徐曉東,張國(guó)斌,李林倩,陳健鑫,于德嘉,董萍萍,殷伊君,郭麗紅,楊紅玉

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,昆明 650214;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,昆明 650201;3.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224;4.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院,云南 曲靖 655011)

【研究意義】轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor, TF)是一類能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域上的順式作用元件特異性互作的蛋白,能調(diào)節(jié)靶基因在特定時(shí)間與空間上表達(dá),為植物生長(zhǎng)發(fā)育以及形態(tài)建成過程中重要的調(diào)控因子,在植物響應(yīng)生物和非生物逆境應(yīng)激反應(yīng)也具有重要作用[1-2]。鋅指蛋白(Zinc-finger protein, ZFP)是真核生物重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,以Zn2+作為結(jié)合中心,在短距離內(nèi)與其他幾種特定的氨基酸鏈螯合,并折疊形成“手指”構(gòu)型的多肽結(jié)構(gòu)蛋白。在經(jīng)典的鋅指結(jié)構(gòu)中,Zn2+作為結(jié)合中心通過疏水作用與重復(fù)的組氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)多種排列組合形成穩(wěn)固的四面體結(jié)構(gòu)[3],根據(jù)His和Cys位置和數(shù)量的不同可分為C2H2、C2HC5、C2HC、C3H、C3HC4等類型?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Indeterminate domain(IDD)家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,這些蛋白包含4個(gè)鋅指(C2H2、C2H2,C2H、C2HC)基序,形成ID domain[4]。對(duì)IDD的研究起源于玉米的ID1,ZmID1調(diào)節(jié)玉米從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向開花轉(zhuǎn)變[5]。隨后在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有16個(gè)IDD家族成員[5],其中,AtIDD1、AtIDD8和AtIDD14參與種子成熟和植物發(fā)育過程的調(diào)控;AtIDD2與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān);AtIDD3、AtIDD6、AtIDD9和IDD10參與根系的發(fā)育;AtIDD4與根系的發(fā)育有關(guān);AtIDD11與葉片極性有關(guān);AtIDD15和AtIDD16參與莖的向重力性、器官形態(tài)發(fā)生的調(diào)控過程[6-12]。研究者對(duì)AtIDD5表達(dá)量下降的突變體idd5進(jìn)行顯微觀察,發(fā)現(xiàn)idd5葉綠體中的淀粉粒不僅形態(tài)發(fā)生改變,而且淀粉粒的數(shù)量也減少,idd5中淀粉合酶 4(Starch synthase 4,SS4)的 mRNA 轉(zhuǎn)錄本明顯下降[13],說明AtIDD5通過正調(diào)控SS4活性參與了糖代謝。Yoshida等[14]認(rèn)為AtIDD5基因可能作為一種DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄支架,與REPRESSOR of ga1-3 (RGA)結(jié)合。RGA蛋白的N端具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域,它含有5個(gè)氨基酸：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、亮氨酸(L)、亮氨酸(L)和丙氨酸(A),被稱為“DELLA蛋白”。形成DELLA/IDD復(fù)合物調(diào)節(jié)其下游靶點(diǎn)SCL3的表達(dá),以調(diào)控GA信號(hào)通路。目前,生物信息學(xué)分析已成為新基因功能研究首選和必用方法,具有方便快捷和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。研究者往往可以從中得到與基因功能有關(guān)的重要信息,初步推測(cè)基因的可能功能,制定出進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究方案。王新亮[15]通過探索蘋果熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factor,Hsf)家族的生物學(xué)信息與功能,預(yù)測(cè)了蘋果Hsf家族成員可能在調(diào)控鹽堿脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。戴晶等[16]利用生物信息學(xué)軟件對(duì)木薯編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子的基因MeDi19-1進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因主要在葉、葉中脈和儲(chǔ)藏根中發(fā)揮調(diào)控作用,其編碼的蛋白在木薯組織中作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)多項(xiàng)生理活動(dòng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期通過構(gòu)建花椰菜花葉病毒強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S與AtIDD5基因融合表達(dá)載體獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,將過量表達(dá)AtIDD5基因的植株種子垂直培養(yǎng)10 d后發(fā)現(xiàn)其根長(zhǎng)與野生型有顯著差異,說明AtIDD5基因可能以負(fù)調(diào)控方式參與植物的根生長(zhǎng)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)方法分析AtIDD5蛋白的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、亞細(xì)胞定位、基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)以及AtIDD5基因的調(diào)控與被調(diào)控基因。為進(jìn)一步研究AtIDD5基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 AtIDD5蛋白理性化性質(zhì)推斷

