩等[24]構(gòu)建了55份板栗品種的字符串、條形碼和二維碼3種DNA分子身份證,為板栗品種的識別和鑒定提供了依據(jù);樊曉靜等[26]利用SNP標(biāo)記技術(shù)將DNA指紋圖譜與品種資源基本信息相結(jié)合,構(gòu)建了103份國內(nèi)外不同類型的茶樹品種分子身份證,對茶樹品種資源區(qū)分和精準(zhǔn)鑒定、分子數(shù)據(jù)數(shù)字化具有參考意義;吳仕蔓等[34]采用SSR擴(kuò)增等位基因分子量和結(jié)合圖譜帶型方式構(gòu)建了22份柚類資源分子身份證,為柚類種質(zhì)資源鑒定和保護(hù)提供依據(jù)。目前對葛根種質(zhì)資源DNA分子身份證構(gòu)建的研究較少,本研究利用3對ISSR引物組合構(gòu)建了21份葛根種質(zhì)資源的字符串、條形碼、二維碼共3種DNA分子身份證,為葛根種質(zhì)資源區(qū)分和精準(zhǔn)鑒定及葛根種質(zhì)資源DNA分子身份證的構(gòu)建提供理論參考。

4 結(jié) 論

21份葛根種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性和較高雜合度,可作為今后葛根品種選育基礎(chǔ)材料。聚類分析可將供試葛根種質(zhì)分成3類,部分種質(zhì)與地理來源存在一定關(guān)聯(lián)性,存在不同地域種質(zhì)互相引進(jìn)或交流。篩選出的P6、P17和P42可作為核心引物有效區(qū)分21份葛根種質(zhì)資源,并構(gòu)建分子身份證。