趙許朋,崔 奎,耿苗苗,趙曉朋,劉聲傳,劉 燕

(貴陽(yáng)學(xué)院,貴陽(yáng) 550005)

【研究意義】茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]是山茶科山茶屬多年生常綠灌木或小喬木,在全世界范圍內(nèi)廣泛被種植[1-2],其栽培品種主要包括阿薩姆種(Camelliasinensisvar.assamica)和中國(guó)種(Camelliasinensisvar.sinensis)[3]。中國(guó)是世界上最早栽培和利用茶樹(shù)的國(guó)家,同時(shí)也是世界茶樹(shù)的起源中心[4-5]。由于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值及綠色屬性,茶樹(shù)已經(jīng)成為全世界重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界已經(jīng)有60余個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行商業(yè)種植,其年采摘量在5×106t以上[6]。植物葉綠體基因組具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于解析、高度保守、重組和變異率低等優(yōu)點(diǎn),常應(yīng)用于物種鑒定、DNA條形碼開(kāi)發(fā)及葉綠體基因工程改造等領(lǐng)域,因此研究茶樹(shù)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和功能并將其應(yīng)用于物種鑒定及其葉綠體基因組改造,從而產(chǎn)生品質(zhì)優(yōu)異茶樹(shù)良種,對(duì)提高茶產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益具有現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】貴定鳥(niǎo)王茶主要分布于貴州省貴定縣云霧鎮(zhèn)鳥(niǎo)王村,是貴州省特有珍稀茶樹(shù)品種[7],又稱(chēng)云霧茶[8],也是清朝八大名茶之一,更是貴州省唯一有碑文記載的貢茶[9]。由貴定鳥(niǎo)王茶制作的貴定雪芽近年來(lái)連獲國(guó)際金獎(jiǎng),成為貴州省的三大名茶之一[10-11]。由于其巨大的應(yīng)用價(jià)值和科研價(jià)值,研究者從其次級(jí)代謝產(chǎn)物差異、農(nóng)藝和品質(zhì)性狀[10]、香氣成分、產(chǎn)地土壤養(yǎng)分[7]和理化品質(zhì)[13]等方面開(kāi)展了全面的研究,如王春波等[12]的研究結(jié)果顯示,貴定云霧茶本地種和引進(jìn)種有14種代謝物含量存在顯著差異;王春波等[9]研究發(fā)現(xiàn),貴定鳥(niǎo)王茶共檢出136種香氣成分,其中酯類(lèi)、酸類(lèi)和醇類(lèi)是形成鳥(niǎo)王茶獨(dú)特香氣的主要成分。葉綠體是高等植物細(xì)胞內(nèi)一種半自主性細(xì)胞器,是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所。葉綠體擁有獨(dú)立于核基因組外能夠自我復(fù)制和發(fā)揮功能的基因組,即葉綠體基因組,其能夠編碼光合作用相關(guān)蛋白參與光合作用并完成太陽(yáng)能的固定。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn),高等植物中不同物種葉綠體基因組長(zhǎng)度為120～170 kb,差異較大;葉綠體基因組含有100～120個(gè)基因,主要包括蛋白編碼基因、tRNA和4rRNA基因;高等植物葉綠體基因組通常呈環(huán)狀,是由1個(gè)長(zhǎng)單拷貝區(qū)(Large single copy region,LSC)、1個(gè)短單拷貝區(qū)(Small single copy region,SSC)和2個(gè)反向重復(fù)序列(Inverted repeats region,IRa/IRb)構(gòu)成的典型四分體結(jié)構(gòu)[15];與核基因組和線(xiàn)粒體基因組相比,葉綠體基因組具有序列保守、變異位點(diǎn)豐富、母系遺傳等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育[16]、物種鑒定及多樣性分析[17]、DNA條形碼開(kāi)發(fā)[16]及基因工程改造等領(lǐng)域。近年來(lái),隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及組裝和注釋軟件的更新與開(kāi)發(fā),不斷有植物葉綠體基因組被報(bào)道。Mehmetoglu等[18]分析鷹嘴豆葉綠體基因組并對(duì)其親緣關(guān)系開(kāi)展研究;Gogniashvili等[19]利用葉綠體基因組全序列測(cè)定技術(shù)對(duì)六倍體小麥開(kāi)展遺傳分析;Yu等[20]研究三椏苦的葉綠體基因組發(fā)現(xiàn),三椏苦與花椒和香肉果的親緣關(guān)系最近?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】貴定鳥(niǎo)王茶已有研究多集中在其次級(jí)代謝產(chǎn)物差異、農(nóng)藝和品質(zhì)性狀等方面,鮮見(jiàn)其葉綠體及其特性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以貴定鳥(niǎo)王茶葉片為材料,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝和注釋,并對(duì)其23種近緣植物的葉綠體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,驗(yàn)證其在系統(tǒng)發(fā)育中的位置,以期為該物種遺傳多樣性、種群歷史動(dòng)態(tài)及系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