使用Uniprot分析AtIDD5的CDS(NC_003071.7)序列、氨基酸種類及數(shù)量。使用TMHMM2.0分析蛋白結(jié)構(gòu)域。使用MEGA7.0 進(jìn)行多序列比對(duì)[17],構(gòu)建擬南芥AtIDD5蛋白和其他物種同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。同源蛋白通過NCBI/BLAST進(jìn)行比對(duì),獲得同源性最高的蛋白序列。

1.2 AtIDD5蛋白在植物組織中的表達(dá)

在TAIR(The Arabidopsis Information Resource)網(wǎng)搜尋擬南芥AtIDD5蛋白表達(dá)模式預(yù)測(cè)圖。

1.3 亞細(xì)胞定位

通過在線軟件uniprot對(duì)AtIDD5蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.4 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將蛋白質(zhì)名稱輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析可構(gòu)建出蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò),利用分析功能可得網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),以及GO基因富集等相關(guān)分析結(jié)果。

1.5 啟動(dòng)子順式作用元件分析

擬南芥AtIDD5基因起始密碼子(ATG)前622 bp的啟動(dòng)子序列在TAIR網(wǎng)中下載,使用在線工具 Plant CARE預(yù)測(cè)和分析啟動(dòng)子調(diào)控元件[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtIDD5蛋白理性化性質(zhì)推斷

2.1.1AtIDD5基因的CDS序列分析 從TAIR網(wǎng)下載AtIDD5基因的CDS序列,序列分析表明,擬南芥AtIDD5基因的CDS長(zhǎng)度為1809 bp,經(jīng)ProtParam在線軟件分析得出,AtIDD5蛋白含有602個(gè)氨基酸,根據(jù)所含元素的數(shù)量推算其分子式C1475H2273N469O528S12,分子量為35 408.82,等電點(diǎn)為6.08。由于其不穩(wěn)定指數(shù)為56.63(56.63>40),因此屬于不穩(wěn)定蛋白,N末端為脯氨酸。在所含氨基酸中、絲氨酸(Ser)占比最高為17.5%,其次為甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)等(圖1)。

2.1.2 AtIDD5氨基酸親水性/疏水性預(yù)測(cè)及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 經(jīng)在線軟件Prot Scale分析得出,圖形的高峰值(正值)的區(qū)域表示疏水的區(qū)域,而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。由圖2-A可看出,負(fù)值峰大于正值峰,AtIDD5蛋白表現(xiàn)為親水性。

通過TMHMM2.0軟件對(duì)擬南芥AtIDD5蛋白序列是否存在跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖2-B),結(jié)果顯示,該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于跨膜蛋白。

2.1.3 AtIDD5轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域分析 Uniprot和Prot Param分析顯示,AtIDD5蛋白含有4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),屬于典型的C2H2型轉(zhuǎn)錄因子。其鋅指結(jié)構(gòu)見表1。

圖1 AtIDD5各氨基酸的種類及含量推斷Fig.1 Inference of amino acids types and contents in AtIDD5

A：AtIDD5氨基酸序列的疏水性/親水性預(yù)測(cè);B：AtIDD5蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。A： Prediction of hydrophobicity/hydrophilicity of AtIDD5 sequences; B： Transmembrane domain prediction ofAtIDD5 sequences.圖2 AtIDD5蛋白理性化性質(zhì)推斷Fig.2 Inference of the rationalization properties of the AtIDD5 protein

表1 AtIDD5蛋白鋅指結(jié)構(gòu)

2.1.4 AtIDD5同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 將AtIDD5蛋白序列在NCBI網(wǎng)中進(jìn)行比對(duì)。通過MEGA7構(gòu)建AtIDD5同源蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果氨基酸序列相似度大于60%的其他物種有6個(gè),分別是亞麻芥(Camelinasativa)XP_010496946.1,鹽芥(Eutremasalsugineum)XP_006395814.1,白芥(Sinapisalba)KAF 8047379.1,油菜(Brassicanapus)XP_048596659.1,蘿卜(Raphanussativus)XP_018434643.1,芝麻菜(Erucavesicariasubsp)CAH 8354801.1。利用GeneDOC進(jìn)行同源蛋白序列比對(duì),它們的氨基酸序列有很高的相似度,尤其是在4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)部分(圖3-A)。根據(jù)氨基酸序列的相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3-B)。

2.2 AtIDD5基因表達(dá)模式預(yù)測(cè)圖

TAIR網(wǎng)中AtIDD5(At2g02070)表達(dá)模式預(yù)測(cè)圖表明,AtIDD5基因在莖、葉、花、角果和種子中均有所表達(dá),其中在葉片中的轉(zhuǎn)錄本豐度最高,其次為角果和花(圖4)。表明AtIDD5為組成型表達(dá)基因,預(yù)示著它可能參與葉片、角果和花器官形態(tài)發(fā)育的調(diào)控。