貴定鳥(niǎo)王茶成熟葉片采自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉種植園。樣品用75%醫(yī)用酒精與無(wú)菌水洗滌處理后保存于-80 ℃的冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體基因組提取 采用改良CTAB法提取貴定鳥(niǎo)王茶葉片總DNA,分別用1.0%瓊脂糖凝膠和Nanodrop檢測(cè)檢測(cè)DNA的完整性和純度(OD260/280比值);超聲波對(duì)合格DNA片段化,然后對(duì)其片段進(jìn)行純化、末端修復(fù)、3′端加A尾、加測(cè)序接頭、構(gòu)建文庫(kù)等流程化操作;最后用Illumina Novaseq平臺(tái)進(jìn)行葉綠體基因組測(cè)序,測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150,并用FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/fastqc)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.2 葉綠體基因組組裝、注釋 測(cè)序結(jié)果采用Fast-Plast(https：//github.com/mrmckain/Fast-Plast)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾、比對(duì)和組裝。首先使用Spades將比對(duì)到葉綠體數(shù)據(jù)庫(kù)的reads進(jìn)行初步組裝,然后用afin對(duì)其進(jìn)行g(shù)ap修補(bǔ);最后依據(jù)葉綠體基因組典型四區(qū)域結(jié)構(gòu)(LSC、IRB、SSC、IRA)確定基因組起始位點(diǎn),完成葉綠體基因組組裝。以Camelliasinensis為近緣物種,使用Geseq(https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)對(duì)組裝葉綠體基因組進(jìn)行功能注釋并繪制圈圖。

1.2.3 密碼子偏好性分析 用EMBOSS explorer(https：//embossgui.sourceforge.net/demo/)對(duì)貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組密碼子偏好性進(jìn)行分析,內(nèi)容包括：相對(duì)同義密碼子使用度(RSCU)、GC平均含量(GCall)、第1～3位密碼子GC含量(GC1、GC2和GC3);使用生信云在線(xiàn)軟件的ENC計(jì)算工具(http：//cloud.genepioneer.com： 9929/#/tool/ alltool/detail/291)計(jì)算CDS有效密碼子數(shù)(Effective number of codons,ENC)含量。

1.2.4 散在重復(fù)序列、SSR位點(diǎn)、IR區(qū)邊界的收縮與擴(kuò)張分析 使用在線(xiàn)軟件REPuter(https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer?id=reputer_manual_manual)對(duì)貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組進(jìn)行散在重復(fù)序列分析,參數(shù)：minimal repeat size=30,hamming distance=3;使用在線(xiàn)軟件MISA(https：//webblast.ipk- gatersleben.de/misa/)對(duì)貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組SSR位點(diǎn)分析,參數(shù)：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)數(shù)、二核苷酸重復(fù)數(shù)、三核苷酸重復(fù)數(shù)和四五六核苷酸重復(fù)數(shù)分別大于等于10、5、4和3個(gè);使用在線(xiàn)軟件IRscope(https：//irscope.shinyapps.io/irapp/)分析比較貴定鳥(niǎo)王茶與鳳凰單樅柚花香(C.sinensiscultivar Youhuaxiang)、信陽(yáng)10號(hào)(C.sinensiscultivar Xinyang 10)、黔茶1號(hào)(C.sinensisvar.sinensis cultivar Qiancha 1)、半天腰(C.sinensiscultivar Bantianyao)、白雞冠(C.sinensiscultivar Baijiguan)、白葉1號(hào)(C.sinensiscultivar Baiye 1)、德宏茶(C.sinensisvar.Dehungensis)、龍井(C.sinensiscultivar Longjing 43)8個(gè)近源物種IR邊界區(qū)的基因類(lèi)型和基因分布情況。

1.2.5 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析 從NCBI上下載山茶科山茶屬信陽(yáng)10號(hào)C.sinensiscultivar Xinyang 10(GenBank accession：MZ1532 37.1)、鳳凰單樅柚花香C.sinensiscultivar Youhuaxiang(GenBank accession：MZ379786)、半天腰C.sinensiscultivar Bantianyao(GenBank accession：MW046255)、黔茶1號(hào)C.sinensisvar.sinensiscultivar Qiancha 1(GenBank accession：MZ043860)、龍井C.sinensiscultivar Longjing 43(GenBank accession：KF562708)、C.sinensis(GenBank accession：KC143082)、德宏茶C.sinensisvar.Dehungensis(GenBank accession：KJ806279.1)、白雞冠C.sinensiscultivar Baijiguan(GenBank accession：MT773373.1)、白葉1號(hào)C.sinensiscultivar Baiye 1(GenBank accession：MN086819.1)、普洱茶C.sinensisvar.assamica(GenBank accession：JQ975030.1)、云抗C.sinensisvar.assamica cultivar Yunkang 10(GenBank accession：MH019307.1)、C.sinensisvar.assamicaisolate25A(GenBank accession：MH394407.1)、金花茶C.petelotii(GenBank accession：KJ806276.1)、小果金花茶C.petelotiivar.microcarpa(GenBank accession：MT157619.1)、安龍瘤果茶C.anlungensisvoucher CANLU20191106(GenBank accession：MN7565 94.1)、瘤果茶C.anlungensis(GenBank accession：OK046127.1)、西南紅山茶C.pitardiivoucher HKAS(GenBank accession：KF156837.1)、滇山茶C.reticulata(GenBank accession：KJ806278.1)、尖連蕊茶C.cuspidatavoucher HKAS(GenBank accession：KF156833.1)、長(zhǎng)管連蕊茶C.elongatavoucher YangSX 5065(GenBank accession：KY406791.1)、大理茶C.taliensis(GenBank accession：JQ975032.1)、C.taliensisvoucher HKAS-7 S.X.Yang3158(GenBank accession：KF156836.1)葉綠體基因組序列,以山茶科石筆木屬貴州石筆木為外類(lèi)群,與GD1-157071一起使用Geneious 9.0.2進(jìn)行序列比對(duì),使用MEGA 7.0采用近鄰法(Bootstrap1000)與山茶屬23個(gè)物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組的序列特征

從圖1和表1看出,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組(cpDNA)全長(zhǎng)157 071 bp,其結(jié)構(gòu)與閩鄂山茶、皺葉瘤果茶和海南山茶的葉綠體結(jié)構(gòu)相似,含有4個(gè)典型區(qū)域,分別為大單拷貝區(qū)(LSC)、2個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IR)和小單拷貝區(qū)(SSC),其長(zhǎng)度依次為86 632、52 092和18 347 bp。貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組共預(yù)測(cè)到138個(gè)基因,其中,非重復(fù)序列基因120個(gè),重復(fù)序列18個(gè),均為雙拷貝基因。在所有基因中,蛋白編碼基因89個(gè)(如atpA、atpB、atpE),rRNA基因8個(gè)(如rrn5、rrn4.5、rrn23),tRNA基因41個(gè)(trnA-FME、trnC-GCA、trnD-GUC)。貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組蛋白編碼基因可分為4類(lèi),光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)71個(gè),自我復(fù)制相關(guān)基因53個(gè),其他蛋白質(zhì)基因6個(gè)和未知功能基因8個(gè)。貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組GC含量為37.29%,AT含量為62.71%。在貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因中,LSC區(qū)覆蓋62個(gè)蛋白編碼基因和24個(gè)tRNA基因,數(shù)量最多;SSC區(qū)覆蓋13個(gè)蛋白編碼基因和1個(gè)tRNA基因,數(shù)量最少。貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組中有18個(gè)基因含有1個(gè)內(nèi)含子,其中編碼蛋白質(zhì)基因12個(gè)。