2.3 AtIDD5蛋白的亞細(xì)胞定位

從BAR(The Bio-Analytical Resource for Plant Bio)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索AtIDD5基因,對(duì)AtIDD5蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)AtIDD5蛋白主要定位于細(xì)胞核和葉綠體中,在細(xì)胞核的定位預(yù)測(cè)與其轉(zhuǎn)錄因子的性質(zhì)相符(圖5)。

2.4 AtIDD5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

通過 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析AtIDD5蛋白與其他蛋白互作的網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示互作節(jié)點(diǎn)數(shù)為20(圖6)。以 AtIDD5 為中心存在多個(gè)與之相互作用的蛋白分子。預(yù)測(cè)與AtIDD5直接互作的蛋白約有10個(gè),其分子功能多與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān),這些蛋白大多是高遷移率族蛋白(High mobility group protein, HMG),HMG蛋白在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能及基因表達(dá)調(diào)控過程中均發(fā)揮著重要作用,揭示了AtIDD5 蛋白廣泛參與生物體生長(zhǎng)發(fā)育過程中基因表達(dá)的調(diào)控過程。

2.5 啟動(dòng)子順式作用元件分析

從TAIR網(wǎng)獲得AtIDD5基因的啟動(dòng)子序列,通過Plant CARE在線軟件分析AtIDD5基因啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn),AtIDD5基因啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)622 bp。腺嘌呤(A)占35%、胸腺嘧啶(T)占40%、胞嘧啶(C)占15%、鳥嘌呤(G)占10%。AtIDD5啟動(dòng)子共計(jì)含有12種不同種類的作用元件。其中核心元件TATA-box、CAAT-box數(shù)量最多,這些核心元件通過與上游基因結(jié)合,參與AtIDD5基因的表達(dá)調(diào)控。啟動(dòng)子上還含有光響應(yīng)元件GT1-motif、TCT-motif、G-box以及赤霉素、乙烯、防御響應(yīng)等元件,這些響應(yīng)元件有可能通過光、激素等有關(guān)信號(hào),影響AtIDD5基因的表達(dá),繼而影響AtIDD5蛋白對(duì)靶基因的調(diào)控(表2,圖7)。

A：AtIDD5同源蛋白序列比對(duì);B：AtIDD5系統(tǒng)發(fā)育樹。A： Sequence alignment of AtIDD5 homologous proteins; B： Phylogenetic tree of AtIDD5.圖3 AtIDD5系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Analysis of AtIDD5 phylogenetic tree

圖4 AtIDD5(At2g02070)表達(dá)模式預(yù)測(cè)Fig.4 Precidition of AtIDD5(At2g02070) expression pattern

圖5 AtIDD5蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of AtIDD5 protein

3 討 論

鋅指蛋白最早在非洲爪蛙的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),因其特殊的指狀結(jié)構(gòu)而得名[19],繼第一個(gè)植物特異的C2H2型蛋白 ZPT2-1 (EPF1)在矮牽牛中被發(fā)現(xiàn)后[20],這一類轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育,響應(yīng)各種脅迫[21]。至今為止,分別在重要的農(nóng)作物水稻[22]、煙草[23]、番茄[24]、大豆[25]、小麥[26]和馬鈴薯[27]等植物中檢測(cè)到189、211、118、321、122、79個(gè)C2H2型鋅指蛋白,其中在擬南芥中有176個(gè)C2H2型鋅指蛋白[28]。有研究報(bào)道,AtIDD5基因表達(dá)量顯著下降的突變體idd5植株的葉綠體比野生型的小且薄;葉綠體內(nèi)的淀粉粒長(zhǎng)、寬和數(shù)量均明顯小于野生型[13],預(yù)示AtIDD5蛋白對(duì)葉綠體發(fā)育、淀粉粒的形成起正調(diào)控作用。組織表達(dá)模式預(yù)測(cè)AtIDD5基因在葉片中表達(dá)量最高,且亞細(xì)胞定位于葉綠體中,與其對(duì)葉綠體發(fā)育調(diào)控功能的試驗(yàn)結(jié)果相符。另外,本研究預(yù)測(cè)AtIDD5蛋白位于細(xì)胞核中,與其與SCL3啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控SCL3轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子功能相符。但迄今沒有關(guān)于AtIDD5蛋白定位的試驗(yàn)報(bào)道,相關(guān)試驗(yàn)還需要通過免疫熒光法或融合報(bào)道基因定位法等進(jìn)行研究。本研究通過構(gòu)建花椰菜花葉病毒強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV 35S與AtIDD5基因融合表達(dá)載體,利用花浸法[29]轉(zhuǎn)入野生型擬南芥植株中,獲得了過量表達(dá)植株。AtIDD5基因過表達(dá)種子垂直培養(yǎng)10 d后觀察根生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)根長(zhǎng)明顯短于野生型的根長(zhǎng),說明與調(diào)控葉綠體的發(fā)育不同,AtIDD5蛋白以負(fù)調(diào)控方式參與植物的根生長(zhǎng)。