2.2 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組密碼子的使用

對(duì)貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組蛋白編碼區(qū)(CDS)密碼子使用情況開(kāi)展分析(表2)表明,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因蛋白編碼基因長(zhǎng)度為70 206 bp,占整個(gè)葉綠體基因組長(zhǎng)度的44.71%。蛋白編碼區(qū)基因密碼子共22 995個(gè),其中,編碼亮氨酸密碼子數(shù)量最多,為2375個(gè),占總密碼子個(gè)數(shù)的10.33%;編碼半胱氨酸密碼子數(shù)量最少,僅249個(gè),占總密碼子個(gè)數(shù)的1.08%。相對(duì)同義密碼子(RSCU)≥1的有32個(gè),其中,有29個(gè)密碼子的堿基構(gòu)成以A/U結(jié)尾,其余3個(gè)以G/C結(jié)尾,表明貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組偏愛(ài)以A和U結(jié)尾。貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因密碼子GC的平均含量為GCall=37.38%,第1位、第2位和第3位密碼子GC的含量分別為GC1=45.48%、GC2=37.98%和GC3=28.67%,依次為GC1>GC2>GC3,表明貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組密碼子不同位置堿基GC的含量存在差異,且呈GC1>GC2>GC3分布,亦表明貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體編碼基因偏好以A/U(T)結(jié)尾。83條CDS的ENC值為24.03～55.87,平均為44.65,表明貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組密碼子的使用偏性較弱。

2.3 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因的重復(fù)序列和SSR分析

使用REPuter對(duì)貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組散在重復(fù)序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因含有50條(IR未計(jì)入總數(shù))重復(fù)序列,其中正向重復(fù)21條(F),回文重復(fù)29條(P),重復(fù)序列長(zhǎng)度為30～82 bp,最長(zhǎng)的4個(gè)重復(fù)(82 bp)均位于IR區(qū)ycf2基因上。檢測(cè)到的重復(fù)序列大部分分布于LSC區(qū)和IR區(qū),少部分分布于SSC區(qū)。在設(shè)定的檢測(cè)范圍內(nèi),未檢測(cè)到反向重復(fù)(R)和互補(bǔ)重復(fù)(C)。

表1 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組的注釋信息

表2 貴定鳥(niǎo)王茶氨基酸的相對(duì)同義密碼子(RSCU)

續(xù)表2 Continued table 2

SSR分析(圖2)顯示,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組中共有SSR位點(diǎn)246個(gè),其中50個(gè)分布于IR區(qū),占比20.33%,數(shù)量最少;142個(gè)分布于LSC區(qū),占比57.72%,數(shù)量最多;54個(gè)分布于SSC區(qū),占比21.95%。在所有檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)中,單核苷酸重復(fù)有156個(gè),數(shù)量最多,包含A、G、C、T 4種堿基重復(fù)類(lèi)型,其中A和T堿基組成的SSR共152個(gè),占比95%,表明SSR單核苷酸位點(diǎn)使用有A/T偏好性;雙核苷酸重復(fù)有4個(gè),分別有TA和AT 2種類(lèi)型;三核苷酸重復(fù)有72個(gè),包括AAC、AAG和AAT等31種類(lèi)型;四核苷酸重復(fù)有16個(gè),包括AAAT、AATA和AGAT等12種類(lèi)型;六核苷酸重復(fù)有2個(gè),包括AAAAAG和CTTTTT 2種類(lèi)型。此外,研究結(jié)果顯示,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組SSR位點(diǎn)在基因間隔區(qū)數(shù)量最多,為126個(gè),占比51.22%;其次是在內(nèi)含子中,為94個(gè),占比38.21%;在外顯子中數(shù)量最少,為26個(gè),占比10.57%。

2.4 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組IR邊界區(qū)的收縮與擴(kuò)張

葉綠體基因組IR區(qū)較為保守,然其邊界區(qū)域的收縮與擴(kuò)張卻是常見(jiàn)的進(jìn)化事件,也是導(dǎo)致葉綠體基因組大小發(fā)生變化的重要因素[21]。從圖3看出,貴定鳥(niǎo)王茶與所選8個(gè)茶樹(shù)品種葉綠體基因組邊界區(qū)的基因種類(lèi)、排列和長(zhǎng)度較相似。9個(gè)茶樹(shù)品種IR區(qū)長(zhǎng)度為25 944～26 110 bp,其IR區(qū)邊界區(qū)域基因主要有rps19、rpl2、ycf1、ndhF和trnH。除半天腰、白葉1號(hào)及龍井外,其余6個(gè)茶樹(shù)葉綠體基因組LSC-IRb邊界(JLB)均位于rps19基因內(nèi),且rps19基因分布于IRb區(qū)的長(zhǎng)度均為46 bp,十分保守。在SSC/IRb 邊界(JSB),除龍井外,其余8個(gè)茶樹(shù)葉綠體基因組SSC-IRb邊界(JSB)均位于ycf1基因內(nèi),鳳凰單樅、白雞冠、白葉1號(hào)和德宏茶的ycf1基因跨越JSB向IRb延伸了1068 bp,信陽(yáng)10號(hào)、黔茶1號(hào)、半天腰和貴定鳥(niǎo)王茶的ycf1基因跨越JSB向IRb延伸了1059 bp,較保守。在SSC/IRa邊界(JSA)區(qū),鳳凰單樅、黔茶1號(hào)、半天腰、白雞冠和白葉1號(hào)5個(gè)品種葉綠體基因組存在跨越JSA邊界基因(ycf1),而信陽(yáng)10號(hào)、德宏茶、龍井和貴定鳥(niǎo)王茶4個(gè)品種葉綠體基因組無(wú)跨越JSA邊界基因。在LSC/IRa邊界(JLA),除黔茶1號(hào)、半天腰和白葉1號(hào)外,其余6個(gè)茶樹(shù)品種葉綠體基因組JLA邊界均位于trnH基因內(nèi),且trnH基因分布于IRa區(qū)的長(zhǎng)度均為1 bp,十分保守。綜上所述,9個(gè)茶樹(shù)品種葉綠體基因組基因種類(lèi)、排列和長(zhǎng)度存在IR邊界區(qū)收縮與擴(kuò)張現(xiàn)象。在所選8個(gè)茶樹(shù)品種中,僅有信陽(yáng)10號(hào)與貴定鳥(niǎo)王茶IR區(qū)的4個(gè)邊界區(qū)域收縮與擴(kuò)張情況完全保持一致,其余7個(gè)品種葉綠體基因組IR區(qū)的收縮與擴(kuò)張情況均與貴定鳥(niǎo)王茶存在不同程度的差異。

A：種類(lèi)和數(shù)量;B：4個(gè)區(qū)域分布。A： Types and numbers of SSR in the chloroplast genome of Guiding Niaowang tea; B： Distribution of SSRs in genome,LSC,SSC and IR.圖2 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列種類(lèi)和分布Fig.2 SSR types and distributions in the chloroplast genome of Guiding Niaowang Tea

圖3 貴定鳥(niǎo)王茶與8個(gè)近源物種葉綠體基因組IR邊界圖Fig.3 IR boundary regions of complete chloroplast genomes of Guiding Niaowang tea and eight related species

2.5 貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育

從圖4看出,以貴州石筆木為外類(lèi)群,貴定鳥(niǎo)王茶與山茶屬23個(gè)物種所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由2個(gè)大分支組成,其中,山茶屬的所有物種聚為1支,貴州石筆木單獨(dú)成支。在山茶屬的分支中,貴定鳥(niǎo)王茶、茶及普洱茶聚為1支,金花茶與瘤果茶聚為1支,紅山茶與連蕊茶聚為1支,五柱茶聚為1支,表明貴定鳥(niǎo)王茶與茶和普洱茶的親緣關(guān)系較近,而與金花茶、瘤果茶、紅山茶、連蕊茶及五柱茶較遠(yuǎn)。在貴定鳥(niǎo)王茶、茶與普洱茶分支中,普洱茶單獨(dú)聚為1支,貴定鳥(niǎo)王茶與茶聚為1支,表明貴定鳥(niǎo)王茶與茶的親緣關(guān)系較普洱茶近。在茶與貴定鳥(niǎo)王茶的分支中貴定鳥(niǎo)王茶與信陽(yáng)10號(hào)、鳳凰單樅聚為1支,其中與信陽(yáng)10號(hào)的親緣關(guān)系最近,與IR區(qū)收縮與擴(kuò)張分析的結(jié)果一致。