圖6 AtIDD5互作蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Interaction protein network map of AtIDD5

表2 AtIDD5基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

劉萌萌等[30]利用生物信息軟件對(duì)陸地棉GhSDP1的啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),該基因啟動(dòng)子上含有低溫、鹽、干旱以及光響應(yīng)元件,進(jìn)一步利用qRT-PCR分析GhSDP1基因在棉花幼苗不同脅迫處理下的表達(dá)譜。在低溫處理、NaCl脅迫、15% PEG脅迫后,GhSDP1的表達(dá)量均上調(diào),表明GhSDP1能夠通過自帶的響應(yīng)元件,接收環(huán)境信號(hào)變化,調(diào)整表達(dá)量。本研究對(duì)擬南芥AtIDD5基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子上含有光(GT1-motif、TCT-motif、G-box)響應(yīng)元件、乙烯(ERE)響應(yīng)元件、轉(zhuǎn)錄因子MYB(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)響應(yīng)元件及赤霉素(TATC-box)響應(yīng)元件,說明AtIDD5基因在植物光響應(yīng)、激素及脅迫響應(yīng)中可能行使重要功能。啟動(dòng)子中含有MYB響應(yīng)元件,MYB是真核生物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其成員在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生物質(zhì)代謝、生物及非生物脅迫應(yīng)答等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[31]。因此,AtIDD5基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析可為進(jìn)一步研究AtIDD5上游靶基因提供線索。

圖7 AtIDD5基因啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.7 Analysis of cis-acting elements in the AtIDD5 gene promoter

目前蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)方法較多,包括STRING、ChiPPI[32]、ePlant等。本研究采用STRING蛋白互作分析軟件對(duì)AtIDD5蛋白展開研究,STRING通常只能預(yù)測(cè)正常的蛋白,而對(duì)融合蛋白(Fusion proteins)互作卻很少涉及。STRING和ePlant所得結(jié)果在節(jié)點(diǎn)數(shù)和互作蛋白上存在一定的差異,有待于今后通過酵母雙雜交、煙草瞬時(shí)表達(dá)等相關(guān)分子生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。有研究表明AtIDD5蛋白識(shí)別并結(jié)合SCL3啟動(dòng)子序列5′-AGACAA-3′,從而調(diào)控SCL3的表達(dá),SCL3屬于GRAS家族,是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育[33]和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[34]。本文預(yù)測(cè)與AtIDD5蛋白互作的RCD1屬于一種WWE蛋白,可調(diào)節(jié)脫落酸(ABA)、乙烯(ET)和茉莉酸甲酯(MeJA)反應(yīng)。rcd1突變體植株對(duì)百草枯表現(xiàn)出明顯的抗性,對(duì)臭氧表現(xiàn)出敏感性[35-36]?；プ鞯腤LM2a屬于LIM蛋白,LIM為肌動(dòng)蛋白束家族,在擬南芥中廣泛表達(dá)[37]。與AtIDD5蛋白互作的RPL21a蛋白屬于翻譯蛋白SH3家族,是核糖體的結(jié)構(gòu)成分,其參與轉(zhuǎn)錄翻譯,亞細(xì)胞定位于胞漿核糖體、核糖體、核仁、葉綠體中。組織器官表達(dá)模式顯示RPL21a主要在保衛(wèi)細(xì)胞和幼葉中表達(dá)[38],預(yù)示AtIDD5基因在植株生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。 本研究對(duì)AtIDD5蛋白的功能預(yù)測(cè)分析,為C2H2型轉(zhuǎn)錄因子功能研究增添理論知識(shí),并為植物生長(zhǎng)發(fā)育分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的候選基因。

4 結(jié) 論

擬南芥AtIDD5基因編碼602個(gè)氨基酸,屬于不穩(wěn)定的親水非分泌蛋白,與亞麻芥和鹽芥的進(jìn)化關(guān)系最近,在白芥、油菜、蘿卜和芝麻菜中存在同源基因。表達(dá)模式預(yù)測(cè)顯示AtIDD5為組成型表達(dá)基因,亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核和葉綠體中。蛋白互作分析推定有10個(gè)蛋白為AtIDD5直接互作的候選蛋白。啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析表明AtIDD5中存在光響應(yīng)、激素和脅迫響應(yīng)元件,分析揭示AtIDD5基因廣泛參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫反應(yīng)的調(diào)控。