圖4 24種山茶科植物葉綠體基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 24 chloroplast genomes of Theaceae

3 討 論

葉綠體基因組是獨(dú)立于核基因組外能夠自我復(fù)制和發(fā)揮功能的基因組,具有序列保守、變異位點(diǎn)豐富及母系遺傳等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育、物種鑒定及多樣性分析、DNA條形碼開(kāi)發(fā)及基因工程改造等領(lǐng)域。茶作為一種重要的無(wú)酒精健康飲料,其原料植物茶樹(shù)的葉綠體基因組也是研究者關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。本研究以貴定鳥(niǎo)王茶葉片為材料,測(cè)得其葉綠體基因組長(zhǎng)度為157 071 bp,與NCBI中檢索茶(C.sinensis)葉綠體基因組長(zhǎng)度153 044～157 137 bp保持一致。葉綠體基因組分析結(jié)果表明,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組包含大單拷貝區(qū)(LSC)、2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IR)和小單拷貝區(qū)(SSC) 4個(gè)區(qū)間,LSC區(qū)覆蓋蛋白編碼基因和tRNA 基因數(shù)量最多,SSC區(qū)最少,與Li等[22-23]關(guān)于茶樹(shù)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的研究一致。本研究共預(yù)測(cè)到貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組基因138個(gè),分為光合作用、自我復(fù)制、其他功能和未知功能共4類(lèi),與Li等[24]對(duì)武夷巖茶水仙葉綠體基因組基因功能的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。綜上表明,茶樹(shù)葉綠體基因組整體組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,進(jìn)化速率較慢。

遺傳密碼是識(shí)別和傳遞生物體遺傳信息的載體,在生物遺傳和變異中起著重要作用[25]。研究表明,密碼子偏好性普遍存在,在葉綠體基因組中開(kāi)展密碼子偏好性分析對(duì)于葉綠體基因工程[26]、物種間的親緣關(guān)系及物種的進(jìn)化具有十分重要的作用[24]。密碼子偏好性分析表明,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因蛋白編碼基因占總基因長(zhǎng)度的44.71%,共統(tǒng)計(jì)密碼子22 995個(gè),編碼亮氨酸密碼子數(shù)量最多,而編碼半胱氨酸密碼子數(shù)量最少,與Zhao等[23]對(duì)白花茶葉綠體基因組密碼子分析結(jié)果亮氨酸和半胱氨酸密碼子數(shù)量分別最多和最少,Zhang等[27]對(duì)油茶葉綠體基因組密碼子分析結(jié)果亮氨酸密碼子數(shù)量最多的結(jié)論一致。貴定鳥(niǎo)王茶>1.0的32個(gè)相對(duì)同義密碼子(RSCU)中有29個(gè)密碼子的堿基構(gòu)成以A/U結(jié)尾,Zhao等[23]的研究結(jié)果也顯示,白花茶葉綠體基因組偏愛(ài)以A和U結(jié)尾。同時(shí),本研究對(duì)密碼子第1位、第2位和第3位堿基GC含量GC1>GC2>GC3的研究結(jié)果也顯示,貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體編碼基因偏好以A/U(T)結(jié)尾。綜上表明,茶樹(shù)葉綠體基因組整體密碼子使用偏好性相對(duì)一致,該研究結(jié)果可為茶樹(shù)物種間的進(jìn)化和性狀改良等提供理論依據(jù)。

重復(fù)序列是植物基因組的重要組成部分,在植物基因表達(dá)、遺傳調(diào)控、物種鑒定及群體遺傳多態(tài)性研究中具有重要作用[28]。本研究共檢測(cè)到50條重復(fù)序列,序列長(zhǎng)度為30～82 bp,此結(jié)果與Huang等[29]在13種茶樹(shù)葉綠體基因組分析研究的結(jié)果一致;Huang等[29]研究還發(fā)現(xiàn)正向重復(fù)序列、回文序列及反向重復(fù)序列共3種類(lèi)型,而本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)其正向重復(fù)和回文重復(fù)2種類(lèi)型,表明貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組重復(fù)類(lèi)型豐富度略低于其他茶樹(shù)。

SSR在植物葉綠體基因組中分布廣泛,具有高多態(tài)性,在植物物種鑒定、群體遺傳多態(tài)性和遺傳分析研究中具有重要作用[28-29]。本研究共檢測(cè)到貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組SSR位點(diǎn)246個(gè),高于Gao等[30]與Zhang等[27]的214和51個(gè);然而,貴定鳥(niǎo)王茶單堿基SSR最多,六堿基SSR最少,與Gao等[30]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn),貴定鳥(niǎo)王茶SSR位點(diǎn)在基因間隔區(qū)數(shù)量最多,而在內(nèi)含子和外顯子中數(shù)量較少,與Huang等[29]對(duì)13種茶樹(shù)葉綠體基因組分析的結(jié)果一致。綜上表明,貴定鳥(niǎo)王茶SSR較豐富,能夠?yàn)槠銼SR引物開(kāi)發(fā)及系統(tǒng)發(fā)育研究奠定基礎(chǔ)。

在植物葉綠體基因組中,IR區(qū)邊界區(qū)域的收縮與擴(kuò)張是常見(jiàn)的進(jìn)化事件,也是葉綠體基因組長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)差異的重要原因[24]。IR區(qū)擴(kuò)張和收縮分析結(jié)果表明,雖然貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組基因種類(lèi)、排列和長(zhǎng)度與所選其他8個(gè)品種較相似,然而卻存在IR邊界區(qū)收縮與擴(kuò)張現(xiàn)象,與Huang等[29]的研究結(jié)果茶樹(shù)葉綠體基因組邊界區(qū)存在細(xì)微的差別卻有顯著的擴(kuò)張和收縮現(xiàn)象一致。除信陽(yáng)10號(hào)外,貴定鳥(niǎo)王茶4個(gè)IR邊界區(qū)JLB、JSB、JSA和JLA與其他7個(gè)品種相比,均存在一定程度的擴(kuò)張與收縮,可能也是不同茶樹(shù)品種葉綠體基因組長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)差異性的一個(gè)重要原因[22,24];同時(shí),不同物種之間邊界區(qū)域的擴(kuò)張與收縮也可以為茶樹(shù)分類(lèi)提供參考依據(jù)[31]。

葉綠體基因組常被用于系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定等領(lǐng)域[15,17]。系統(tǒng)分類(lèi)結(jié)果顯示,茶屬物種分為1支,貴州石筆木單獨(dú)成1支,該結(jié)果與Ramwal等[32]的研究結(jié)果一致,表明葉綠體基因組序列能夠作為區(qū)分茶屬與其他屬親緣關(guān)系的分類(lèi)依據(jù)。在所選茶屬物種中,茶樹(shù)和普洱茶分別聚為1支,該結(jié)果與Peng等[33]的研究結(jié)果一致,并且也與傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)結(jié)果保持一致。系統(tǒng)分類(lèi)結(jié)果還表明,貴定鳥(niǎo)王茶與茶親緣關(guān)系最近,其中與信陽(yáng)10號(hào)的親緣關(guān)系最近,與IR區(qū)收縮與擴(kuò)張分析的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因組全長(zhǎng)157 071 bp,包含138個(gè)基因;密碼子中,編碼亮氨酸密碼子數(shù)量最多,編碼半胱氨酸密碼子數(shù)量最少;貴定鳥(niǎo)王茶的SSR較豐富;IR區(qū)邊界的收縮與擴(kuò)張和系統(tǒng)發(fā)育分析均表明,貴定鳥(niǎo)王茶與信陽(yáng)10號(hào)的親緣關(guān)系最近。揭示了貴定鳥(niǎo)王茶葉綠體基因結(jié)構(gòu)及與其他茶樹(shù)進(jìn)化關(guān)系,為該物種遺傳多樣性、種群歷史動(dòng)態(tài)及系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系研究奠定了理論基礎(chǔ)。